Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología de Cultivos Celulares

Equipo IV

Vikings
o Mejía Gómez Fernanda Nirvana
o Ramírez Hernández Pamela

4FV1
Práctica I y II
Efecto de los reguladores de crecimiento en un cultivo de callos de zanahoria y
cultivo de células en suspensión
Fecha de entrega: 23 de octubre 2019
 OBJETIVOS

Generales:
 Evaluar la inducción y crecimiento de callos a partir de explantes de cambium de zanahoria
(Daucus carota) al adiciónar reguladores de crecimiento vegetal (auxinas y citocininas) a
diferentes concentraciones.
 Establecer cultivos de células en suspensión en medio MS líquido, a partir de callos de zanahoria
(Daucus carota) para la extracción e identificación cualitativa de B-caroteno.
Específicos:
 Identificar el efecto de la adición de RCV (auxinas y citocininas) en la inducción de callos de
zanahoria.
 Identificar la combinación de RCV que induce la formación de callos en mayor proporción y con
mayor friabilidad sobre los explantes empleados.
 Obtener callos de tamaño y friabilidad adecuados para establecer el cultivo en suspensión.
 Identificar las características en el callo para ser empleado como explante para cultivo en
suspensión.
 Observar el efecto de los RCV adicionados al medio líquido de cultivo sobre la proliferación,
disgregación y diferenciación de las células.
 Extraer y evaluar cualitativamente la producción de B-caroteno a partir del cultivo de células de
zanahoria (Daucus carota) en suspensión
 INTRODUCCIÓN

Un cultivo es el proceso por el cual se trae material vegetal in vivo en un medio de cultivo estéril.
Requiere la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el
propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece activamente (los tejidos
meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir
microorganismos contaminantes.
Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán desde este inicio dependerán de los objetivos
del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente
desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como
tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos. [ CITATION Tra10 \l 2058 ]
Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la
superficie de un gel acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. Ellos
también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para
el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y
un coctel de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos
tejidos particulares.
Es conveniente preparar este medio ambiente nutricional incorporando estos compuestos químicos
dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando este medio de cultivo ya sea
dentro del recipiente para cultivo o en uno separado.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de
luz, pero a intensidades muy bajas, mucho más que la de la luz solar. La acumulación en las plantas
de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio, más que de la
fotosíntesis, de manera que son innecesarios unos altos niveles de luz.
El establecimiento de un callo a partir de un explante se puede dividir en tres etapas de desarrollo;
inducción, división celular y diferenciación. Durante la fase inicial de inducción el metabolismo es
estimulado para que las células se preparen para la división. La duración de esta fase depende de la
condición fisiológica de las células del explante, así como de las condiciones del cultivo; en la fase
de división celular las células de los explantes vuelven a un estado meristemático o de
“desdiferenciación”; la tercera fase consiste en la aparición de la diferenciación celular y la expresión
de ciertas rutas metabólicas que conducen a la formación de productos secundarios.
Se denomina cultivo de células en suspensión a la transferencia de tejido calloso con alta friabilidad
a un medio líquido nutritivo, el cual se encuentra suplementado con RCV, en este se proporcionan
las condiciones físicas y químicas para el crecimiento celular, el cual es sometido a condiciones de
agitación constante, para promover la disgregación celular. Las células vegetales en suspensión
poseen tasas de duplicación lentas, sin embargo, pueden realizar síntesis de productos naturales
con actividades farmacológicas y ser empleados como productos biotecnológicos.
Los diferentes tipos de cultivos vegetales que se han reportado en la bibliografía para la producción
de metabolitos secundarios y/o proteínas recombinantes son el cultivo de órganos o tejidos (brotes,
raíces o pelos radicales), cultivo de células en suspensión y el cultivo de células inmovilizadas.
Las suspensiones celulares consisten de células libres y pequeños agregados celulares en un medio
de cultivo líquido en constante movimiento, siendo esta una de las formas para mantener y propagar
células vegetales, proporcionando un ambiente de cultivo uniforme, eliminando los gradientes de
nutrientes que se presentan en los cultivos en medio sólido y garantizando la disponibilidad de
nutrientes para todas las células, pero a su vez teniendo un relativo bajo control sobre el tamaño de
los agregados celulares.

METODOLOGÍA
Inserten metodología Daf xd
 RESULTADOS
Los resultados obtenidos en la inducción de callos de zanahoria (Daucus carota) a partir de un explante de tejido meristemático
(cambium), empleando reguladores de crecimiento vegetal (RCV).

