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Métodos no extractivos
Reactivos:
H2SO4 conc. p.a. (98%)
Catalizador: K2SO4 o Na2SO4 anhidro + CuSO4. 5 H2O p.a. (relación 10:1)
NaOH 40%
Solución H3BO3 4%
Solución H2SO4 0,2 N
Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol
Determinación:
a) Digestión: Colocar la cantidad adecuada de muestra (de acuerdo al contenido estimado de
nitrógeno) entre 0,1 y 4 g con una precisión de 1 mg, en un balón Kjeldahl de 500 ml. Agregar 1
cucharadita de catalizador, perlas de vidrio y 15-20 ml de H2SO4 conc. Todo el material debe estar
sumergido en el ácido para que no haya pérdidas de nitrógeno. Conectar el balón a la trampa de
agua y calentar la mezcla suavemente hasta que cese el desprendimiento de espuma; luego
calentar enérgicamente hasta completar la digestión de la materia orgánica (no se observan
partículas carbonosas sin oxidar y el líquido queda translúcido y de color débilmente verdoso o
azul-verdoso). La digestión demanda entre 1 y 2 hs. Enfriar y agregar cuidadosamente al
menos 100 -200ml de agua.
b) Destilación: Presentar el balón con la muestra digerida a un refrigerante por medio de una trampa
adecuada. Preparar un erlenmeyer con 25-50 ml de H 3BO3 4% (sobre el cual se va a recoger el
NH3 destilado) y gotas de indicador Mortimer (color rojo), y colocarlo a la salida del refrigerante
cuidando que el extremo del mismo quede sumergido en la solución ácida. Antes de conectar
completamente el balón se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de solución de
NaOH 40% como para neutralizar el ácido sulfúrico, primero sin agitar para que se ubique en el
fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el balón, agitar para lograr la mezcla (el medio se
hace fuertemente alcalino que se detecta por formación de un precipitado pardo oscuro,
dispersado por efecto de la ebullición) y simultáneamente se comienza el calentamiento a
ebullición del contenido del balón. El indicador vira a azul cuando empieza a destilarse el NH3 por
arrastre en corriente de vapor. Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el
erlenmeyer colector (los primeros 150 ml de destilado contienen generalmente la totalidad del
NH3). Una vez alcanzado dicho volumen, se retira el erlenmeyer enjuagando dentro del mismo el
extremo del refrigerante con AD, para no perder nitrógeno y luego se apaga el calentamiento.
c) Valoración: El destilado se valora con solución de H2SO4 0.2 N, hasta lograr el viraje del indicador
Mortimer al color inicial rojo.
d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas indicaciones pero sin
colocar muestra en el balón.
Cálculos:
En los cálculos para convertir nitrógeno a proteínas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7 para
cereales y soja y 6,38 para leche y derivados.
Fundamento: El pH de músculo de pescado fresco está entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento
de la muerte). Después de muerto se acumula ácido láctico, provocando caída de pH, pero como en
el músculo hay compuestos con carácter buffer, no permiten que se vea ese descenso. Por
descomposición del músculo se acumulan amoníaco, dimetilamina y trimetilamina. Si en ese
momento se produce contaminación bacteriana, entonces comenzará a subir el pH (primero
lentamente y rápido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0. Ocurre un
proceso de autolisis que lleva al aminoácido:
Aminooxidasas
NH3 + R-CH2-COOH
(algunos son volátiles y
arrastrables por agua)
Hay acción sobre el óxido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada. El láctico
en el músculo es reductor y actúa sobre el O=N(CH3)3 (precursor).
CH3 CH3
I Enzimas I
H-C-OH + 2 O=N(CH3)3 2 N(CH3)3 + COOH + CO2 + H2O
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I microbianas básico volátil
COOH volátil
Reactivos:
MgO puro
Agente antiespumante (puede ser alcohol octílico o un antiespumante siliconado)
Acido bórico 2%
Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol
H2SO4 0,02N "standarizado" (preparado por dilución de H2SO4 0,1 N)
Curva de calibración: se obtiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras de leche
con contenidos de proteína conocidos. Para obtener las distintas muestras de leche se parte de
una leche entera a la que se le midió el % de proteínas por el método de Kjeldhal; con esta leche
se hacen diluciones o se agrega caseína para obtener las concentraciones proteicas deseadas. El
contenido de proteínas que cubra el rango de la curva de calibración, debe ser de 1 a 4 % (p/v).
NOTA: Actualmente los análisis en leche se realizan siguiendo la metodología especificada en las
normas IDF, de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Para la determinación del contenido
de proteínas se utiliza el método de Kjeldhal, utilizando ácido bórico para recoger el destilado.
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a) Método de Biuret
Fundamento: Los polipéptidos (la mínima unidad de reacción es el tripéptido) reaccionan con una
solución diluida de sulfato cúprico (Cu2+) en medio fuertemente alcalino, mostrando una coloración
azul característica.
Rango: 1-6 mg/ml
Reactivos:
Solución A: tartrato de sodio y potasio.4 H2O -----18,06 g
CuSO4.5H2O -------------------------------- 6,00 g
KI ---------------------------------------- 2,00 g
NaOH 2 N --------------------------------- 40 ml
Llevar a 200 ml con agua destilada
Solución B: 10 g de KI en 160 ml de NaOH 2 N.
