INFORME DE PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN DE ADN, PCR E

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR EL 16S Y METAGENÓMICA

Marco teórico:

NUEVAS TECNOLOGÕAS EN LA IDENTIFICACION MOLECULAR

MICROBIANA

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/
procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
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Estudio de las muestras ambientales

los análisis comparativos de secuencias del gen del ARNr (Ácido Ribonucleico ribosomal)
realizados por Woese en 1987 con la posibilidad de estudiar a los microorganismos
presentes en una muestra ambiental. desde una perspectiva genética estos estudios
definieron por primera vez a los tres dominios de la vida (Archaea, Bacteria y Eukarya). La
identificación del microbiota con el uso del ARNr permite hacer inferencias ecológicas
representativas sobre su función en un ambiente particular ya que proporciona información
sobre toda la comunidad y no sólo de la porción que puede ser cultiva y Los análisis
comparativos de secuencias de ARNr se han realizado con el uso de herramientas
moleculares como la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización. (Pérez, s/f, p.
15).

La secuenciación
Las tecnologías de secuenciación han revolucionado las ciencias biológicas;
su alto rendimiento, reproducibilidad y velocidad ahora permiten una amplia
variedad de aplicaciones y el estudio de sistemas biológicos que antes no era
posible y los métodos actuales para el estudio de los microbios de una
muestra ambiental se basan en la extracción del ADN genómico de la
muestra y su posterior secuenciación (Sanger et al., 1977).
La secuenciación comenzó en los años 70s con el uso de la cromatografía en
dos dimensiones que permitía obtener secuencias de fragmentos cortos de
ADN sin embargo con la publicación del método de Sanger de terminación de
la cadena en el año 1977 se comenzaron a obtener secuencias más largas,
en menor tiempo y de manera más confiable y reproducible. Desde entonces,
la secuenciación ha pasado por cambios importantes que la han convertido
en una de las técnicas más usadas para el estudio del material genómico. A
raíz de esto se desarrollaron una gran variedad de plataformas con diferentes
características que permiten obtener un gran número de datos (Figura 1).
Figura 1: Fechas de lanzamiento comercial de las plataformas de secuenciación contra los
millones de pares de bases obtenidas por ejecución. Los números dentro de los puntos de
datos denotan las longitudes de lectura actuales. Las plataformas de secuenciación están
codificadas por colores

La metagenómica
La Metagenómica es una de las disciplinas que más se ha visto beneficiada
por las mejoras en las tecnologías de secuenciación masiva. El término fue
acuñado por Handelsman et al. (1998) y hace referencia al análisis de las
secuencias de los genomas microbianos que se encuentran en una muestra
ambiental como si fueran un único genoma, por lo que se le denomina
comúnmente metagenoma.
La metagenómica es una ciencia que surge como una rama de las ciencias
genómicas, la cual se refiere al estudio del metagenoma de un nicho en
particular (Handelsman, 2004; Riesenfeld et al., 2004a).
Actualmente estas secuencias se obtienen tanto con la secuenciación de
amplicones como con la secuenciación shotgun (Figura 2).
Figura 2. Aproximaciones metagenómicas para el estudio de muestras
ambientales. Modificado de Morgan y Huttenhower, 2012.

El metagenoma se puede definir como el total de DNA de una muestra

ambiental. Hasta el momento, se han investigado metagenomas de diversos
ambientes, incluyendo ecosistemas acuáticos, minas, suelos agrícolas y
forestales, entre otros (Rondon et al., 2000; Wang et al., 2000; Lee et al.,
2004; Tyson et al., 2004; Craig et al., 2009). Lo relevante de estos estudios es
que cada uno de ellos ha mostrado diferentes aspectos para estudiar y
analizar.
Al estudiar el metagenoma de un ambiente en particular, es muy probable
que este consista en gran parte de bacterias u otros organismos no
cultivables; sólo conocemos una pequeña proporción de éstos, los cuales
podemos reproducir en condiciones de laboratorio (Handelsman 2004;
Riesenfeld et al., 2004a). De esta manera, el DNA metagenómico se puede
clonar en vectores y expresar en diversos huéspedes procariotes,
dependiendo de los objetivos del estudio (Rondon et al., 2000; Wang et al.,
2000). Todo este material genético podría codificar nuevas o mejores
actividades metabólicas. De la misma manera, se pueden emplear métodos
de secuenciación masiva que generarán genomas completos de organismos
no cultivables (Handelsman, 2004; Tyson et al., 2004).
La secuenciación de amplicones