Para ello, la experimentación fue realizada por siete equipos los cuales emplearon diferentes concentraciones de RCV para analizar
la respuesta de los explantes en la formación de callos y más tarde identificar la friabilidad de estos para realizar un cultivo de
células en suspensión

Tabla 1. Resultados de la semana 1 para inducción de callos

En la tabla se presentan las proporciones de los RCV que fueron empleadas por
cada equipo al establecer la formulación del medio MS, con la finalidad de
identificar y analizar diferentes respuestas en la inducción de callos; Cabe
mencionar que la mayoría de los cultivos de cada equipo presento contaminación
por lo que fue necesario volver a cultivar.

Crecimiento de callos primera semana

Imagen 1. Explantes en la primera semana de cultivo

En esta imagen se puede observar como los explantes lucen a la primera semana
después de haber sido cultivados en un medio solido con una concentración de
ANA 0.05 mg/mL y de BAP 5 mg/mL. El explante tiene un color naranja fuerte con
pequeños callos verdes esponjosos en crecimiento. Los explantes realizados por
el equipo Barbaros y Ninjas también presentaron estas características.

INSERTEN FOTOS DE LA SEMANA 2 Y ASI PLOX

CULTIVO EN SUSPENSIÓN
A partir del cultivo de callos, se estableció un cultivo de células en suspensión la cual tuvo
una duración de dos semanas bajo condiciones de agitación y temperatura, teniendo
como objetivos observar la friabilidad de los callos al considerar el cultivo de su
procedencia, el crecimiento celular y la producción del β-caroteno para su extracción e
identificación mediante una prueba cualitativa (prueba de Liberman-Buchnard).

Tabla 2. Resultados de cultivo en suspensión, semana 1

Equipo Contaminación Observaciones Peso

(g)
Caballeros Si Medio turbio/verde 116.6041
Barbaros No Medio 131.2162
turbio/blanco
Ninjas Si Medio turbio/verde 137.7238
Legionarios No Medio 130.5836
turbio/blanco
Samurai No Medio 132.6843
turbio/blanco
Vikings No Medio 129.6360
turbio/blanco
Spartans No Medio 136.090
turbio/blanco

INSERTEN TABLA DE PESOS 3°SEMANA

Imagen 2. Cultivo de suspensión 1° Semana

Imagen 3. Inclinación de 42° del matraz con callos

de zanahoria (medición de crecimiento de callos
en suspensión 18-09-2019)
Imagen 4. Cultivo de suspensión Imagen 5. Inclinación de 42° del matraz con callos
de zanahoria (medición de crecimiento de callos
3° Semana 02-10-2019 en suspensión 02-10-2019)

Imagen 6. Tinción en fresco del cultivo en suspensión de tres semanas 02-10-2019)

PRUEBA DE LIEBERMANN-BURCHARD
Prueba positiva para conocer la presencia de β-carotenos a partir de un callo
cultivado en MS en suspensión.

Imagen 7. Prueba de Liebermann-Burchard.

 ANALISIS DE RESULTADOS
Crecimiento de callos en cultivo in vitro
Efecto de ANA (ácido naft alenacéti co) y BAP (6-bencilaminopurina) en la inducción
de callos.

