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AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE

Escherichia coli
Angélica M. Arcila Lopera1, Ana M. Ávila García2

Resumen
Los plásmidos son ampliamente usados en el área de la biología molecular, dado
que son fáciles de manipular puesto que tienen un tamaño pequeño. Existen
diferentes métodos para aislar ADN plasmídico, siendo la más común, por su
rapidez y que se requiera de poco contenido de ADN plasmídico, la lisis alcalina. En
esta práctica se aisló y purificó ADN plasmídico de una cepa de ​Escherichia coli
transformada y con el de poder observar el ADN plasmídico en la electroforesis en
gel de agarosa. Los resultados no son los esperados debido a algunos errores
experimentales, por lo tanto se sugiere tener más cuidado al seguir el protocolo
sugerido.
Palabras clave: ​plásmidos, cultivo bacteriano transformado, biotecnología,
electroforesis plasmídica

Abstract
Plasmids are ​widely used in molecular biology area, ​given they are easy to
manipulate since they have a small size. There are differents methods for isolate
plasmid DNA, being the most common, because of its great speed and that its
requires little content of plasmid DNA, alkaline lysis. In this practice, plasmid DNA
was isolated and purified from a transformed Escherichia coli strain and with the
power of looking at the plasmid DNA in the agarose gel electrophoresis. The results
are not as expected due to experimental errors, therefore, it is suggested to be more
careful when following the suggested protocol.
Keywords: ​plasmids, ​transformed ​bacterial culture, biotechnology, plasmidic
electrophoresis

Introducción
Los plásmidos han sido usados como herramientas en diferentes áreas de la
biología como: la biotecnología y la biología molecular usandolos para la clonación
del ADN. Esto es gracias a su pequeño tamaño en comparación con los
cromosomas que facilita su extracción y su manipulación. Además, sus propiedades
de replicación y conjugación son de gran ayuda para el análisis genético. Existen
diferentes técnicas para aislar el ADN plasmídico, en esta práctica usamos el
método de extracción por lisis alcalina. Este método aprovecha las diferencias en el
tamaño y la superhelicidad que es el grado de torsión que sufre el ADN plasmídico
en contraste con el cromosomal. La mayoría de los cromosomas bacterianos, son

1
angelica.arcila@udea.edu.co
2
amaria.avila@udea.edu.co
moléculas circulares extremadamente grandes que no se encuentran
superenrollados, mientras que los plásmidos son moléculas pequeñas y
superenrolladas. Durante el proceso de extracción, se busca desnaturalizar el ADN
plasmídico y el cromosomal y posteriormente renaturalizar, con el fin de que el ADN
cromosomal, no se aparee rápidamente y pueda ser atrapado por complejos
proteicos, los cuales precipitarán; a diferencia del ADN plasmídico que rápidamente
se renaturaliza y adquirirá su conformación natural. (Rojas ​et al​., 2017). En esta
práctica se aisló y purificó ADN plasmídico de una cepa de Escherichia coli
transformada y con el de poder observar el ADN plasmídico en la electroforesis en
gel de agarosa.

Materiales y Métodos:
Los materiales y los equipos usados en esta práctica fueron: Cepa de ​Escherichia
coli transformada (12ml), isopropanol (2400 μL), tampón de Lisis ( 2100μL), lisozima
(150μL), ampicilina, tubos de centrífuga estériles, falcon® ( 20 mL), tubos de
microcentrífuga estériles Eppendorf – Tubos®. ( 1,5 mL), micropipetas, parafilm,
pipetas pasteur, RNasa A (Libre de ADNsa), 240 μL Acetato sódico (2,5 M), tampón
TE ( (1050μL) Tris-HCl, 10mM; EDTA, 1 mM (pH 8,0)), cloroformo (1800μL) ( Mezcla
cloroformo alcohol isoamilico ( 24:1, v/v), etanol al 99.6% (conservado a -20°C),
hielo, fenol (600μL), acetato de amonio, palillos estériles centrífuga a T°ambiente,
vortex, gel de agarosa al 0,8% con o Bromuro de etidio (BrEt) a una concentración
final de 0,5 ug/mL, marcador de peso molecular de 1Kb ADN Step Ladder, colorante
de carga, cámara de electroforesis y transiluminador ultravioleta.
Se siguió el protocolo sugerido en el manual de laboratorio (Vanegas ​et al​., 2018),
con algunos cambios; la monitora del curso realizó el cultivo celular de la cepa ​E.
coli resistente a ampicilina para la obtención ADN plasmídico. El estudiante Juan
Pablo alzate preparó el gel de agarosa al 0,8%, con Bromuro de etidio a una
concentración final de 0,5 ug/mL. Luego cada pareja realizó dos muestras de ADN
plasmídico, para un total de 8 muestras. Primero se aisló el ADN plasmídico, luego
se purificó y se aumentó la concentración con etanol, siguiendo el protocolo (se
cambiaron algunos volúmenes sugeridos en la guia y estos están especificados
junto con los materiales) para finalizar se ejecutó el ADN de plásmido en un gel de
agarosa, por falta de tiempo no se realizó la cuantificación de ADN.

