INFORME DE RESULTADOS LABORATORIO BIOQUIMICA II

TEMA: ANALISIS DE LA ORINA (máximo 9 páginas)

PRESENTADO POR:____________________________________________________________________________________________________

1. Introducción al tema, el porqué de la selección de las pruebas que se hicieron y en general los resultados obtenidos (no olvide incluir
bibliografía):

La orina es un líquido acuoso transparente y amarillento, de olor característico (sui géneris), secretado por los
riñones y eliminado al exterior por el aparato urinario. La orina puede servir para determinar la presencia de
algunas enfermedades. En los laboratorios clínicos se abrevia u o uri. En español, los prefijos de todas las
palabras relacionadas con la orina son uri- y uro-.
Después de la producción de orina por los riñones, ésta recorre los uréteres hasta la vejiga urinaria, donde se
almacena y después es expulsada al exterior del cuerpo a través de la uretra, mediante la micción.
Composición de la orina
En los seres humanos, la orina normal suele ser un líquido transparente o amarillento. Se eliminan
aproximadamente 1,4 litros de orina al día. La orina normal contiene un 95 % de agua, un 2 % de sales minerales
y 3 % de urea y ácido úrico, y aproximadamente 20 g de urea por litro. Cerca de la mitad de los sólidos son urea,
el principal producto de degradación del metabolismo de las proteínas. El resto incluye nitrógeno, cloruros,
cetosteroides, fósforo, amonio, creatinina y ácido úrico.
Composición de la orina en mg/100 ml de fluido:
Urea: 2,0
Ácido úrico: 0,05
Sales inorgánicas: 1,50

2. Propiedades físicas de la orina

2.1. Resultados
Tipo de orina: (sexo y edad)
A:__________; B:__________; C:__________; D:__________; E______________; F____________

Muestra Padecimiento de alguna Hora última ingesta Color Olor pH Otro

enfermedad (cuál?) alimentos (cuál?)
2.2. Qué factores influyen en la coloración y pH de la orina?

3. Composición de la orina
3.1. Resultados Urea

Muestra Urea hidrolizada + HgCl2 + I. Urea hidrolizada (mg/mL) Volumen HCl empleado
Tashiro

3.1.1. Cuál es la función química de la ureasa? (incluya reacción general)

Se tomaron 5 ml de muestra de orina, se le adicionaron 2 mL del extracto de ureasa obtenido anteriormente, se

homogenizo y se calentó en baño maría durante 20 min. Esto para aumentar la actividad enzimática de la ureasa
sobre la urea presente en las muestras de orina según la reacción de la fig. 2.

Fig. 2, Conversión de la urea en iones amonio y carbonato mediada por la enzima ureasa.

Después, se le adicionaron 5 gotas de HgCl2 1%, esto para inhibir la actividad enzimática de la ureasa ya que en
su sitio catalítico se presentan grupos –SH (sulfhidrilo), provenientes del aminoácido cisteína que forma parte de
su cadena peptídica. El HgCl2 se una irreversiblemente a los grupos –SH, los inactiva y, así, detiene la actividad
enzimática de la ureasa [1].

3.1.2. En la prueba, cuál es la función del indicador de tashiro?, En general, para qué tipo de pruebas se emplea dicho indicador?
4. El indicador de Tashiro es una mezcla de rojo de metilo y azul de metilo. El rojo de metilo es propiamente el
indicador, que es de color amarillo en presencia del hidróxido de amonio, a pH>5.5. El azul de metileno se
utiliza como medio de contraste, de tal forma que la solución, en presencia de NH4OH, es de color verde
limón y en medio ácido cambia fucsia [1].
1 no tiens enfermad de 21

