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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LEVADURAS Y BACTERIAS ACTICAS

INTRODUCCIN

El uso de la Biotecnologa en los ltimos aos ha tomado gran fuerza en la elaboracin de productos que requieren procesos industriales por medio de la utilizacin de microorganismos productores de diferentes sustancias como el etanol. En este trabajo se quiere dar a conocer los primeros procesos que se deben realizar en el laboratorio de microbiologa como primera medida para entender y realizar estos procesos , para de esta manera lle ar a cabo todo lo relacionado con las produccin industrial, aplicada al proyecto de formacin, OBTENCION DE VINAGRE A PARTIR DE LA PIA GOLDEN MATERIA RICA EN CARBOHIDRATOS SIMPLES A TRAVS DEL USOS DE LA BIOTECNOLOGA Y / O PROCESOS QUMICOS. ! lo largo del informe se podr" encontrar el desarrollo de temas relacionados con# caracterizacin de bacterias y le aduras de inter$s, realizacin de medios de culti os, siembras en superficie ,frotis, diluciones, aislamientos por estra, obser acin al microscopio, incubacin, tincin de %ram, prueba bioqumicas para le aduras y bacterias ac$ticas entre otros que permiten poder realizar an"lisis para la toma de decisiones que apliquen al proyecto de formacin y a su ez a la formacin integral como tecnlogos.

1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL !islar le aduras y bacterias ac$ticas para la obtencin de inagre a partir de la materia prima &pia' y la bebida alcohlica &chicha'.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

(dentificar los medios en los cuales crecen bacterias ac$ticas y le aduras para determinar su ptimo desarrollo y aislamiento

)ealizar los diferentes medios de culti o para el aislamiento de bacterias y le aduras.

)ealizar las respecti as siembras para las bacterias y le aduras.

)ealizar la identificacin macroscpica y microscpica de la obtencin de las respecti as siembras.

)ealizar el frotis y tincin de %ram para la isualizacin microscpica para la posible identificacin de los respecti os microorganismos

)econocer las principales caractersticas para identificar bacterias ac$ticas y le aduras al microscopio segn su color, forma, tamao, ele acin etc.

)ealizar pruebas bioqumicas que permitan identificar las caractersticas pre*establecidas para los microorganismos sospechosos.

.1 MARCO TERICO .1 LEVADURAS C!"!#$%"&'$(#!' +on organismos unicelulares cuya identidad es ser hongos, son organismos eucariotas y hetertrofos, las cuales se nutren por absorcin, presentan paredes celulares formadas de quitina, su funcin es la fermentacin de material org"nico, su reproduccin es por gemacin. M)"*)+),&!

+u morfologa se determina mediante obser acin microscpica. En donde su color se puede identificar de tono beige y la forma de una le adura puede ser o oide o esf$rica, alcanzando un tamao de , a - micrmetros de di"metro y de . a /0 micrmetros de longitud tomando formas como de limn, piriforme, cilndrica, triangular e incluso alargada formando un falso o erdadero micelio, las cilndricas F(, 1. V('$! +%4!01"!' !+ 5(#")'#)/() 1icelio# formacin de largas cadenas que pueden medir de , a 2 micrmetros de ancho y de , a - micrmetros de largo. pueden ser muy alargadas. Ver figura 1

H-.($!$ 3as le aduras se encuentran en la superficie de las plantas o el suelo, algunas eces se les puede encontrar en organismos descompuestos, la mayora se encuentran en ambientes naturales y en algunas frutas y alimentos. !lcanzan un p4 ptimo de 2,0 a 0,5 y una temperatura ptima de ,567 a .567.

R%/")01##(23 3as le aduras tienen un tipo de reproduccin ase8ual o por gemacin. 9ienen los dos ciclos.

F('()+),&! El metabolismo de las le aduras debe ser anaerobias, en donde estas descomponen el azcar para la obtencin de alcohol y agua en donde se pueden encontrar en frutas en descomposicin y:o fermentados de baja calidad.

N1$"(#(23 3as le aduras requieren de nitrgeno, o8igeno, itaminas, "cidos grasos,

minerales, micronutrientes, azucares o material en descomposicin.

P"1%.!' .()61&5(#!'