Resultados
Después de realizar el protocolo sugerido por Vanegas ​et al​. (2018), donde se aisló,
purificó y posteriormente se corrió el plásmido en un gel de electroforesis (Fig. 1), se
obtuvo un gel que se esperaba se observaran bandas gruesas en cada uno de los 8
pozos donde se colocaron las muestras de ADN plasmídico.
Al visualizar las bandas de ADN del gel en el transiluminador UV (Fig. 2) se puede
observar que de las 8 muestras de ADN plasmídico corrido, sólo una muestra se
puede ver con una banda delgada color anaranjado fluorescente en la parte superior
del gel en el pozo A1 y una leve banda anaranjado fluorescente muy delgada e
indeleble, en la parte superior correspondiente también al pozo A2, casi al borde del
gel, correspondiente a nuestro equipo de trabajo, las otras 6 muestras no se
observan en el gel de agarosa, ni las bandas de Marcador de peso molecular (P1 y
P2).

Fig. 1. Orden de los pozos. ​P1,P2 Marcadores de peso molecular, JP1 y JP2
muestras de Juan Pablo Alzate, J1 y J2 muestras de Jessica Wagner. A1 y A2
muestras de Angélica Arcila y Ana Maria Avila, S1 y S2 muestras de Sebastian
Sánchez y Cristhian Tomann

Fig.2. Gel de agarosa en el transiluminador UV. ​La obtención exitosa del


plásmido se observa con una banda anaranjada (encerrada en el círculo),
correspondiente al pozo A1.