La secuenciación de amplicones se ha usado para conocer la

composición de las comunidades de microorganismos en diversos
ambientes (Quin, et al., 2010; Craig, 2004; Mason et al., 2014; Lamendella
et al., 2014). Los procariontes (Bacteria y Archaea) se han identificado
con el análisis de secuencias de regiones del gen 16S (que codifica para
la subunidad menor del ARNr) por tres razones principales: (i) Se 6
encuentra presente en todas las especies de los dominios Bacteria y
Archaea. (ii) Contiene regiones altamente conservadas que pueden
emplearse para diseñar cebadores de PCR de amplio espectro
(teóricamente universales) y sus regiones variables son útiles para la
discriminación entre microorganismos y su clasificación taxonómica
(Kuczynski et al., 2011). (iii) Es el marcador taxonómicamente
informativo del que se tienen bases de datos con un gran número de
secuencias depositadas (Yarza et al., 2014).
El gen 16S consta de nueve regiones hipervariables (V1-V9); algunas
presentan mayor variabilidad que otras y permiten realizar una
asignación taxonómica precisa (Yu y Morrison, 2004; Youssef et al.,
2009). Las regiones V1-V4 presentan dos ventajas cuando se trata de
asignación taxonómica: (i) proporcionan una mayor resolución para
distinguir entre especies debido a su elevada variabilidad; (ii) existen un
mayor número de secuencias parciales correspondientes a estas
regiones en las bases de datos, facilitando la asignación taxonómica
(Kim et al., 2011). La secuenciación del gen 16S ha permitido la
identificación de microorganismos que permanecían desconocidos en
una gran variedad de ambientes y se ha usado para crear perfiles de
diversidad microbiana que permiten asociar a los microorganismos a un
entorno particular (Rappé y Giovannoni, 2003; Lozupone y Knight, 2007;
McCliment et al., 2006; Soo et al., 2009). Sin embargo, esta metodología
sólo provee información sobre la composición de las comunidades
microbianas y aunque se puede realizar una inferencia funcional, la
precisión de ésta depende del número de genomas disponibles en las
bases de datos (Langille et al., 2013).

La metagenómica y el ADN metagenómico

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https://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/20115/Amplificaci
%C3%B3nFINAL-Borja.pdf?sequence=1&isAllowed=y

La metagenómica es una ciencia que surge como una rama de las

ciencias genómicas, la cual se refiere al estudio del metagenoma de un
nicho en particular (Handelsman, 2004; Riesenfeld et al., 2004a). El
metagenoma se puede definir como el total de DNA de una muestra
ambiental. Hasta el momento, se han investigado metagenomas de
diversos ambientes, incluyendo ecosistemas acuáticos, minas, suelos
agrícolas y forestales, entre otros (Rondon et al., 2000; Wang et al.,
2000; Lee et al., 2004; Tyson et al., 2004; Craig et al., 2009). Lo relevante
de estos estudios es que cada uno de ellos ha mostrado diferentes
aspectos para estudiar y analizar. En algunos casos, se han descubierto
novedosos elementos genéticos que podrían tener aplicación en la
industria (Rondon et al., 2000), mientras que en otros, han aportado
novedosos aspectos de la ecología microbiana en un ecosistema en
particular (Tyson et al., 2004).
En particular, se ha propuesto que entre 80-90% de los
microorganismos que habitan el suelo son desconocidos (Alexander
1977). Esto representa una limitante para descubrir el verdadero
potencial genético de estos sistemas. Al estudiar el metagenoma de un
ambiente en particular, es muy probable que este consista en gran parte
de bacterias u otros organismos no cultivables; sólo conocemos una
pequeña proporción de éstos, los cuales podemos reproducir en
condiciones de laboratorio (Handelsman 2004; Riesenfeld et al., 2004a).
De esta manera, el DNA metagenómico se puede clonar en vectores y
expresar en diversos huéspedes procariotes, dependiendo de los
objetivos del estudio (Rondon et al., 2000; Wang et al., 2000). Todo este
material genético podría codificar nuevas o mejores actividades
metabólicas. De la misma manera, se pueden emplear métodos de
secuenciación masiva que generarán genomas completos de
organismos no cultivables (Handelsman, 2004; Tyson et al., 2004).

Genes y el gen rRNA 16S

Los genes son unidades cortas de DNA encargadas de dirigir las
actividades metabólicas de las células, estos genes están organizados
en cromosomas, estructuras que sirven de vehículo para la transmisión
de la información genética. Tienen elementos que indican de dónde a
dónde se tiene que leer, y su contenido determina la composición de las
proteínas que se forman.
El gen rRNA 16S contiene regiones que permiten establecer la relación
taxonómica profunda entre familias, clases y filos, así como regiones
variables que posibilitan discriminar entre especies dentro del mismo
género. Estas características permitieron utilizar el gen como marcador
filogenético y herramienta de identificación (Beaz R., 2013). Este
marcador ha sido ampliamente usado debido a que su secuencia es
altamente conservada (Woese y Fox, 1977a; Pace et al., 1986; Woese,
1987). Una de las técnicas más usadas para amplificar el material
genético de bacterias no cultivables, desde hace algunas décadas, es la
amplificación de los genes ribosomales que codifican para la subunidad
16S (rRNA o rDNA 16S). La amplificación de los rRNA 16S se realiza por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, por sus siglas
en inglés, empleando oligonucleótidos o primers específicos. Esto se
realiza para amplificar los rRNA 16S de bacterias u otros grupos como
arqueobacterias. En el caso de organismos eucariontes, se emplean las
secuencias rRNA 18S (Baker et al., 2003). Los 16S posteriormente se
pueden clonar en vectores o plásmidos. Dichos vectores son
transferidos a bacterias huésped como Escherichia coli, para crear
bibliotecas o bancos de clonas, conteniendo las secuencias rRNA 16S
de diversos microorganismos de forma separada. Esto permite el
análisis individual de cada una de las secuencias clonadas utilizando
diversos métodos, tales como secuenciación, restricción de los 16S
ribosomales con nucleasas (ARDRA), etc. (Escalante et al., 2004).
Antecedentes:

