Martens Lisbel,Novoa Lorena,Sanchez Pilar,Veja Christian. Asesor: Dr. Mauro Quiñones Taller de Biotecnología Vegetal.

Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Ricardo Palma.

INDUCCION DE CALLO IN VITRO DE Daucus carota L. (ZANAHORIA)

RESUMEN
Uno de los problemas en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica. Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un tejido cicatril de división celular desdiferenciado y desorganizado, donde cada una de sus células es totipotente, es decir capaz de crecer, dividirse y dar lugar a una planta. En el presente trabajo se utilizó explantes de Daucus carota, sembrados en el medio MS (Murashigue – Skoog) como medio de cultivo nutricional para obtener crecimiento de tejido calloso.

INTRODUCCION Uno de los problemas
en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica. Además presenta una susceptibilidad al ser afectada por diversas enfermedades, entre ellas la “podredumbre negra” causada por Stemphylium radicinum “hongo ascomiceto”, que causa oscurecimiento y muerte de las hojas y destrucción de la raíz; plagas como pulgón, gusanos grises, nematodos, etc. Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. (OMS, 2005 y Sumpsi, J., 1982). Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un proceso de desdiferenciación celular formado por la proliferación desordenada de células que da origen a una masa amorfa de tejido; es un proceso para obtener células germinativas de la planta seleccionada. (Quiñones, M., 2008); donde la respuesta embriogénica del callo depende del genotipo de planta. (Linz, 1984) En el presente trabajo se obtendrá tejido calloso en cultivo in Vitro de Daucus carota siguiendo el procedimiento descrito por Quiñones, M., 2008.

MATERIALES Y METODOS
Obtención de la planta La planta Daucus carota (Zanahoria) fue comprada en el supermercado wong, y trasladada al laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma en bolsa ziploc. Preparación de medio de cultivo Para preparar el medio MS se separo una alicota y se agregaron los carbohidratos. Luego se enriqueció el medio con 2,4D (diclorofenoxiacético) y se midió el pH, el cual fue 5.5 – 6.5. Luego, se adiciono el gel rite y fue llevado al microondas para obtener el medio líquido. Se procedió a servir en tubos de ensayo y fueron sellados con papel aluminio. Por último se auto clavaron a 121C. Esterilización del material biológico Los explantes obtenidos del cambium de Daucus carota (Zanahoria) se colocaron en un beacker y fueron lavados con detergente, con ayuda de un cepillo y agua de caño. Luego se enjuago con agua destilada y seguidamente fueron sumergidos en alcohol 96% por 40 segundos. Los explantes fueron sumergidos en cloruro de mercurio (HgCl2 0.1%) por 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo indicado, el material biológico fue enjuagado en agua esterilizada 5 veces con un intervalo de 5 minutos por enjuague.

como de los explantes. Figure 3: 3ra. El unico tubo con desdiferenciacion. lo cual afecto el desarrollo de la callogenesis. En la cuarta y quinta semana (Fig. debido al crecimiento desorganizado del callo. es decir el 88% de nuestras muestras fueron contaminadas.4D.3). observados en un periodo de cinco semanas. sin tocar el medio de cultivo. Con ayuda de una cámara digital se tomaron fotos. presento proceso de formación de callo en las dos terceras partes de su estructura no sumergida. Luego se sello el cuello del tubo con papel aluminio y se incubo a una temperatura de 27º C. por lo tanto solo el 12% de nuestra muestra fue viable. De morfologia heterogenea.4D tiene la capacidad para inducir procesos de diferenciación por lo que es necesaria para la formación del callo (Barba. 1987).4D. (Fig. de consistencia seca y granulosa (Fig.Tratamiento del explante e introducción en el medio de cultivo En la cámara flujo laminar los explantes ya esterilizados se transfirieron a una placa Pietri estéril y se aíslo la parte nuclear del explante. posteriormente fueron cambiando de color debido a la contaminacion. Contaminación micótica . Mostrando asi un alto indice de contaminacion de los explantes. probablemente microbiana o micotica o de fenolizacion.1).2) RESULTADOS Los explantes de Daucus carota fueron cultivados en un medio de cultivo MS enriquecido con 2. Monitoreo de la formación del callo El monitoreo se llevo a cabo cada 7 días para evidenciar si hubo formación de tejido calloso. La formación de tejido calloso despues de tres semanas de cultivo exhibio un crecimiento lento sobre la superficie del medio y el color fue cambiando de naranja a claro blanquecino. Con ayuda de la pinza se introdujo el callo en forma aséptica en los tubos con medio de cultivo. en medio de cultivo MS enriquecido con 2. Solo un tubo presento desdiferenciacion y formacion de callo del explante de Daucus carota.in vitro. Los explantes estuvieron incubados en un cuarto climatizado con temperatura de 25Co. formacion de callo. El proceso de desdiferenciacion se llevo a cabo en condiciones de oscuridad durante las cinco semanas de observacion.4D. mostrando ciertos tubos una fenolizacion y por lo tanto un color oscuro del medio y del explante.carota en medio de cultivo MS.4 y 5) se sigue evidenciando la totipotencialidad.del explante de Daucus carota en un medio de cultivo MS. se libero la yema con ayuda del bisturí y pinza de las células muertas que cubren el explante. Los explantes sembrados presentaban un color naranja en la primera semana. tanto del medio de cultivo enriquecido con 2.en la segunda semana de cultivo. La auxina 2. Figure 2: Dos semanas y se evidencia la desdiferenciacion del explante de D. Figure 1: Explante de Daucus carota con contaminacion (2da semana). Semana. y division constante del tejido calloso. se sembraron 8 tubos. De los cuales 7 tubos evidenciaron contaminacion durante el transcurso de las cinco semanas(Fig.