2 hombre 21 no tiene enfermad

3 mujer 21 hipoglicemia

La muestra 3 , cambio de color amarillo a verde, esto puede ser debido a que el pH de la solución bajó es decir,
que la [NH4OH] disminuyo, probablemente por evaporación debida a una agitación del tubo de ensayo. También
puede ser porque en la hidrolización de la urea, fig. X, se produce también CO2 el cual a pH superior a 7 se
convierte en 𝐻𝐶𝑂3− . La muestra 1 cambio de amarillo a azul oscuro es decir se encuentra que no se encuentra en
medio acido o básico hay un exceso de calcio, para la muestra 2 esta cambia de amarillo a morado, este se
encuentra en medio acido. El reactivo de tashiro para las muestras 2 y3 es positivo debido a los cambios de
color, pues este es un indicador mixto. Sirve para diagnosticas enfermades asociadas a infecciones en el tracto
urinario, para este caso Si la orina es de carácter alcalino, como en el caso de la muestra 3 por ejemplo,
propiciará la formación de cálculos de fosfato (de calcio o de estruvita) y de oxalato cálcico. Por el contrario, si
la orina contiene un alto nivel de acidez, muestra 2 favorecerá la aparición de cálculos de ácido úrico, de
cistina y también de oxalato cálcico.
1) Quesada, Silvia. Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica. Editorial EUNET. Pág. 36-37.

2) https://www.lit-control.es/blog/el-papel-del-ph-en-la-formacion-de-calculos-en-el-rinon

4.1.1. Indique la relación estequiométrica entre: HCl, NH4OH y urea hidrolizada y que fueron de apoyo para la tabla en 3.1.

Muestra Moles HCl empleados Moles NH4OH titulados Moles urea hidrolizada

1 0,00011 0,00011 3,3

2 0,0001 0,0001 3
3 0,00006 0,00006 1,8

En caso de no haber titulado el NH4OH, sustente el por qué no fue necesaria dicho proceso y qué indicaría de las muestras de orina analizadas?, al
haber cambiado de indicador, qué se puede analizar con respecto a las concentraciones de urea en las muestras?, por qué no se encontraron en los
rangos esperados?

Aunque el indicador recomendado era la fenolftaleína, en la práctica se usó el naranja de metilo, debido a que la
fenolftaleína da un color rosado a pH mayores de 8.3 y vira a incolora por valores de pH menores de 8.3; por otro
lado, el naranja de metilo es de color amarillo en presencia de las formas de alcalinidad, o sea a pH mayor de
4.5, y vira a color naranja en condiciones ácidas. Las muestras de orina se encontraban a pH menores de colocar
rango de ph por lo que se escogió el naranja de metilo.
La cantidad de moles de urea presente en las muestras de orina, e hidrolizada por la ureasa fig. 2, se hallan a
partir de las moles de 𝑁𝐻4+ que reaccionan con el HCl.
Para hallar las moles de HCl gastadas en la titulación, se usa la siguiente ecuación:
0.1 ∗ 𝑚𝐿 𝐻𝐶𝑙 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠
𝑛𝐻𝐶𝑙 =
1000
Las moles de 𝑁𝐻4+ 𝑂𝐻 será igual a las moles de HCl gastadas en la titulación, según la estequiometria de la
reacción de la fig. 4.

Fig. 4, Reacción de titulación del NH4OH producido con el HCl (agente titulante).

La cantidad de urea presente en las muestras se determina por medio de la siguiente ecuación:
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑁𝐻4+ 𝑂𝐻 ∗ 60 ∗ 1000
𝑚𝑔 𝑈𝑟𝑒𝑎 =
2
El humano sano produce aproximadamente 2 mg de urea por cada 100 mL de orina. Haciendo los cálculos
pertinentes, 5 mL de orina deben presentar aprox. 0.1 mg de urea. Las muestras presentaron una mayor cantidad
de urea debido a que la muestra recolectada fue a partir de la 1° micción del día de las personas, es decir
estaban en ayuno, por lo que la concentración de la urea, producida a partir del metabolismo durante la noche,
aumentó.

 Ácido Úrico:
Se tomaron 5 mL de la muestra de orina y se le adicionaron 4 mL de HCl conc. Se homogenizo y se dejo en un
baño de hielo hasta la formación de cristales fig 5
Fig. 5, Muestras de orina en baño de hielo para la formación de cristales.