Análisis de Resultados y Discusión


El método de extracción alcalina fue diseñado para prevenir la generación de la
forma "irreversiblemente desnaturalizada"; al mismo tiempo, los extractos deben ser
lo suficientemente alcalinos para que ocurra la desnaturalización del ADN
cromosómico (Holmes & Quigley, 1981). Este es uno de los métodos más usados,
por lo tanto se espera que los resultados obtenidos sean positivos ya que se siguió
paso a paso el protocolo sugerido en el manual de laboratorio de Biotecnología
general (Vargas ​et al.​, 2018), pero c​omo se puede visualizar en la Figura 2, la
aislación, purificación y la electroforesis de las muestras de ADN plasmídico no fue
muy exitosa, obteniéndose una banda muy delgada de color anaranjado
fluorescente en la parte superior del gel correspondiente al pozo A1 y una banda
casi indeleble en la parte superior del gel correspondiente al pozo A2, que da cuenta
de la obtención del plásmido de ​Escherichia coli. Esto pudo deberse a que no hubo
una adecuada lisis alcalina de la pared celular y/o una buena emulsión de los lípidos
de la membrana celular; no hubo una buena precipitación luego de adicionar la
solución tampón o la solución de isopropanol, porque pudo no haber sido suficiente
para la cantidad de plásmido que se tenía o pudieron haber quedado ADNasas en la
solución que dañaron la molécula de ADN (Cevada y Morales, 2018).
Además se puede observar que en la electroforesis la cual es una técnica de
separación y caracterización de moléculas utilizando un campo eléctrico en función
del tamaño y carga eléctrica de la molécula, así pues el, ADN teniendo carga
negativa se esperaba que migrara a través de los poros de la matriz hacia el lado
con carga positiva (abajo) y la tinción del gel con bromuro de etidio, que es una
sustancia fluorescente se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz
ultravioleta (en el transiluminador violeta), permite observar el resultado de ésta
migración (Cevada y Morales, 2018), pero debido a que hubo un error técnico a la
hora de colocar los electrodos, (estos se colocaron con el cátodo en la parte
superior en vez de la parte inferior y el ánodo en la parte inferior), y la peinilla en la
cámara de electroforesis, las muestras corrieron hacia el lado contrario de donde se
esperaría (hacia arriba), por esta razón las bandas fluorescentes se observan en la
parte superior del gel. Podemos decir que una de las muestras (A1) de nuestro
aislamiento del ADN plasmídico de ​E. coli ​fue algo exitoso, ya que se observa en el
gel de electroforesis solo una banda anaranjada fluorescente delgada, se esperaba
que la banda fuese más gruesa ya que al ser una molécula de plásmido, éstas tiene
un gran peso molecular y por lo tanto no correría mucho en el gel. Por otro lado, la
otra muestra (A2) no fue tan exitosa puesto que se observa una banda casi
imperceptible, esto debido a que posiblemente no se tuvo el suficiente cuidado y/o
rapidez a la hora de realizar todos los procedimientos sugeridos en la guía (Vanegas
et al.​ , 2018).
También es posible que la otra banda haya corrido un poco más, pero debido a que
las muestras corrieron hacia el lado contrario del que se esperaba, no se pudo
observar mucho.
Usando el método de extracción por lisis alcalina se puede obtener entre 100-500
µg de ADN partiendo de 1.5 mL de cultivo de bacterias en fase exponencial con un
moderado número de copias (10 a 20 por bacteria). Pero la pureza y cantidad del
ADN dependerá de los siguientes factores: Primero, a mayor tamaño del plásmido,
menor cantidad y pureza de ADN. Segundo, a mayor número de copias del
plásmido, mayor cantidad de ADN. Tercero, cepas que producen grandes
cantidades de carbohidratos deterioran la pureza del ADN e interfieren con la
actividad de las enzimas de restricción. (Checa, A. 2017). Debido a que por falta de
tiempo no se pudo realizar la cuantificación no se sabe que cantidad de ADN
plasmídico obtuvimos ni cuán puro era.

Conclusiones
Se aislaron, purificaron y corrieron en gel de agarosa 2 moléculas de ADN
plasmídico de ​E. coli ​(correspondiente a nuestro equipo)​, d
​ e las cuales sólo una fue
exitosa evidenciándose en la electroforesis; para que este tipo de prácticas sean
exitosas se recomienda tener más cuidado y rapidez a la hora de realizar cada uno
de los pasos sugeridos en el protocolo, como no hablar encima de las muestras y
esperar los tiempos estipulados.
Las muestras se visualizan en la parte superior del gel debido a que no se tuvo
cuidado al poner los electrodos y la peinilla en la cámara de electroforesis, por lo
tanto se sugiere más cuidado a la hora de realizar este paso.

Agradecimientos
El equipo de trabajo agradece a Ángela, la monitora por haber preparado el cultivo
de cepas transformadas de ​E. coli ​y los demás reactivos y equipos usados en esta
práctica, también a la profesora Ana María Mesa por asesorarnos y acompañarnos
en cada paso de la práctica. A Juan Pablo Alzate por preparar el gel donde se
realizó la electroforesis y a Sebastián Sánchez por preparar cada muestra con el
colorante de corrido y colocar cada muestra en los pozos del gel.

Referencias

Cevada, K. J., & Morales, L. L. (26 de Agosto de 2017). ​AISLAMIENTO DE


DNA PLASMÍDICO​. Obtenido de SCRIBD:
https://es.scribd.com/document/362210870/DNA-Plasmidico-Bq
Holmes, D., & Quigley, M. (1981). A rapid boiling method for the preparation
of bacterial plasmids. ​Anal Biochem​, 114(1):139-7.
Rojas, A. C., Santillan, O., & Andrade-Dominguez, A. (26 de Agosto de 2017).
Método: Extracción de ADN plasmídico (Lisis alcalina modificado).
Obtenido de Conogasi, Conocimiento para la vida:
http://conogasi.org/articulos/metodo-extraccion-de-adn-plasmidico-lisis-
alcalina-modificado/
Vanegas, A. M., Fonegra, Z. M., & Urrea, A. I. (2018). ​Manual de Laboratorio
de Biotecnología General.​ Medellín.

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