;ermentacin de azucares

(nocular la le adura en un tubo que contenga carbohidratos, rojo fenol y un tubo drham in ertido, si la le adura fermenta cambia de color a amarillo, se incuba a .<67 por 2- horas. 7recimiento a diferente temperatura =tilizar medio +>! en plato e inocular la le adura a ,067 y .<67. ?rueba ureasa

+e utiliza un medio que contenga urea, se inocula y se incuba la le adura a ,267 el medio tiene rojo fenol como indicador de p4. ?ositi o# cambia de color &a fucsia' @egati o# permanece amarillo &acido'

.2 BACTERIAS ACTICAS C!"!#$%"&'$(#!' +e tratan de bacterias que son bacilos %ram negati as, en los g$neros acetobacter y gluconobacter, o8idando muchos alcoholes y "cidos org"nicos, algunas producen celulosa, pueden aislarse f"cilmente del inagre M)"*)+),&! +on bacterias en donde sus c$lulas son cilndricas, alcanzan un tamao entre 5,A y . milimicras. +on bacilos %ram negati os. H-.($!$ Estas bacterias se encuentran en fermentados de baja calidad, maltas y frutas en descomposicin. F(, 1. V('$! B!#(+)' G"!5 N%,!$(4)' !+ 5(#")'#)/() >esarroll"ndose en un p4 optimo B0. R%/")01##(23 3a reproduccin de las bacterias es un proceso ase8ual o por gemacin. F('()+),&! 3as bacterias tienen un metabolismo aerobio estricto, en donde o8idan los azucares o alcoholes en etanol o a "cido ac$tico y necesitan tener acceso al agua para poder i ir. Estas se desarrollan en donde encuentren fuentes de carbono &glucosa o etanol'.

N1$"(#(23

+u nutricin est" dada por compuestos alcohlicos como el etanol, son organismos quimiorganotrofos, su nutricin tambi$n se haya en compuestos org"nicos y sus componentes degradados o deri ados, tambi$n de algunas sales. P"1%.!' .()61&5(#!'

P"1%.!

P")/2'($) *>eterminar si la bacteria a tra $s de Triptofanasa ?uede degradar el 9riptfano a indol. *>eterminar si hay produccin de 4,+ a partir de amino"cidos azufrados *>eterminar si la bacteria es m il.

I3)#1+!#(23 7 $"!$!5(%3$)

R%'1+$!0)' P)'($(4) N%,!$(4) !marillo, la )ojo &anillo' F bacteria no presencia de puede indol degradar el &triptfano fue triptfano degradado'. @egro &precipitado', produccin de 4,+ 1edio de culti o se queda igual.

+(1

,2*2-h: .<C7 Estocada hasta el fondo ?ara (ndol# , a . gotas del reacti o de Do acEs.

3a bacteria >ifuminacion slo crece de la bacteria en la lnea hacia los de lados inoculacin Giraje amarillo despu$s de unos das, regresa a su iraje erde. 7recimiento de la colonia sembrada

Gerde Bromocresol

>eterminar la produccin de "cido ac$tico

.<C7 ,2 a 2- horas

+e mantiene igual

%H7 en Etanol

>eterminar la capacidad de resistencia a etanol en posibles bacterias ac$ticas

,A a .< 7 2- horas en incubacin

7recimiento de colonias con produccin de etanol

?ermanece igual

7atalasa

>eterminar si la bacteria produce catalasa para degradar el 4,I,.

/ gota de 4,I, a una colonia

Efer escenci a

?ermanece igual

8. MTODOS 8.1 METODOS GENERALES

CULTIVO

?esar los componentes segn requiera para culti os ?>! y %H7 >isol er en agua.

7alentar a punto de ebullicin.

Esterilizar en el autocla e la mezcla y el material.

+er ir el culti o en cajas de ?etri.

>ejar solidificar y lle ar a la ne era.

;(@

SIEMBRA

)ealizar las diluciones necesarias con las muestras que se desean sembrar. ?reparar el material necesario para el momento de la siembra.

En presencia de la llama empezar la siembra en el culti o respecti o, sembrando /m3 de la disolucin sobre el culti o empezando por la de menor concentracin.

4omogenizar la muestra con el asa de idrio diagonal, horizontal y erticalmente.

9apar el culti o, reunirlos y forrarlos.

3le ar a incubadora con el tiempo y la temperatura necesaria, durante <, horas a ,A 7

;(@ DILUCIONE S ?repare pre iamente agua peptonada segn lo requiera. En una probeta tome J5m3 de agua peptonada y /5m3 del sustrato disolucin /5*/.

9omar en un tubo de ensayo de la dilucin anterior y tome /m3 y ll$ elo a /5 ml con agua peptonada.

)epita el proceso en arios tubos las eces que sean necesarias.

;(@

FROTIS

7oloque una gota de agua en el centro del portaobjetos con aza esterilizada. ;lamear el asa y esperar su enfriamiento.

9omar una cantidad pequea de culti o y lle ar a la gota de agua.

4omogenizar la mezcla con el asa

Esperar la e aporacin del lquido.

?asar por la llama de 2 a 0 eces.

;(@

TINCIN DE GRAM

4acer el frotis.

!gregar cristal ioleta durante un minuto.

3a ar.

!gregar lugol durante un minuto.

3a ar.

!gregar alcohol cetona durante .5 segundos.

3a ar.

!gregar fucsina durante un minuto.

3a ar y dejar secar.

