Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto.

de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

Informe N1 Laboratorio de Microbiologa de los alimentos I Profesores: Dra. Denisse Bravo R. - Dr. Jos M Prez D

Procedimientos Bsicos en Microbiologa: Siembra y Morfologa Bacteriana

Francisca Anrquez A. Vctor Escobar L

Santiago 15/12/2011

Resumen: Los microorganismos y en particular las bacterias, tiene una rol fundamental en la industria alimentaria pues se han utilizado desde la antigedad en la elaboracin de diversos productos como pan, lcteos,, vinagre. Sin embargo existen bacterias que son perjudiciales para la salud. Es por esto que se han desarrollados diversas tcnicas de cultivos, para poder aislar colonias puras y estudiarlas macro y microscpicamente. Y as prevenir o potenciar su desarrollo.

js

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

Introduccin: Los microorganismos y en particular las bacterias, tiene una rol fundamental en la industria alimentaria pues se han utilizado desde la antigedad en la elaboracin de pan y productos lcteos (bacterias del cido lctico), vinagre (bacteria del cido actico) y en la elaboracin de cervezas y vinos (levaduras). (Schlegel, 1997). Sin embargo existen bacterias que son perjudiciales para la salud, como la responsable del clera (Vibrio cholerae), neumona (Streptococcus pneumoniae), entre otras. (Tortora, 2007). Por esto se han desarrollado diversas tcnicas para cultivar bacterias, las que posteriormente sern utilizadas en diversos procesos. O bien para aislarlas, clasificarlas y estudiar su morfologa, determinando protocolos para controlar y/o evitar su presencia en alimentos, en el caso de bacterias patgenas. Mediante tcnicas de cultivos, como en medios de cultivos slidos (agar), se han podido aislar colonias de bacterias puras, las que estn formadas a partir de una bacteria, la que mediante fisin celular se replic exponencialmente dando origen a una poblacin clonal. Por esto es muy importante trabajar con tcnicas estriles, para obtener efectivamente cultivos puros. Debido a que cada bacteria forma colonias caractersticas, en cuanto a color, forma, tamao, etc. Es posible realizar un estudio macroscpico, comparando el cultivo obtenido con los descritos en literatura. Es importante seleccionar el medio de cultivo adecuado, de acuerdo al tipo de microorganismo a estudiar. El medio

APD (Agar Papa Dextrosa) desarrollo de hongos y mientras que el medio LB crecimiento de diversas (Tortora, 2007)

permite el levaduras, permite el bacterias.

Debido al tamao de las bacterias (110 m), deben ser estudiadas bajo el microscopio, Si se utiliza uno ptico, las bacterias previamente se tien de acuerdo al parmetro a estudiar. (Tortora, 2007) Tincin simple: se utiliza safranina o azul de metileno para observar la morfologa de la bacteria. Tincin diferencial: se utiliza para clasificar las bacterias, por ejemplo la tincin de Gram, separa las bacterias en dos grupos, de acuerdo a caractersticas de la membrana. Tincin estructural: es utilizada para estudiar la presencia de estructuras especficas, por ejemplo para visualizar la cpsula, se utiliza tinta china en un mtodo de tincin negativa. Para visualizar las esporas se utiliza una tcnica con verde de malaquita. El presente trabajo tuvo como objetivos, manipular y observar cultivos bacterianos, sembrar bacterias en diferentes medios de cultivos, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas y observar macro y microscpicamente diversos microorganismos.

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

Materiales y Mtodos: Materiales: Placas petri con APD y con LB Agar , un tubo con LB Agar y uno con caldo LB, 2 asas (una con loop y la otra sin loop), una micropipeta, rastrillo de vidrio, placa con muestra de Staphylococcus aureus (medio solido) , tubo con muestra de Escherichia coli (medio liquido), incubadora, microscopio, safranina, azul de bromotimol. Composicin LB Agar: Extracto de Levadura, Triptona y NaCl. Composicin APD: papa, Sacarosa, Sulfato de Amonio y Cloranfenicol. Procedimientos: I Siembra y aislamiento -Con un asa con loop se extrae una colonia de S. aureus y se siembra en una placa con LB Agar (tcnica solido a solido). -Con una micropipeta se extrae 1 ml de la solucin con E. coli y se coloca en el centro de una placa con LB Agar, posteriormente se esparce con el rastrillo de vidrio por toda la placa (tcnica de liquido a solido por extensin). - Se sumerge un asa sin loop en la solucin de E. coli y luego se lleva al tubo con LB Agar y se entierra (tcnica liquido a solido por profundidad). -Con un asa con loop se extrae una colonia de S. aureus y se sumerge en el tubo con caldo LB (tcnica solido a liquido).

