MICROARRAYS COMO HERRAMIENTAS DE

INVESTIGACIN Y DISPOSITIVOS DE
DIAGNSTICO
INTRODUCCIN
Con su trabajo pionero, Schena y sus colegas publicaron un mtodo
completamente excepcional en tecnologas moleculares en 1995 (Schena et al.,
1995). Utilizado por primera vez para el perfil transcripcional multiparamtrico,
la tecnologa se desarroll rpidamente para una herramienta de deteccin de
todo tipo de dianas biolgicas (ADN, ARN, protenas, clulas, cidos nucleicos,
carbohidratos, etc.) o sus modificaciones (metilacin, fosforilacin, etc.). ) En
los ltimos 20 aos. El principio es simple. La interaccin biolgica de
molculas, por ejemplo, la interaccin de bases complementarias de cidos
nucleicos, interacciones anticuerpo-antgeno, o la interaccin de hidratos de
carbono con lectinas, representa el principio bsico de la tecnologa de
microarrays. A modo de ejemplo, en lo que sigue, se describen los principios
bsicos de un microarray de ADN: para detectar molculas diana, por ejemplo,
mRNA o ADN genmico; Oligonucletidos complementarios a la respectiva
molcula diana se inmovilizan en soportes slidos como vidrio, niln, otros
polmeros o silicio de una manera ordenada-el microarray. Estos
oligonucletidos pueden corresponder a todos los marcos de lectura abiertos
de un organismo para permitir el perfil transcripcional. De la muestra de
inters, por ejemplo, el ARN se extrae y se marca utilizando enzimas
polimerizantes de cidos nucleicos (por ejemplo, transcriptasa inversa,
polimerasas T7 para generar ADNc) y nucletidos marcados
fluorescentemente. La hibridacin al microarrays conduce a una interaccin
molecular especfica en el lugar donde la cadena complementaria se
inmoviliza. La lectura usando un escner de fluorescencia con un tubo
fotomultiplicador o una imagen con una cmara CCD proporcionar la
informacin si la molcula diana est presente o no en la muestra analizada
(Pollack 2009) (Figura 1). Junto al etiquetado directo, tambin se pueden usar
tcnicas de etiquetado indirecto. Los nucletidos marcados con biotina se
incorporan durante la PCR y despus se detectan usando conjugados de
estreptavidina o anticuerpo. Uno de los primeros ejemplos fue publicado poco
despus del trabajo de Schena et al. (1995), que inici la comercializacin de
microarrays de cido nucleico por Affymetrix, USA (Wodicka et al., 1997). Otro
ejemplo es la tecnologa colorimtrica Silverquant utilizada por Eppendorf
para sus microarrays DualChip. Se usan nucletidos marcados con biotina en
la reaccin de PCR. Los anticuerpos acoplados al oro contra la biotina se
aaden despus de la hibridacin. La reaccin colorimtrica se inicia aadiendo
nitrato de plata y un agente reductor. Esto conduce a la precipitacin de plata
en las partculas de oro. Otra tecnologa de etiquetado utiliza un conjugado
estreptavidina-peroxidasa de rbano picante para la deteccin colorimtrica
(Rubtsova et al., 2010).