https://docs.bvsalud.org/biblioref/2019/03/981156/4996-texto-del-articulo-
8462-1-10-20190220.pdf

En el trabajo de investigación titulado “Evaluación de métodos de

extracción de ADN bacteriano en muestras fecales de pacientes
diagnosticados con infección por Helicobacter pylori”

https://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/20115/Amplificaci
%C3%B3nFINAL-Borja.pdf?sequence=1&isAllowed=y
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En la tesis titulada “Amplificación de la región del ADN metagenómico
que codifica para el rNA 16S con el fin de analizar las comunidades
microbianas del suelo de nevado de Toluca”

BUSCAR EN DRIVE EL ARCHIVO

En la revista científica titulada “Identificación molecular de bacterias

asociadas a la filosfera de plantas de arroz (Oryza sativa L), mediante
técnicas de cultivo microbiano”
un protocolo de extracción de ADN genómico es esencial para un posterior
análisis confiable (Bag et al., 2016)
el objetivo del presente trabajo es la modificación de un protocolo de
extracción rápida, que permita de forma eficiente y reproducible obtener ADN
metagenómico en muestras de agua de uso agrícola del lago de Tota,
(departamento de Boyacá, Colombia)
 Área de estudio
Las muestras fueron obtenidas del lago de Tota, el
cual está ubicado a 3015 m s.n.m., es el lago de
alta montaña más grande de Colombia.
Como método estándar comercial
se empleó el DNeasy power water
kit (Qiagen™)

El protocolo químico se inició con la

extracción de ADN genómico
mediante un buffer de extracción
preparado con:

Materiales y
PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN
Métodos

Obtención de la muestra y filtración

La muestra se caracteriza por presentar condiciones
idóneas para una alta presencia de bacterias

Posteriormente se
utilizó un filtro Millipore
Sterivex de 0,22 μm
Muestra para realizar la
concentración de los
inicial fue Finalmente fueron microorganismos
de 1,7 L transportados al laboratorio presentes
muestra.
en la

conservando la cadena de
frío para ser almacenados
a -20 ° hasta la extracción
de ADN.
Procedimiento de extracción de ADN a partir de una
se prefiltró a través los filtros se
muestra de agua previamente filtrada.
de filtros de 40 mm transfirieron a tubos
de diámetro con un de plástico estériles
poro de 1 mm de que contenían 3 mL
del reactivo de
tamaño para
protección Monarch®
eliminar cualquier DNA/RNA Protection
contaminante. Reagent.
Búsqueda de protocolos de extracción de ADN e identificación de bacterias por 16S Y metagenómica

BUSCAR EN EL DRIVE EL ARCHIVO

Extracción de ADN bacteriano a partir de cuerpos de agua de uso agrícola

https://www.scielo.org.mx/pdf/tsa/v14n3/v14n3a15.pdf
Protocolo para la extracción de ADN metagenómico bacteriano del Langostino Macrobrachium carcinus L
https://www2.congreso.gob.pe/sicr/cendocbib/con4_uibd.nsf/770DBBBD5ADF759505257D4900580FE6/$FILE/
HerramientasMolecularesAplicadasEcolog%C3%ADa.pdf

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Referencias
Pérez, D. M. R. (s/f). Dra. María Asunción Lago Lestón.

https://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1007/2593/1/tesis_Clara%20Barcelos

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Ronaghi, M. (2001). Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing. Genome Research, 11(1), 3-11. doi:10.1101/gr.11.1.3
https://www.sigmaaldrich.com/PE/es/technical-documents/protocol/genomics/sequencing/sanger-sequencing?gclid=Cj0KCQjwla-
hBhD7ARIsAM9tQKtb00kIy16Sw9FG8xDZdnrtx8xIgKZIRiJvTyBxvl21iEk5rdu5bvUaAh7TEALw_wcB&gclsrc=aw.ds

Sanger, F., Nicklen, S., y Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 74(12), 5463-5467. doi:10.1073/pnas.74.12.5463
Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., y Goodman, R. M. (1998). Molecular biological access to the chemistry of unknown
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Riesenfeld C.S., Schloss P.D., Handelsman J. (2004a). Metagenomics: Genomic Analysis of Microbial Communities. Annual Review of
Genetics 38: 525-552.