Effects of Auxin and Kinetin on the Development and Differentiation of Potato Tissue Cultured in vitro. Press. Nickell. Plant. DISCUCION Uno de los pasos importantes para la obtención del callo es la esterilización del explante. LIDER. tissue and organ culture.5ta semana de todas las muestras que se realizaron ya que el resto de los explantes presentaron una coloración más oscura a causa de la fenolizacion . REINERT J.carota. K.. (1958). Dtsch. usualmente se emplea el 2.Para evitar la fenolizacion es requerida la utilización de antioxidantes en el medio. 5. The exudation and characterization . Ojima. 4. 1974.Se obtuvo una muestra de tejido calloso aproximadamente entre la 4ta. & Ohira. L. Cal. en la actualidad se ha generalizado el uso de etanol (70% v/v) y el hipoclorito de sodio de 1% al 3% contenidos en productos de uso domestico. REINERT J.). WINKLER. A. K. Ann Rev. Figure 4: 4ta Semana. (1974). N. En consecuencia hay que remover la auxina o usarla en concentraciones más bajas (Halperin 1964). The utilization of sugar and starch as carbon sources by sugarcane cell suspension cultures. KATSURA N. porque son compuestos altamente tóxicos y que no son fácilmente removibles del explante (Linz Re. A.Tener una asepsia adecuada para evitar el ingreso de hongos ambientales. Se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico. Plant and Cell Physiology. la maduración de los embriones y la germinación no ocurren en la presencia de 2. (1977). (1979). . como también se vieron afectados por la contaminación por hongos ambientales . 1980.4-D. KLIEWER. 7. Vol. COOK. Bot. Plant Physiol 25:135-165 p. 20 (4): 862869 p. Protoplasma 70:49–60 p 8. 11 (1): 183-185 p.Se sugiere determinar la concentración de sacarosa adecuada en el medio de cultivo para la inducción en menor tiempo. 2.). 71-15 p.carota. Ges. el cual brinda el estimulo de la iniciación de la embriogenesis somática en el callo. Physiol. . BACKZ-HUSEMANN D.. Es posible aumentar el potencial embriogénico de los callos de zanahoria exponiéndolos a niveles altos de sacarosa o de manitol. otros presentando una despigmentación coloreando el medio MS. CONCLUSIONES: . 3. TAGAWA T. Jarret RL. la sacarosa se utiliza en concentraciones de 2% y 3% hasta 12% demostrado por (Wheterell 1984). Univ. OKAWAZA Y.4-D. Ber. Plant Propagation through Tissue Cultures. como el acido cítrico. J. (1967). 6. & Maretzki. Figure 5: 5ta Semana. (eds. Applied and fundamental aspects of plant cell. 1970. multiple granulacion. En: Reinert J. General Viticulture. Embryo formation by isolated single cells from tissue cultures of Daucus carota. acido ascórbico. Sin embargo. de callo de D. BIBLIOGRAFIA 1. Untersuchungen iiber die morphogenese und gewebekulturen. MURASHIGE T. NARAYANASWAMY S. Regeneration of plants from tissue culture. J. y Bajal YPS. Springer – Verlag 179-248 p. crecimiento en la formacion de callo de D. con menor frecuencia hipoclorito de calcio y cloruro de mercurio.

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