 Figura 1. Principio bsico de un microarrays de ADN. En el lado izquierdo, la
lectura de un microarray de diagnstico se muestra usando marcado de dos
colores, que representa dos muestras para ser comparadas, utilizadas, por
ejemplo, en el perfil transcripcional. Los ADNc diana marcados con Cy3 y
Cy5 se hibridan a sus sondas especficas en la matriz como se indica en el
lado izquierdo. La descripcin esquemtica en el lado derecho muestra una
hibridacin tpica usando una hibridacin competitiva de dos colores (Cy3 y
Cy5) en experimentos de perfiles de transcripcin. Los blancos presentes
slo en una muestra dan como resultado seales verdes o rojas, y los
blancos presentes igualmente en ambas muestras dan como resultado una
seal amarilla. La relacin entre la seal roja y la verde da la diferencia en

2 Microarrays de ADN como herramientas de

investigacin
2.1 Desarrollo de microarrays
La tecnologa de microarrays ha revolucionado la investigacin de ADN y
ARN. En contraste con la mayora de los ensayos biolgicos clsicos, los
microarrays permiten el anlisis paralelo de varias decenas de miles de
analitos. Para el anlisis de cidos nucleicos, las posibilidades de aplicacin
abarcan desde un conjunto enfocado de mltiples unidades transcripcionales
para perfil transcripcional o fragmentos genmicos para el anlisis del nmero
de copias o la variacin gentica hasta genomas completos y ms all. La
disponibilidad de secuencias genmicas completas fue la clave para el
desarrollo y uso de tecnologas de todo el genoma, como las tecnologas de
matriz. En el siglo pasado, la secuenciacin de genomas enteros ha sido un
gran esfuerzo tanto en la investigacin acadmica como en la comercial. El
primer genoma eucaritico secuenciado fue el genoma de Saccharomyces
cerevisiae, el segundo genoma completamente secuenciado, en 1996. Antes
de 2000, la secuenciacin del genoma fue una tarea desalentadora. En total, el
nmero de organismos secuenciados fue bastante pequeo, incluyendo 38
bacterias, 1 hongo (S. cerevisiae), 2 invertebrados (Caenorhabditis elegans y
Drosophila melanogaster) y 1 planta (Arabidopsis thaliana), todos con genomas
relativamente pequeos y simples. Slo cinco aos despus de la presentacin
del primer genoma eucaritico, se public un primer borrador de la secuencia
genmica humana (Lander et al., 2001, Venter et al., 2001). La secuencia de
borradores humanos, aunque un hito, era todava bastante imperfecta. Cubri
solamente el 90% del genoma eucromtico y fue interrumpido por 250.000
boquetes. Alrededor de 10 aos ms tarde, el catlogo de organismos
secuenciados inclua ya ms de 16.000 proyectos, incluyendo ms de 10.000
organismos microbianos y cerca de 1.700 organismos vertebrados del proyecto
de secuenciacin completado o en curso de los organismos (Pruitt et al., 2012).
La principal razn de esta explosin en la secuenciacin del genoma se debe al
desarrollo de una tecnologa revolucionaria adicional a principios del siglo XXI,
generalmente denominada secuenciacin de prxima generacin (Margulies et
al., 2005) a la que nos referimos Un prrafo posterior de este artculo. En la
ltima actualizacin del NCBI (octubre de 2013), el nmero de archivos
pblicos aument nuevamente a 24.788 proyectos de genoma registrado
procaritico que representan 4.528 especies diferentes; 14.311 de ellos han
reunido genomas completos (2.670) o borrador (11.641), y el resto o no han
presentado datos de secuencias todava o solo tienen lecturas de secuencia en
bruto cargadas en el Sequence Reads Archive (Kodama et al., 2012). La
secuenciacin no se limita a los organismos individuales, sino que incluye
tambin las comunidades microbianas, como las muestras de los sitios
mediados de los ocanos y de remediacin ambiental y las muestras humanas
del intestino y la piel (Grill et al., 2009). Sorprendentemente, secuencias
parciales del genoma se han obtenido incluso de varias especies extintas,
incluyendo el mamut lanudo y el Neanderthal (Green et al., 2010). Adems, se
secuencian poblaciones de una especie, como en el Proyecto Genoma de 100 K
para patgenos microbianos (Timme et al., 2012) y el Proyecto de 1.000
Genomas para humanos (Genomes Project Consortium et al., 2012). Esto
permitir enfoques completamente nuevos para la investigacin mdica y el
diagnstico, incluyendo el desarrollo de microarrays de diagnstico.