3le ar al microscopio, agregar aceite.

;(@

8.2. PRUEBAS BIOQUIMICAS

VERDE BROMOCRISOL

?reparar una solucin de erde Bromocrisol al ,.,K &,.,g de erde Bromocrisol por cada /55 ml de 4,I y @aI4 /@ .ml por cada /55 ml de 4,I'

3a solucin deber" tener# L.K de e8tracto de le adura L,K de agar L5./K de la solucin de erde Bromocrisol

Llevar a esterilizar

!gregar alcohol al /0K

Gerter en los tubos de ensayo con inclinacin.

>ejar solidificar en pico de flauta

;(@

SIM

+u medida base fue /55 ml de 4,I y .5 g de +(1 en pol o +e necesit 0 tubos de ensayo los cuales daban un an"lisis de /./2 g de +(1 en pol o en .<.0 ml de 4,I

+e lle a esta mezcla ha calentamiento

Gerter en cada tubo de ensayo <.0 ml de +(1

;(@

GYC EN ETANOL AL 19: +e mide ,5 ml de agua des ionizada que se encuentra en calentamiento

+e le agrega Ag de glucosa
Luego se le agrega 1.2g de levadura

!gregar 5.Ag de carbonato de calcio

+e agrega ,.2g de agar agar

+e lle a al autocla e para esterilizar

Una vez realizado el proceso en el autoclave se mezcla con una solucin de etanol al 15% agitando repetitivamente

Se dispone en la caja de Petri para ser inoculadas una vez se solidifique esta.

;(@

PRUEBAS BIOQUMICAS DE LAS LEVADURAS

?ese 5.J<0 g de lactosa, sacarosa y manitol y diluya cada una en J0.< ml de agua

>iluya <.0 ml de las soluciones en tubos de ensayo para un total de /. tubos por cada solucin de carbohidratos

!gregue a la solucin de sacarosa 5.,J g de peptona

(ntroducir a cada tubo una campana >urham

3le ar a la autocla e

(ntroduzca las colonias en los tubos de lactosa, sacarosa y manitol con ayuda del asa

3le ar a incubadora por .A 67

Ibser ar durante arios das si hay presencia de 7I, o hay turbidez

;(@

9. RESULTADOS C1+$(4)'# se realizaron /5 culti os de los cuales ?>!MM 2 cajas de ?etriM.,5 ml N -5ml %H7MMA cajas de ?etriMM,5ml N /,5ml 9otalMMMMMMMMMMMMMM.,55ml PDA ;,/L 8N

.JgMMM/555ml OMMMM.-5ml

A,1! /%/$)3!0! 19,/L 8N

/0gMMM../555ml OMMM..,,0ml GYC<.12=5+ G+1#)'!

05gMMM/555ml 8MMM./,5ml 3%4!01"!

8N

/5gMMM/555ml OMMMM./,5ml

8N

C!".)3!$) 0% #!+#() 8N

0gMM./555ml OMMM/,5ml A,!"> !,!"

,5gMM../555ml

8N

OMM../,5ml !gua peptonada F ,,0ml / dilucin * J5ml , dilucin * J5ml 0 tubos * Jml * 20ml IDENTIFICACION

I0%3$(*(#!#(23 5!#")'#2/(#! 1uestr a 7hicha /5*. 7hicha /5*. 7hicha /5*2 7hicha /5*/ ?ia /5*
. .

1edio ?>! ?>! %H7 %H7 %H7 7oloni a / , / , / , .

;orma 7ircular circular circular circular I alad a 7ircular circular

7olor Blancas brillantes beige beige

9e8tura Bordes 3isa lisa lisa

Ele acin 9amao 5.55/mm /mm /..mm 5.52mm 5.Jmm 5.5/mm .mm

>efinido ?lana >efinido 7nca o definido definida 7nca o plana

Blanco lisa transparente Beige 3isa Blanca beige 3isa

?ia /5* %H7 ?ia/5*


.

(rregula 7nca o r >efinido ?lana 7nca o

%H7

! tercio (rregula pelado r

I0%3$(*(#!#(23 5(#")'#2/(#! COLONIA / . 2 FORMA I alada I alada circular Bacilos GRAM @:! @:! &*' TAMAO 1ediano 1ediano ?equeas COLOR 1orado 1orado 1orado 3e adura 3e adura Bacterias

0 A

I alada alargad I alada

@:! @:!

?equeo ?equeo

1orado 1orado

3e adura 3e adura

?. AN@LISIS DE RESULTADOS

PIA A+%4!01"!'BC

7omo se ha informado anteriormente en las pruebas bioqumicas podemos concluir un an"lisis en el cual se erifica la presencia de le aduras en la muestra de la pia ya que en los respecti os an"lisis de %lucosa sin etanol, %lucosa con etanol, 3actosa sin produccin de 7I, y +acarosa igualmente sin produccin de 7I, nos han arrojado pruebas positi as con e8cepcin del manitol el cual dio negati o.