No se formaron los cristales esperados en ninguna de las muestras, esto debido a que el tiempo para que haya
una formación de cristales es de mínimo 24 h[2] en el laboratorio no se espero este tiempo (fue de 2 h); por otra
parte se observó un cambio de color de la muestra, fig. 5, debido a la formación de las diferentes sales, de urato
o cloruros, en la muestra de orina a un pH ácido aprox. 3.
Los cristales de ácido úrico esperados se muestran en la fig. 8, las sales de urato forman cristales amorfos, fig. 7.
El HNO3conc disuelve el ácido úrico con desprendimiento de gas, formado de nitrógeno y CO 2, y la disolución
contiene aloxana, aloxantina, urea, ácido parabánico y amoniaco [3]; si esta disolución se evapora hasta
sequedad, y el residuo se humedece con un poco de amoniaco, se produce luego una coloración rojo-púrpura, la
cual es debida a la murexida o purpurato amónico que se ha formado y pasa a ser azul púrpura en contacto con
KOH. Por medio de esta reacción se pueden descubrir las más pequeñas cantidades de ácido úrico [4].

Fig. 7, a-b) Formas bipiramidales y amorfas del ácido úrico y de las sales de
urato.

Fig. 8, Representación de las diferentes formas y aspectos de los cristales de ácido úr

bajo interferencia diferencial. c-f) examinadas bajo luz polarizada. g) bajo iluminación de campo claro. Los cristales individuales pueden aparecer azules, incoloros o
dependiendo de la relación existente entre el eje mayor del cristal y el rayo de luz polarizada, así como de las propiedades refractarias del cristal.

La concentración normal de ácido úrico en la orina de 24 h es de 250-750 mg/día, es decir 1,48-4.43 mmol/día.

4.2. Otros componentes de la orina

4.2.1. Resultados

Muestra Característica cualitativa

Componente a b c Blanco
Creatinina Naranja Naranja Naranja -
fuerte fuerte fuerte
Glúcidos Amarillo Amarillo Amarillo -
 morado morado morado
Esteroides (R. + + -
Lieberman-
Bukhardt)
Esteroides (R. Cobre leve Naranja -
ZnCl2) leve
Cuerpos Coloración Coloración Coloración
cetónicos con naranja naranja naranja …
sulfato de claro se claro ….
amonio forma a….
Cuerpos Coloración Coloración Coloración
cetónicos sin naranja naranja naranja
sulfato de oscuro.. oscuro.. oscuro..
amonio
Acetona Rojo + Rojo Amarillo -
loscuro +
Proteínas y Verde Amarillo Azul Azulclaro
aminoácidos (R. clara verdoso verdoso
Biuret)
Proteínas y Morasdo Morado morado
aminoácidos (R. oscuro oscuro
Ninhidrina)
4.2.2. Escriba la formula química de la creatina y la creatinina.

Creatina
Creatinina

4.2.3. Cuál es el fundamento químico de la prueba de Jaffé? (incluya ecuación química)

5. En la reacción de Jaffé, fig. 10, que data del año 1886, la creatinina reacciona con el ácido pícrico en medio
alcalino formando un complejo de color rojo a una longitud de onda entre 510- 520 nm. La creatinina no es la
única que reacciona, por eso es que tiene baja especificidad. Existen interferentes positivos, entre ellos las
proteínas, glucosa, acetoacetato, ácido ascórbico y ácido úrico, e interferentes negativos, y de ellos el más
importante es la bilirrubina. Frente a muestras con bilirrubinas elevadas, los valores de creatinina se ven
disminuidos porque la bilirrubina en el medio alcalino se oxida a biliverdina formando un compuesto incoloro
que disminuye el color de la reacción. Otra interferencia negativa, pero que adquiere más relevancia en
neonatología es la hemoglobina de origen fetal, que a diferencia de la hemoglobina del adulto, es resistente al
álcali; de esta manera, hace que cambie lentamente el color a lo largo del curso de la reacción, alterando y
disminuyendo la coloración de la reacción [5].

6. Fig. 10, Reacción de Jaffé.

6.1.1. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la prueba de Jaffé.