Los resultados mostrados en la tabla 1 indican que la mayoría de los equipos

presentaron crecimiento de callo en la primera semana. Presentándose
crecimiento de callos verdes en los explantes realizados por los equipos ninjas,
vikings, y barbaros, esto se debe a la concentración de ANA que se suministró
(observar tabla 1).
En el experimento lo que se buscaba era conseguir un callo friable y que
presentara un buen crecimiento. Se realizó una investigación sobre diferentes
experimentos hechos con callos de zanahoria en las mismas condiciones (o
bastante aproximadas) para conocer qué condiciones se requerían para lograr
esas condiciones en el callo.
Usualmente se induce la formación de callos a partir de explantes en medios que
contengan auxina(s) o una proporción alta de auxina:citocinina. (Roca, W. M. y
Mroginski, L. A., 1991)
Para que la proliferación de callos sea más rápida, el medio puede requerir una
composición ligeramente diferente de la que se usa para la inducción de estos.
Por ejemplo, se logra sub cultivando los callos en un medio que tenga alta relación
citocinina:auxina (Roca, W. M. y Mroginski, L. A., 1991)
Por otro lado Halperin y Jensen (1966) por su parte demostraron que a nivel
celular un cultivo de callos de zanahoria con presencia de 2,4-D tiende a
fragmentarse, mientras que uno en ausencia de esta fitohormona genera
agregados que no se disgregan. Mencionan que el primer efecto está presente
aun cuando se trate de alguna otra auxina, y que el efecto de agregados no-
disgregables puede darse no solo en ausencia de auxinas, sino que también
cuando la concentración de estas es menor a 0.01 mg/L.
El equipo Vikings obtuvo el mejor crecimiento de callo al final. Por lo que fue fácil
disgregarlo además de obtener crecimiento de biomasa significativo (Observar
tabla de la 3° semana) aunque al momento de pesar nuevamente el matraz
presento una disminución importante en el peso, pero esto se pudo deber a la
evaporación de agua que existía en el medio.
CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN PARA LA
OBTENCIÓN DE Β-CAROTENOIDES.
El establecimiento de un cultivo de células en suspensión a partir de fragmentos
de callos depende de la calidad del tejido calloso. Al combinar la calidad del callo y
la velocidad de agitación las células se separan unas de otras con relativa
facilidad. Este aspecto está relacionado con las propiedades de la pared celular,
las cuales pueden ser modificadas al variar algunos componentes del medio de
cultivo, como son los reguladores del crecimiento, las sales minerales como el
calcio y el hierro, los azúcares y las vitaminas. Las altas concentraciones de
auxinas y bajas de citoquininas en el medio de cultivo mejoran esta propiedad.
En el experimento se buscó la obtención del metabolito parcialmente asociado al
crecimiento de Zanahoria: B-Caroteno. Debido a que este se encuentra de manera
intracelular se utilizó el método de sonicación (lisis celular), sin embargo, la
presencia de estos terpenos se verifico al realizar la prueba de Lieberman
-Buchnard

PRUEBA DE LIEBERMANN-BURCHARD
La prueba dio positiva ya que el anillo amarillo que se formó al reaccionar el ácido
sulfúrico y el ácido acético con los carotenos.
Esta reacción es típica de Alquenos, ya que los carotenos presentan esta
funcionalidad esta reacción se lleva a cabo cuando donde se pone de manifiesto
en el cambio de color en el tubo de ensayo dando una coloración:
 Un cambio de color rojo, rosado o violeta, indica la presencia de triterpenos.
 Un cambio de color a amarillo claro, indica la presencia de esteroides o
triterpenos saturados.
 La coloración amarilla o café refleja el estado de oxidación de los carotenoides.
 Presencia de coloración verde, azul verdoso: esteroides, conteniendo 2
enlaces C=C conjugados o formados por deshidratación con ácido sulfúrico.
En este caso el anillo amarillo resultante de la prueba indica que los carotenoides
estaban oxidados, debido a un error aleatorio que es el no haber cubierto el
matraz donde se encontraba la suspensión para evitar la oxidación de estos, esto
se indica en el manual justamente para que se observe un anillo de color verde-
azul. Esto se debe a las insaturaciones conjugadas (enlaces tipo 𝛑) que presentan
estas moléculas, ya que son enlaces susceptibles a reacciones de tipo adición
electrofílica, donde los 2 ácidos se comportan como electrófilos al tener H +.

Figura 1. Reacción etileno-ác.sulfurico

Esta reacción es la que se lleva a cabo en las insaturaciones lo que provoca el
cambio de color en el anillo, siempre y cuando no se encuentre oxidado el
caroteno.

Figura 2. Reacción de oxidación

Esta reacción se lleva a cabo cuando hay presencia de oxidación en las

insaturaciones, se puede observar la presencia de un grupo alcohol lo que indica
que está más oxidada la molécula.
Estas reacciones son representativas ya que se llevan a cabo con la presencia de
Enlaces tipo 𝛑 y cuando las insaturaciones se oxidaron y ahora se encuentra un
grupo alcohol.
REFERENCIAS
Traducción del trabajo del Dr. W.M. Morgan, d. I. (2010). Cultivo de tejido vegetal .
Obtenido de http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf
Halperin, W., Jensen, W.A. (1966), Ultrastructural changes during growth and
embryogenesis in carrot cell cultures. Journal of Ultrastructure Research. Volume
18. Issues 3-4. pp. 428-443
Aftab F, J Iqbal (1999) Plant regeneration from protoplasts derived from cell suspension of
adventive somatic embryos in sugarcane (Saccharum spp. hybrid cv. CoL-54 and
cv. CP-43/33). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 56:155-162.