Solución C: (prepararla en el momento) 10 ml de Solución A + 8 ml de Solución B + agua destilada
para completar 100 ml.
b) Método de Bradford
Rango: 0.01-0.5 mg/ml
Reactivos:
Solución colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie
Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de ácido fosfórico 85% y 50 ml de etanol 95%. Una vez
que el colorante se disolvió completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fría.
NaOH 1M
Procedimiento: Prender el espectrofotómetro 15 min antes de usarlo. Poner 20l de muestra en un
tubo de hemólisis. Agregar 50l de NaOH 1N (alternativamente, el NaOH puede agregarse al
reactivo de color en la relación 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de color e incubar 5 min. Medir la
absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno.
c) Método de Lowry
Se basa en la reacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con las proteínas. Si bien el mecanismo de
reacción no está bien dilucidado, se sabe que la tirosina, y en menor extensión la cisteína, la cistina,
la histidina y las uniones peptídicas, reaccionan reduciendo al molibdato a azul de molibdeno. La
reacción también puede producirse en presencia de tungstato, para generar azul de molibdeno y
tungsteno. El complejo da un color azul característico que se mide a 745-750 nm. Los iones Cu 2+ en
medio alcalino facilitan la reacción de reducción del reactivo de Folin formando un complejo con la
unión peptídica a través del nitrógeno involucrado en el enlace y reduciéndose a Cu 1+. El Cu1+ y los
residuos involucrados reducen entonces al reactivo de Folin generando el color característico.
Interferencias
- Fenoles excepto nitrofenoles y otras sustancias reductoras (mercaptoetanol, ditiotreitol, etc) por
reducción del reactivo de Folin.
- Glicina: por disminuir la intensidad del color desarrollado.
- Sustancias o buffers que acidifiquen el medio.
- Agentes quelantes del cobre.
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Determinación: Se mezclan en el momento de la determinación volúmenes iguales de la solución de
CuSO4 y de la del tartrato. A esta mezcla la llamaremos solución B. Añadir 1ml de la solución B a 50
ml de la solución A, para obtener la solución A+B.
Se prepara la dilución de la muestra que corresponda (200 l) a la que se le adiciona 1ml de
solución A+B. Agitar bien y dejar reposar 10 min.
Pasado este tiempo agregar 100 l del reactivo de Folin diluido. Agitar bien y dejar reposar 30
min. Leer absorbancia a 750nm
Determinación: Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftaleína como indicador.
Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que aparece una
débil coloración rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pHmetro y llegar a pH
8.
Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftaleína y titular de inmediato la
acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este último valor para el cálculo de N
amínico y el primero para el cálculo de la acidez.
Cálculo:
g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra
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Extracción de Proteínas
Productos cárneos.
- Homogeneizar 1 g de músculo picado con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 0,03 M, pH = 7,0.
- Centrifugar a 7000 g (15 min, 4 °C). Separar el sobrenadante.
- Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet.
- Mezclar los dos sobrenadantes obtenidos. La solución resultante constituye la fracción de
proteínas extraíbles en agua (PEA) (proteínas sarcoplásmicas fundamentalmente).
- Tratar el pellet remanente luego de los dos pasos de extracción previos con 10,0 ml de
buffer Tris-HCl 0.03 M conteniendo KCl 0,6 M, pH = 7.
- Centrifugar (7000 g, 15 min, 4 °C) y separar el sobrenadante.
- Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet.
- Mezclar los dos sobrenadantes: se obtiene la fracción de proteínas extraíbles con sal
(PES) (proteínas miofibrilares fundamentalmente).
Harina de soja.
- Tratar 1 g de harina de soja desgrasada con 10,0 ml de agua alcalinizada con NaOH 1 N a
pH = 8.
- Agitar durante 1 h en agitador magnético a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 10000 g (15 min, 4 °C). Separar el sobrenadante: fracción de proteínas
solubles.
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Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
Reactivos y equipo
Buffer de electrodo: Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (Tris-HCl) 25 mM, glicina 192 mM (pH
8,3), con dodecil sulfato de sodio (SDS) 0,1 % p/v.
Buffer de gel stacking (4x): Tris-HCl 500 mM (pH 6,8) con SDS 0,4 % p/v; N´,N´,N´,N´,
tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v.
Buffer de gel separador (4x): Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) con SDS 0,4 % p/v; N´,N´,N´,N´,
tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v.
Buffer de muestra para electroforesis desnaturalizante: Tris-HCl 62,5 mM (pH 6,8), sacarosa
15 % v/v, SDS 2% p/v, EDTA 25 mM y azul de bromofenol 0,05 % p/v con o sin 2-mercaptoetanol
(2-ME) 5% v/v, para obtener condiciones reductoras o no reductoras, respectivamente. El 2-ME
reduce enlaces disulfuro y desarma estructuras multiméricas estabilizadas por uniones covalente
de grupos tioles de cisteínas.
Solución de acrilamida-bisacrilamida: 30 g de archilamida y 0,8 g de bisacrilamida se llevan a
un volumen final de 100 mL con agua destilada. Luego se filtra y se almacena en frasco color
caramelo.
Equipo de electroforesis: Mini Protean II (BIO-RAD Life Sciences, EE. UU.) con separadores
entre placas de 1 mm de espesor.
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TEMED 7 l
Tinción
Los geles serán fijados y coloreados en una misma etapa en solución de Coomasie Brilliant Blue
R 0,192 % p/v en agua-metanol-acido acético (10:10:4) durante un tiempo mayor a 1,5 h y serán
decolorados en solución agua-etanol-ácido acético (65:25:10) con sucesivos cambios a
temperatura ambiente hasta obtener la resolución deseada.