6.1.2. A partir de la prueba de Molish, qué tipo de glúcidos pueden ser excretados por la orina?

7. El H2SO4 hidroliza los enlaces ester que unen a los carbohidratos presentes en las muestras de orina. El
carbohidrato se deshidrata y se forma un furfural, el cual reacciona con el naftol para producir un anillo
morado, fig. 12. La reacción es positiva para todas las muestras de orina que contengan carbohidratos.
 Fig. 12, Reacción de la prueba de Molish.
La fase superior es el resto de la muestra de orina. La solución transparente corresponde al de H2SO4.
La glucosa no es el único azúcar que puede aparecer en la orina. También pueden encontrarse galactosa,
lactosa, fructosa, manosa y pentosas, fig. 13.

Fig. 13, Glúcidos que pueden aparecer en muestras de orina.

7.1.1. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la prueba de Molish.

7.1.2. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la prueba Lieberman-Burkhardt.

El reactivo utilizado contiene anhídrido acético, el cual es un agente deshidratante y evita que las moléculas de
agua no interfieran en la reacción de colesterol a colesterileno; y H2SO4 (conc), este es un agente deshidratante
que produce que el colesterol actúe como un alcohol y así pueda ocurrir la deshidratación con la formación de un
conjugado pi.
Se observó la separación de 2 capas, una de color naranja y otra de color blanco, un precipitado. No se observó
el anillo verde debido a que las muestras de orina presentaban metabolitos que pudieron reaccionar con los
componentes del reactivo de Lieberman, formando así un precipitado color blanco y una solución color naranja.
La reacción esperada, fig. 16, consiste en que el colesterol sufre una oxidación gradual, formándose una
molécula de colestapolieno que posee un doble enlace adicional al colesterol, la etapa inicial consiste en la
protonación del -OH del colesterol, desprendiéndose agua, obteniéndose el ion carbonio 3,5-colestadieno que
constituye el primer paso de la reacción de color. La oxidación del ion carbonio por el SO3 produce un ácido
colesta-hexano-sulfónico cromóforo, produciendo la tonalidad verdosa.
7.1.3. Cuál es el fundamento químico al emplear cloruro de zinc para la identificación de esteroides? (incluya ecuación química)

Fig. 16, Mecanismo de reaccion de la prueba de Lieberman-Burchard.

La concentración de hormonas, sus metabolitos y determinadas enzimas pueden ser investigados en orina para
evaluar la actividad de os órganos y tejidos de síntesis. Como ejemplo se pueden citar a la aldosterona, cortisol,
adrenalina, noradrenalina, cetosteroides y 17-OH-esteroides, entre otros.

7.1.4. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la prueba con ZnCl2.

7.1.5. Qué es la cetogénesis?, a qué se le llaman cuerpos cetónicos (incluya sus fórmulas)?.

Cetogénesis. Es el proceso metabólico por el cual se forman los cuerpos cetónicos por la oxidación (ß-
oxidación) metabólica de las grasas. Estos metabolitos aumentan en situaciones como diabetes
descompensada o ayuno prolongado. Puede se determinada por la presencia de cuerpos cetonicos
eliminados en la orina.

Cuerpos cetónicos
Los cuerpos cetónicos son compuestos químicos producidos por el hígado con el fin de aportar energía en situaciones
excepcionales donde el metabolismo de la glucosa se encuentra comprometido.

