GUÍA DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL M.Sc. VIRGINIA J.

ROJAS MERCADO

COLORACIONES

2.1. OBJETIVO.- Conocer en forma práctica algunos métodos de coloración

a) Coloración simple y b) coloración diferencial

2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO.-

Se llama coloración o tinción a una técnica que se emplea en los laboratorios con el
objetivo de optimizar la visión de aquello que se observa a través de un microscopio.
La tinción, de este modo, consiste en aplicar un colorante a una sustancia o un tejido
para que resulte más simple detectarlo o analizarlo.
La coloración simple se emplea cuando se desea resaltar un tipo específico de
microorganismos: ejemplo, se utiliza azul de metileno para colorear las levaduras,
colorante de Schaeffer y Fulton para colorear bacterias, y el colorante de Proskauer
para colorear flagelos. En la coloración simple el colorante reacciona con los
componentes del microorganismo, especialmente con los ácidos nucleicos

Los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre las

células bacterianas, o entre partes de una misma célula, se denominan técnicas de
tinción diferencial. Son algo más complicadas que las de tinción simple por cuanto se
expone la preparación a más de una solución colorante o se emplean ciertos reactivos
complementarios para la tinción.

2.3. PARTE EXPERIMENTAL.-

2.3.1. MATERIAL

CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD MATERIAL

1 Azas de platino 10 Portaobjetos

1 Cepillos para tubos
10 Cubreobjetos
1 Espátula
4 Goteros
1 Mechero Bunsen
2 Mechero de alcohol
1 Picetas plásticas
1 Pipetas graduadas
2 Pinza de madera
1 Pinza metálica plana
1 Propipeta
1 Varillas
3 Vasos de precipitado 50 ml
1 Vasos de precipitado 100 ml
1 Vasos de precipitado 250 ml
Vasos de precipitado 500 ml
1000
1 Vasos de precipitado ml
1 ml 2 Olla
1 Microscopio
1 Hornilla eléctricas

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2.3.2. REACTIVOS

Cristal violeta
Azul de metileno
Fucsina
Lugol
Alcohol etílico
Safranina
Verde de malaquita
Aceite de inmersión
2.3.3. PROCEDIMIENTO.-

A) PREPARACIÓN DE LAS EXTENSIONES PARA TEÑIR.-

Las extensiones de bacterias procedentes de cultivos sobre medios sólidos se
realizan sobre portaobjetos de la siguiente manera:
1) Lavar el portaobjeto con detergente, abundante agua y luego con alcohol etílico,
secar
2) Con el aza de platino, colocar una gota de agua destilada sobre el portaobjetos
3) Esterilizar el aza poniéndolo verticalmente a la llama del mechero hasta que este
incandescente
4) Enfriar el aza
5) Con el aza, tomar una pequeña porción de la muestra que se vaya a examinar
6) Colocar la muestra sobre la gota de agua del portaobjeto y con el aza realizar una
suspensión y extender la muestra en el centro del portaobjeto. Se debe tratar de
conseguir extensiones finas, incluso tan delgadas que no se vean cuando secan.
7) Esterilizar el asa por flameado
8) Dejar que la preparación se seque al aire y luego proceder a la “fijación “ del
extendido, que puede realizarse mediante calor o mediante productos químicos
(alcohol, acetona, etc). La fijación por el calor se realiza pasando lentamente el
portaobjeto en posición horizontal sobre la llama de un mechero,
9) Se repite la última operación hasta sequedad total, cuidando de impedir la
combustión del extendido

Las extensiones de microorganismos a partir de cultivos en medio líquido se hacen de la

misma manera, excepto que no se precisa la dilución con agua.