CHICHA A+%4!01"!'BC

En esta muestra hemos obtenido un an"lisis positi o para le aduras procedimos con las mismas pruebas para la pia d"ndonos como resultados positi as para la glucosa sin etanol sin produccin de 7I,, sacarosa igualmente sin produccin de 7I,, en la prueba de la lactosa dio negati a sin produccin de 7I,, as mismo la prueba de la glucosa con etanol dio negati a.

PIA AB!#$%"(!'BC

En este procedimiento hemos seleccionado una colonia sospechosa aislada a partir de pia a la cual se le han realizado los siguientes an"lisis bioqumicos para bacterias +(1 el cual nos dio negati o sin mo ilidad, negati o para (ndol y catalasa negati o tambi$n procedimos con el an"lisis de erde Bromocrisol el cual nos dio negati o pues no hubo coloracin.

PRUEBAS BIOQUIMICAS AR%'1+$!0)'BC

?(P! &le aduras'#

L%lucosa sin etanol L%lucosa con etanol L3actosa L1anitol L+acarosa

N N N N N

&Q' 7on produccin de 7I, &Q' 7on produccin de 7I, &Q' +in produccin de 7I, &*' &Q' 7on produccin de 7I,

74(74! &le aduras'#

L%lucosa sin etanol L%lucosa con etanol L3actosa L1anitol L+acarosa

N N N N N

&Q' +in produccin de 7I, &*' &*' &*' &Q' +in produccin de 7I,

?(P! &Bacterias'#

L+(1 L(ndol L7atalasa LGerde Bromocrisol

N N N N

&*' @o posee mo ilidad &*' &*' &*' @o hubo coloracin

D. CONCLUSIONES

+e pudo determinar los medios de culti o &%H7 para bacterias y ?>! para le aduras' y las condiciones de manejo, m"s adecuadas para el aislamiento de le aduras y bacterias ac$ticas para obtener de inagre a partir de la materia prima &pia' y la bebida alcohlica &chicha'. +e identific las principales colonias sospechosas de nuestros culti os tanto le aduras como bacterias ac$ticas y as poder determinar cu"les en realidad son le aduras o bacterias ac$ticas a tra $s de obser aciones al microscopio.

?ara realizar las diferentes obser aciones tanto macroscpicas como microscpicas, era necesario obser ar el culti o en las cajas de crecimiento y aparte realizar un respecti o frotis y tincin de %ram para determinar sus caractersticas.

+e

determinaron

las

pruebas

bioqumicas

ptimas

para

la

identificacin de posibles le aduras las cuales fueron la de glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, glucosa con etanol, en las cuales obtu imos resultados positi os para todas con e8cepcin la del manitol.

+e

determinaron

las

pruebas

bioqumicas

ptimas

para

la la

identificacin de posibles bacterias ac$ticas las cuales fueron

prueba de catalasa y erde bromocresol, de las cuales se concluye

que no hubo crecimiento ni cambio de color por lo cual son pruebas negati as.

+e concluy que es posible la obtencin de le aduras tanto de la materia prima &pia' como la de la chicha as que es posible obtener le aduras a partir de estos fermentados pero no pudimos obtener bacterias ac$ticas.

E. RECOMENDACIONES

)ealizar los procesos y apuntes necesarios de la manera m"s ordenada y concreta posible para e itar errores y confusiones al momento de analizar resultados.

9ener las debidas precauciones a la hora de realizar las respecti as siembras, culti os, aislamientos, pruebas bioqumicas y de m"s procedimientos que contenga manipulacin de microorganismos.

)otular adecuadamente

todo el material con el que se realicen

procesos anotando toda la informacin necesaria para poder identificar con facilidad e itando confusiones, perdida de material y tiempo.

9rabajar cumpliendo todas las condiciones necesarias de asepsia y esterilidad adem"s de proteccin personal que nos permitan asegurar la calidad de los ensayos

BIBLIOGRAFA Biologa de los microorganismos F B)I7D ?ruebas bioqumicas para la e identificacin de bacterias de importancia clnica F. Edicin F Editorial medica ?anamericana * 1ac;addin * p"g. 02 F <. F ,5A * .5A. 1icrobiologa (ndustrial F !licia 4ern"ndez * ?"g. A El inagre de ino * 7onsejo de superior de in estigaciones cientficas * ?"g. AJ C(.%","!*&! http#::RRR.microinmuno.qb.fcen.uba.ar:+eminario1edios.htm https#::sites.google.com:a:goumh.umh.es:practicas*de* microbiologia:indice:preparacion*de*medios*de*culti o http#::es.scribd.com:doc:0,5.522:1edios*de*7ulti o*y*?ruebas*Bioquimicas