El hígado es el órgano principal asociado con el procesamiento, la producción, y la exportación de glucosa y ácidos grasos para
soportar los requisitos de energía de los otros tejidos y órganos en el cuerpo. Bajo ciertas condiciones fisiológicas y
fisiopatológicas, donde el organismo utiliza mayoritariamente las grasas en lugar de los azúcares para generar energía,
ayuno, hipoglucemia o diabetes mellitus, el hígado puede producir cantidades significativas de acetoacetato y d-3-hidroxibutirato
(cetosis). Estos compuestos entran en la circulación sanguínea donde el acetoacetato se descarboxila espontáneamente, dando
lugar a la acetona. Estas tres sustancias se conocen colectivamente como cuerpos cetónicos.
7.1.6. Qué indicará la presencia de cuerpos cetónicos en la orina?, qué nombre recibe la presencia de cuerpos cetónicos en sangre y orina cuando
se encuentran en cantidades superiores a las normales?, bajo qué condiciones metabólicas se acumulan cuerpos cetónicos?
8. Este procedimiento se llama Reacción de Rothera, se fundamenta en la formación de un anillo color violeta
(ferropentacianuro). Es muy sensible al ácido diacético pero menor medida a la acetona; no permite detectar
ácido β-hidroxibutírico. Este método permite detectar alrededor de 1-5 mg/dL de ácido diacético y 10-25
mg/dL de acetona

8.1.1. Cuál es el fundamento químico en la prueba de Imbert para cuerpos cetónicos? (incluya ecuación química)
9. Este test se denomina Reacción de legal, donde el reactivo de Imbert (nitroprusiato de sodio y ácido acético)
reacciona con la acetona formando un anillo color violeta entre el amoniaco y la orina.

9.1.1. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la prueba de Imbert.

las muestras 1 y 2 de orina dieron positiva a este test, a excepción de la muestra de 3, esto que el color fue
amarillo, es decir no hay formación de ferropentacianuro. Es decir no se encuentra acetona en este muestra, ya
que no se encuentra el derivdo isontrado de la acetona,

9.1.2. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la prueba de Imbert pero suprimiendo la
adición de cristales de amonio. (incluya, si es necesario, la ecuación química general).

9.1.3. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la identificación de acetona en orina.

9.1.4. De dónde provendrá la acetona presente en orina?

. Normalmente, el cuerpo quema glucosa (azúcar) para obtener energía. Si las células no reciben suficiente glucosa, el
cuerpo quema grasas para conseguir energía. Esto produce una sustancia llamada cetona, que puede aparecer en la
sangre y en la orina. Los niveles de cetonas altos en la orina pueden indicar cetoacidosis diabética (CAD),
una complicación de la diabetes que puede causar coma e incluso la muerte. La prueba de cetonas en la orina puede
ayudarle a recibir tratamiento antes de tener una emergencia médica. las cetonas son positivas significa que no hay
suficiente insulina en el cuerpo.

9.1.5. Analice y justifique las diferencias entre los resultados obtenidos para las diferentes muestras en la identificación de proteínas y/o
aminoácidos en orina.

9.1.6. Qué tan normal es la presencia de aminoácidos y proteínas en orina?

Las proteínas son sustancias que son fundamentales para el funcionamiento correcto del cuerpo. Es normal que haya
proteínas en la sangre. Pero cuando hay un problema con los riñones, las proteínas pueden filtrarse a la orina. Aunque
una pequeña cantidad de proteínas en la orina es normal, una cantidad excesiva podría indicar una enfermedad de los
riñones. Los riñones toman material de desecho, minerales, líquidos y otras sustancias de la sangre para que sean eliminados a través
de la orina. La orina tiene cientos de diferentes desechos corporales. Las Proteínas. Normalmente, las proteínas no están presentes en la
orina. La fiebre, los ejercicios arduos, el embarazo y algunas enfermedades, especialmente la enfermedad de los riñones, podrían hacer
que la orina contenga proteínas.

9.1.7. Al analizar las pruebas de Biuret y Ninhidrina, a qué sustancias se deben las coloraciones obtenidas en cada caso?; si no hubo coloración con
biuret pero sí con ninhidrina, a qué se debe?.

Biuret: En un medio alcalino y en presencia de por lo menos 2 enlaces peptídicos, se forma un quelato de color
violeta. el reactivo también contiene tartrato de potasio sódico para acomplejar los iones cúpricos a fin de evitar
su precipitación en la disolución alcalina, e ioduro de potasio, que actúa como un antioxidante. La
absorbancia del quelato coloreado formado se mide a 540 nm. Cuando reaccionan los péptidos pequeños, el
color del quelato producido tiene tono diferente al que se observa con los péptidos más grandes. El
color varía de rosa a violeta rojizo. Además del grupo NHCO que se presenta en el enlace peptídico, los
iones cúpricos reaccionarán con cualquier compuesto que tiene dos o más de los siguientes grupos:
NHCH2 y NHCS. El método se nombró porque una sustancia llamada Biuret (NH 2CONHCONH)
reacciona con iones cúpricos de la misma manera. Debe haber un mínimo de dos de los grupos reactivos; por
tanto, los aminoácidos y los dipéptidos no reaccionarán.