En paralelo a la finalizacin de las primeras secuencias genmicas, la
tecnologa de microarrays de ADN se ha desarrollado como se mencion
anteriormente. Experimentos pioneros se centraron en la expresin de perfiles
utilizando organismos modelo como S. cerevisiae para monitorear los cambios
de la actividad transcripcional de todos los genes conocidos o anotados en un
solo experimento. Para S. cerevisiae, los primeros anlisis transcripcionales del
genoma en su conjunto aparecieron poco despus de la finalizacin de la
secuencia genmica (DeRisi et al., 1997, Hauser et al., 1998, Wodicka et al.,
1997). En el nivel de cido nucleico, esto estableci el inicio para el genoma de
anlisis de los organismos basados en el conocimiento de sus genomas. S.
cerevisiae como uno de los principales organismos modelo fue la clave en el
desarrollo de los mtodos bioqumicos y bioinformticos necesarios para el
perfil transcripcional. Hoy en da, miles de perfiles de transcripcin se han
generado de casi todas las especies secuenciadas. Adems del conocimiento
del genoma, las formas de generar y analizar los datos son un requisito previo
para la transcriptoma. Sin embargo, una visin general de los mtodos de
anlisis de datos est fuera del alcance de este captulo. Se han escrito varios
libros sobre tecnologa de microarrays y anlisis de datos que se introducen
perfectamente en estos temas (Bremer et al., 2010; Dufva 2009). La
fabricacin de microarray, que se ha presentado brevemente ms arriba, se
discutir ms adelante en lo que sigue.
2.2 Fabricacin de microarray de ADN
Existen tres maneras principales de fabricar microarrays de ADN: la sntesis
dirigida a la luz (fotolitografa), la impresin por chorro de tinta piezoelctrica y
la deteccin de robots (Hughes et al., 2001). Para la fotolitografa, se utilizan
mscaras premade o dispositivos digitales de micromirror. Las mscaras
Premade son utilizadas por la plataforma Affymetrix. Para cada nucletido (nt)
aadido a la hebra de crecimiento sobre el soporte slido, se aplica una
mscara que cubre las regiones en el microarray donde no se produce adicin
de base. Los anteriores grupos de bloqueo de nucletidos se eliminan mediante
una reaccin fotosensible despus de la desproteccin inducida por la luz UV y
puede tener lugar la extensin por otro nucletido. La tecnologa es bastante
cara debido a los costos de la mscara. Cada diseo de matriz necesita su
propio conjunto de mscaras. Por lo general, las sondas son de 20-25 nt de
longitud, y se sintetizan 22-40 sondas por gen. Otra tecnologa fotolitogrfica
es utilizada por NimbleGen: la extensin de un solo nucletido se realiza
mediante la inactivacin mediada por luz de un grupo protector fotolbil y
despus una adicin de base. Esto es similar a la tecnologa Affymetrix. Sin
embargo, NimbleGen utiliza dispositivos micromirror que pueden conducir la
luz necesaria para la inactivacin de grupos protectores a cada punto deseado
en el microarray. Por lo tanto, ya no hay necesidad de mscaras que hace que
esta tecnologa mucho ms barato. Otra tecnologa para la fabricacin de
microarrays es la tecnologa de impresin por chorro de tinta piezoelctrica,
tambin llamada tecnologa HP deducida de la tecnologa de impresin HP. La
tecnologa de impresin segura de Agilent es un ejemplo para una plataforma
industrial. Producen microarrays de ADNc u oligonucletidos. El ADNc se
detecta directamente, los oligonucletidos se sintetizan base por base en
capas de impresin repetitivas usando qumica estndar de fosforamidita
(htt.library/library/technicaloverviews/Public/5988-8171en.pdf). La tecnologa
ms utilizada para la produccin de microarrays, especialmente en el campo
de las instituciones de investigacin y universidades, es la tecnologa de
deteccin de robots: por ejemplo, las protenas, productos de PCR o