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B) TINCIONES SIMPLES.-
Las tinciones simples son aquellas en las que se utilizan un solo colorante y tienen
como objetivo permitir la observación de la morfología bacteriana; forma tamaño
y tipo de agrupación de los microorganismos.
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente mediante Tinción
Simple, esto es, utilizando solo un colorante. El valor de esta clase de tinción
radica en su simplicidad y facilidad de empleo.
La preparación previamente fijada por el calor se cubre con el colorante que se
expone a continuación:
• Cristal violeta (se tiñe durante 1 minuto)
• Azul de metileno (se tiñe al menos 3 minutos)
• Fucsina (se tiñe solo durante 30 segundos)

Después del tiempo indicado, lavar suavemente la preparación con agua destilada
y secar al aire. Examinar al microscopio

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C) TINCIÓN DIFERENCIAL.-

1. Realiza la preparación del frotis bacteriano como se explicó en el paso

anterior
2. Teñir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua destilada el exceso de lugol
6. .Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la
preparación deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teñir con safranina 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación.
11. Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre todo en el
color de cada preparación.
Es preciso insistir en que esta prueba debe realizarse con cultivos jóvenes de
bacterias, ya que algunas cambian la reacción de Gram a medida que el cultivo
envejece.

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D) COLORACIÓN DE ESPORAS.-

Las esporas pueden distinguirse en las preparaciones microscópicas sin previa

coloración debido a la refringencia que poseen que los diferencia del resto del
microorganismo, En las preparaciones teñidas con los métodos comunes, la
espora no se colorea debido la resistencia que ofrece a la impregnación con los
colorantes; la espora y la gruesa membrana que la recubre permanecen
incoloras, destacándose netamente del cuerpo microbiano fuertemente
coloreado.

No obstante esta resistencia a la tinción, la membrana de la espora puede ser

teñida y las esporas colorearse por distintos métodos.

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias
produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder
obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las
instrucciones.

1. Preparar los frotis bacterianos

indicados.
2. Teñir con verde malaquita.
Con unas pinzas de madera
colocar la muestra encima de la
llama del mechero de forma que
el colorante humee durante 5
min.
Nota: evitar que la muestra
hierva. Añadir más colorante si
éste se evapora; es importante
que la muestra no se seque.
3. Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
4. Teñir con safranina 1 min.
5. Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la preparación al microscopio

D) HONGOS FILAMENTOSOS.
1. Revisar las características coloniales.
2. Mediante la técnica de impronta con diurex, hacer una preparación en fresco y teñir,
para ello:

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• Cortar un pedazo de diurex de aproximadamente 1.5 cm.

• Colocar una gota de lactofenol azul de algodón en un portaobjetos limpio y
desengrasado.
• Esterilizar el asa micológica y dejar enfriar.
• Pegar el diurex en el extremo del asa y con el lado de goma hacia abajo presionar el
diurex sobre el cultivo de hongo cuidando de no frotar (Figura 4).
• Con ayuda del asa bacteriológica depositar el diurex (con la muestra hacia el
colorante) en el portaobjetos (Figura 5).
• Colocar un cubreobjetos (Figura 6) y observar al microscopio con los objetivos 10x y
40x.
3. Registrar los resultados, para ello describir las características de los hongos con ayuda
de los esquemas del Manual de Microbiología General (2006).

2.3.4. CUESTIONARIO.-
1) Por qué se usa cubreobjetos? Se utiliza siempre?
2) Qué ventajas se obtiene utilizando el objetivo de inmersión?
3) Para qué sirve la microscopía de campo oscuro?
4) Se puede utilizar el microscopio para realizar medición de microorganismos?
Explique detalladamente.
5) A) Que especificaciones técnicas debe cumplir un microscopio para ser
considerado de buena calidad? B) Qué es el poder de resolución de un
microscopio? Qué factores influyen en el poder de resolución?
6) Se pueden cambiar los colorantes utilizados en la tinción de Gram?
7) Cuál es la influencia del pH en la tinción de Gram?
8) En qué consiste la tinción de ácido resistentes?
9) Cuál es la técnica para la tinción de flagelos?
10) Indica las diferencias que existen entre una tinción simple y una diferencial