NUMERO MAS PROBABLE o METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue
siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el
número de microorganismos en muestras de alimentos yaguas. Sin embargo, se ha
demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto, este
método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua,
tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de
microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el
medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado
o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores que se dejan crecer en medio
líquido. Por ejemplo, se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los
cuales se siembra 0.1 g. de muestra, en tres 0,01 g. y en los otros tres 0.001 g. Luego de la
incubación, se observan y cuenta el número de tubos positivos.

Según el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento

selectivo, o medios de propagación.
En función de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que:
a) hubo crecimiento
b) hubo crecimiento y se produjo gas que se ve en campana invertida (Durham)
c) hubo crecimiento y se produjo viraje de indicador
d) hubo crecimiento y se produjo pigmento
Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o sospechosos de
serlo a placa, o a otro tubo a efectos de confirmarlo.
El número (de tubos positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta
de esta etapa de confirmación, siendo el valor anterior sólo un valor presuntivo. Cada tubo
positivo, significa que en la cantidad de muestra en él sembrada había por lo menos 1
microorganismo de los que se está contando.
La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y en
general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en
cada serie de tubos.
Ejemplo 1:
Nº de tubos sembrados: 5 5 5
Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1
Número de tubos positivos: 2 0 0 (dos tubos positivos para la primera
dilución, ninguno en las siguientes)
De la tabla adecuada surge el valor: 5 en 100 mL
Se informa: Número más probable de (tipo de microorganismo) = 5/100mL
Ejemplo 2:
Nº de tubos sembrados: 3 3 3
Volumen por tubo (mL) 1 1 1
Dilución de la muestra: 10-2 10-3 10-4
Equivalente en gramos/tubo 0.01 0.001 0.0001
Tubos positivos 3 2 0
El resultado 3-2-0 se busca en tabla y se obtiene un valor de 93/gramo, cuando en la
primer serie de tubos se siembra 0.1 g, como en nuestro caso sembramos 0.01 gramos
debe aplicarse el factor de corrección = 0.1/0.01 o sea 10 por lo que el resultado a
informar es:
NMP de (tipo de microorganismo) = 930/gramo

Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que esté construída

para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual número de tubos por
serie, y para cantidades de muestra que sean múltipo o submúltiplo.
La corrección se hace utilizando proporcionalidad inversa.
 En todos los casos el valor informado se considera un índice de la carga microbiana, y
se conocen los límites de confianza para cada valor.
Cuando no se trabaja en las condiciones más comunes para las que existen tablas, es
posible calcular aproximadamente el valor de NMP usando la siguiente ecuación:

Ventajas y desventajas del método:

Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, menores
de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las
diluciones apropiadas.
Asimismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo
polvos insolubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni recomendable el
de placas debido a la presencia de partículas.
Se prefiere también este método cuando los microorganismos son de lento crecimiento,
o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación,
etc.).
Es posible enumerar también por este método microorganismos anaerobios utilizando
en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular,
e incuban en condiciones aerobias.

En la técnica de fermentación por tubos múltiples, los resultados se

expresan en términos de Número Más Probable (NMP) en 100 mL.
Este número está basado en ciertas fórmulas de probabilidad y es un
estimado de la densidad media de coliformes en la muestra.
La precisión de cada prueba es función de:
El número de diluciones realizadas que depende de la experiencia del
analista y la procedencia de la muestra; es inversamente proporcional.
Presencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con mayor
inóculo, directamente proporcional.
Ausencia de gas y turbiedad en algunos o todos los tubos con menor
inóculo, inversamente proporcional.
La técnica tiene 3 fases: presuntiva, confirmativa y completa. En la fase
presuntiva se utiliza el caldo lauril triptosa y la fase confirmativa para
coliformes totales utiliza el caldo verde bilis brillante y para coliformes
fecales el caldo EC. La fase completa se realiza para llevar un control de
calidad y permite establecer o no la presencia de coliformes.