II Contaminacin ambiental -Obtener una muestra de la superficie del mesn y sembrar en la mitad de una placa con LB Agar. Despus de esto, se limpia la superficie con alcohol y se vuelve a extraer una muestra del mesn y se siembra en la otra mitad de la placa. Luego se repiten los pasos anteriores, pero en vez de una placa con LB Agar se usa una con ADP. -Dejar una placa con LB Agar y otra con APD abierta expuesta al ambiente por ms de 15 min. Precauciones: Llevar todas las muestras a la incubadora y dejar ah por ms de 24 hrs. Realizar siempre los procedimientos de siembra cerca de un mechero encendido. Esterilizar siempre el asa con la llama de un mechero. III Tinciones -Para la tincin de Gram, sobre la muestra fijada en el porta objetos se agrega cristal violeta, luego se agrega yodo como fijador, posteriormente se decolora con alcohol y finalmente se le agrega safranina como contraste. Lo tenido morado corresponde a Gram+ y lo de color rosado a Gram-Tomar una muestra de Escherichia coli colocar en un portaobjetos, secar en un mechero y teir con safranina. Dejar que se tia por ms de 5 min. -Tomar una muestra de Staphylococcus aureus y colocar en un portaobjetos, secar en un mechero y teir con azul de bromotimol. Dejar que se tia por ms de 5 min. -Finalmente limpiar las muestras del portaobjetos con alcohol y observar en el microscopio con una ampliacin de 10x , 40x y 100x.

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

Resultados: I Siembra y aislamiento

Figura N3: Cultivo de E. coli mediante el mtodo de siembra de medio liquido a solido por extensin

Se aprecia un crecimiento homogneo de colonias de E. coli por toda la placa

Figura N1: Cultivo de S. Aureus por mtodo de siembra de medio solido a solido.

Al lado izquierdo de la imagen se aprecia un crecimiento ms homogneo de colonias de aproximadamente 1 mm de dimetro. Por otra parte al lado de derecho se observa un crecimiento de colonias muchos ms agrupadas.

Figura N4: Cultivo de E. coli mediante el mtodo de siembra de medio liquido a solido por profundidad

Se aprecia un crecimiento de E. coli en la superficie de LB Agar, pero no se aprecia el surgimiento de colonias ya que estas se encuentran muy agrupadas en el medio de cultivo
Figura N2: Implementacin errnea del mtodo de siembra de medio solido a solido

Se sembr de forma incorrecta la muestra de S. aureus en el LB Agar. En comparacin con la Figura N1, en esta placa se logra apreciar el crecimiento de un microorganismo mas amarillo al lado izquierdo de la imagen y otro de color mas blanco al lado derecho de la imagen. Por otra parte, tampoco se logra apreciar el surgimiento de colonias claramente diferenciadas.

Figura N5: Cultivo de S. aureus mediante el mtodo de siembra de medio solido a lquido.

En el caldo LB no se aprecia el surgimiento de colonias, sino ms bien un cambio en la turbidez del liquido

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

II Contaminacin ambiental

varias colonias juntas. Y finalmente se tiene un MO de color caf oscuro en el centro, aclarndose hacia los bordes, filamentoso y de gran tamao.

Figura N6: cultivo en medio APD de microorganismos presentes en la superficie del mesn

Se observa en el crecimiento de un hongo de gran tamao de color blanco elevacin redonda, y pequeas colonias muy similares que difieren en el color, pues la del lado derecho de la imagen posee un color amarillo, mientras que las del lado superior son de una color blanco. En la zona limpia del mesn no se desarrollaron crecimientos de colonias. La lnea fue mal trazada originalmente, por eso se aprecian dos linas de separacin.

Figura N8: cultivo en medio APD de microorganismos presentes en el ambiente

Se observan dos tipos de colonias, ambas de similar tamao y forma (pequeas y circulares), sin embargo una es de color blanco y la otra anaranjada.

Figura N9: cultivo en medio LB Agar de microorganismos presentes en el ambiente

Figura N7: cultivo en medio LB Agar de microorganismos presentes en la superficie del mesn

En el lado derecho de la imagen (superficie sucia), se observa el crecimiento de tres microorganismos (MO) diferentes. Una colonia es de color rosado, forma circular, elevacin en el centro, y borde entero. La otra es de color blanco opaco, de borde lobulados, parece el desarrollo de

Se desarrollaron tres tipos de colonias, todas circulares de bordes definidos, de colores blanco, anaranjado y amarillo, sobre esta ltima se observa que su crecimiento se vio afectado por otra colonia, lo que la deform. En las colonias anaranjadas se observan diferencias de tamao.