Fig. 21, Formación del complejo de entre el Cu2+ y el N del enlace peptídico.

Como se observa en la tabla, todas las muestras dieron negativo a esta prueba, por lo que se concluye que no
hay proteínas en las muestras de orina.
Ninhidrina:
La prueba de la ninhidrina detecta la presencia de un exceso de aminoácidos en la orina y es positiva en muchas
enfermedades que se acompañan de aminoaciduria. Resulta útil sobre todo para la detección de aminoaciduria
generalizada. Sin embargo, la elevación de un solo aminoácido puede no ser detectada si la cantidad total de
aminoácidos en la orina no aumenta. Los resultados positivos deben ser seguidos por estudios de cromatografía
para aminoácidos. Orinas muy concentradas pueden dar resultados positivos falsos. En forma inversa, orinas
muy diluidas pueden contener cantidades significativas de un aminoácido, pero los resultados pueden dar
negativos.
Su fundamento químico es, fig. 23:
La ninhidrina descarboxila y desamina a aminoácido gracias a su poder oxidante. La ninhidrina reducida forma
reacciona con una molécula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la desaminación para
formar un compuesto complejo que presenta coloración violeta.

De esta forma se pueden determinar cuantitativamente los aminoácidos por espectrofotometría y también por
gasometría, gracias al CO2 que se forma. La coloración violeta es sensiblemente la misma para todos los
aminoácidos. Su espectro de absorción presenta un máximo en 570 nm. Algunos aminoácidos en particular,
como la prolina y la hidroxiprolina, dan con la ninhidrina una coloración amarilla con un máximo de absorción en
440 nm [7]. Se observa que todas las pruedas dieron positivas para este test, ya que viraron a morado es decir
que se encuentran aminoácidos en la orina.

10. Conclusiones (presentadas a partir de los objetivos planteados por cada uno, incluir los resultados generales obtenidos. El límite inferior de
conclusiones es de 5).

Al adicionar HgCl2, para inhibir la ureasa, también se produce HCl, por lo que este podría reaccionar con el
NH4OH formado provocando así un error en los cálculos para la cantidad de urea hidrolizada.
No se formaron cristales de ácido úrico, probablemente porque no se dejó el tiempo suficiente, además de que
las muestras de orina presentaban sales, que pudieron reaccionar con el HCl agregado, aumentando el pH.

Los glúcidos siempre están presentes en las muestras de orina, aunque a concentraciones diferentes debidas al
metabolismo de cada organismo.
Los esteroides, como el colesterol, se pueden presentar en las muestras de orina, dependiendo del metabolismo
del organismo y del consumo exógeno de esteroides.
La ninhidrina muestra la presencia de aminoácidos en las muestras, en todas ellas hubo un resultado positivo.
11. Bibliografía e Infografía (Normas Icontec o APA)
12. Becquerel, Alfred. A. Rodier Tratado de Química Patológica aplicada a la Medicina Práctica. Pág. 328.
13. Casares Gil, Antoni. Tratado elemental de Química General vol.1-2. Pág. 186.
14. Will, Heinrich, Tatado de Análisis Química publicado en Alemania. Pág. 305.
15. Perazzi, Beatriz. Angerosa, Margarita. Creatinina en Sangre: Calidad Analítica e influencia en la Estimación
del Índice de Filtrado Glomerular. En: Acta bioquímica clínica Latinoamericana. Vol. 45 no2. La Plata abr. /jun.
2011. Pág. 4.
16. Graff, Laurine. Análisis de Orina Atlas Color. Editorial Médica