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

III Tinciones

Discusin: Respecto a los mtodos de siembra y aislamientos, se tiene que el mtodo de liquido a solido por extensin es donde se obtuvo mayor numero de colonias. En comparacin con el mtodo de solido a solido la diferencia la hizo el instrumento de siembra, ya que para el mtodo de extensin se uso un rastrillo de vidrio y en el de solido a solido se uso un asa con loop (el rastrillo permite distribuir ms fcilmente y sin causar daos en el medio de cultivo). Por otra parte, si se compara los mtodos de medio liquido a solido, se tiene que el de extensin supera ampliamente al de profundidad en cuanto a la formacin de colonias, ya que en el mtodo por profundidad no se logran apreciar colonias, esto se debe principalmente a que cuando se sembraron las bacterias estas solo fueron enterradas en el medio y no distribuidas por la superficie. Finalmente al observar los resultados del mtodo de solido a liquido, no se logra apreciar ninguna colonia, ms bien solo ocurre un aumento en la turbidez del medio, ya que al colocar la bacteria en el medio liquido esta se distribuye por todo el medio y al reproducirse tambin sigue distribuyndose (este ltimo mtodo es ms bien implementado en la medicin de crecimiento bacteriano por turbidimetria). La Figura N2 representa un caso especial en donde de mala implementacin del mtodo de siembra de medio solido a solido, ya que no se realizo el procedimiento cerca de un mechero encendido, se dao el medio del cultivo y se expuso la placa a otro tipo de microorganismos. Producto de lo anterior es que en la figura N2 se aprecien dos tipos de microorganismos y no se aprecien colonias bien distribuidas.

Figura N10: Tincin Gram positiva en S. aureus Fuente: Trinidad Sabalete

En la tincin de Gram se observ cocos en disposicin de racimos de un color morado. Mediante la tincin de E. coli con safranina, se observ su forma de bacillo y se logr ver una bacteria en su fase terminal de separacin. No se obtuvo una imagen clara en el microscopio de la muestra de E. coli teida con azul de bromotimol.

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

Del anlisis de contaminacin ambiental se observa que las bacterias son muy especficas en cuanto al medio donde se pueden desarrollar, pues en el medio LB Agar y en APD, se desarrollaron diferentes microorganismos. Esto debido a que el medio APD es selectivo para hongos y levaduras, mientras que el LB Agar es un medio rico para bacterias (Tortora, 2007) Respecto de la contaminacin del ambiente tanto en el anlisis del aire como de las superficies se desarrollaron ms bacterias que hongos y levaduras. De acuerdo a de la Rosa y colaboradores en el aire es frecuente encontrar y aislar bacterias esporuladas de los gneros Bacillus y Clostridium. Tambin bacilos pleomrficos Gram positivos (Corynebacterium) y los cocos Gram positivos (Micrococcus y Staphylococcus). Aade tambin que los bacilos Gram negativos (Flavobacterium, Alcaligenes) se encuentran en menor proporcin y disminuyen con la altura A dems indica que Cladosporium es el hongo que predomina en el aire, tanto sobre la tierra como sobre el mar, aunque tambin es frecuente encontrar otros mohos, como Aspergillus, Penicillium, Alternaria y Mucor y la levadura Rhodotorula (de la Rosa et al, 2002). Mediante la tincin simple con safranina se observ la estructura de la bacteria, forma de bacilo, Sin embargo debido a un exceso de calor en el proceso de fijacin de la muestra, se destruyeron muchas E. coli por lo que se observaron bacterias deformes. La tincin de Gram para S. aureus entrega un resultado positivo, es decir la bacteria retiene el colorante cristal

violeta en su capa de peptidoglicn, lo que se observa en el color morado. Esta tincin a diferencia de las tinciones simples, permite diferenciar a las bacterias, debido a que reacciona de modo diferente de acuerdo a las caractersticas de la membrana. (Tortora, 2007). Conclusiones: Mediante el cultivo de bacterias en los distintos medios descritos, se logro aislar colonias y observarlas a nivel macroscpico, con lo cual se realiz una descripcin general de su forma, tamao, color, etc., lo que permite iniciar una eventual identificacin al compararlas con colonias conocidas. Se logr aislar diferentes microorganismos del ambiente (aire y superficie del mesn de trabajo), con lo cual se visualiza la importancia de trabajar en condiciones de esterilidad, como por ejemplo, trabajar cerca del mechero, no hablar mientras se realizan los cultivos y limpiar el mesn y las manos con etanol 70% En el anlisis microscpico, se observ la diferencia en cuanto al tipo de tincin realizada, pues con la tincin simple, solo fue posible observar la forma de la bacteria, mientras que de la tincin diferencial se obtuvo informacin del tipo de membrana de la bacteria analizada. Estos mtodos, son de gran utilidad para identificar de un modo ms exacto a los microorganismos, pues el estudio macroscpico entrega una visin general. Finalmente, los autores destacan que al momento de manipular y observar cultivos bacterianos, se deben cuidar las medidas de higiene y esterilidad, para no daar los cultivos, ni la salud personal.

Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Dpto. de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos Ingeniera de Alimentos

Bibliografa: De la Rosa M, Mosso M & Ulln C. (2002): El aire: hbitat y medio de transmisin de microorganismos. Observatorio Medioambiental Vol. 5 Pgs. 375-402 Sabalete T. Imagen de S. aureus en tincin Gram. Bajo licencia de Creative Commons Attribution 3.0 Unported License Schlegel H, (1997): Microbiologa General. Ed Omega, Nueva Edicin. Tortora G, Funke B, Case C. (2007): Introduccin a la Microbiologa. Ed. Panamericana. 9 Edicin.