oligonucletidos se manchan sobre un soporte de vidrio slido usando clavos
partidos o slidos. Utilizando clavijas divididas, el ADN es alimentado por
fuerzas capilares y depositado en localizaciones definidas en el microarray
usando tecnologa de robot. Normalmente, se imprimen productos de PCR de
hasta 1 kb y oligonucletidos entre 20 y 100 nts de longitud. Esta tecnologa es
asequible y, por lo tanto, a menudo se utiliza en los laboratorios de
investigacin individuales. Junto a estas tecnologas clsicas, tambin se han
desarrollado sistemas basados en semiconductores. Por ejemplo, CombiMatrix
utiliza un sistema de este tipo para la produccin de sus microarrays. Se
pueden tratar simultneamente miles de microelectrodos de platino para
sintetizar oligonucletidos individuales mediante sntesis controlada
digitalmente. La activacin de un microelectrodo conduce a la produccin de
un cido mediante una reaccin electroqumica. Esto conduce a la
desproteccin de la hebra oligonucleotdica en crecimiento activndola para la
siguiente etapa de sntesis. La posibilidad de dirigir individualmente miles de
microelectrodos en paralelo permite la cmoda produccin de microarrays
individuales (Ghindilis et al., 2007). Ms de 12.000 oligos se sintetizan en
paralelo como 50 mers.
No slo el ADN natural se ha utilizado como sondas o molculas de captura
en los sistemas de microarrays de ADN. Con el fin de reducir la reactividad
cruzada y aumentar la interaccin con los blancos en la muestra aplicada, se
han utilizado variantes no naturales como molculas de captura, incluyendo L-
DNA (Hauser et al., 2006) y variantes de PNA (Sforza et al 2014). Las sondas de
L-DNA tienen la gran ventaja de que interactan con la misma cintica exacta
con su hebra antiparalela de L-DNA, como el dplex de ADN-D. Por lo tanto,
todo el conocimiento adquirido con D-DNA-microarrays se puede utilizar para el
equivalente LDNA. Para unirse a objetivos como ARN, ADN o incluso pptidos /
eptopos o molculas qumicas, se usan los denominados matrices de cdigo
postal. Las sondas utilizadas en matrices de cdigo postal son fusiones en las
que los dianas se unen en solucin utilizando, por ejemplo, oligmero de D-
ADN natural complementario al ADN / ARN diana que se fusiona con un L-DNA.
Este oligmero de L-DNA dirige un oligonucletido de LDNA complementario
inmovilizado sobre la superficie de microarrays, lo que permite una hibridacin
literalmente libre de antecedentes en las matrices. Sin embargo, el precio para
sintetizar oligmeros de L-DNA es bastante alto, dificultando el desarrollo
adicional. Los P-DNAs, anlogos de cidos nucleicos sintticos basados en un
esqueleto pseudopptido en lugar de un esqueleto de fosfodister, muestran
excelentes propiedades de reconocimiento especficas de la secuencia y son
menos susceptibles a cambios en la fuerza inica. Dado que no estn cargadas,
la repulsin entre el esqueleto cargado negativamente presente en dplex de
ADN est ausente dando como resultado afinidades ms altas como se
muestra por las curvas de ms alto punto de fusin de dplex PNA / ADN o PNA
/ ARN si se comparan con sus homlogos naturales (Brandt y Hoheisel 2004;
Jacob et al., 2004, Sforza et al., 2014).
Junto a estos sistemas de matriz planar, los sistemas basados en perlas se
han desarrollado como matrices de bolas aleatorias o arrays de suspensin. Las
perlas estn marcadas con diferentes cantidades de colorante fluorescente u
otra tecnologa de cdigo de barras y son identificables individualmente.
Despus del acoplamiento, por ejemplo, oligonucletidos a tales perlas, puede
detectarse un evento de unin especfico. Por ejemplo, Illumina ha desarrollado
una tecnologa de matriz de talones, donde usan diapositivas planas de silicio o
haces de fibra ptica. Las obleas de silicio o las fibras pticas se graban de tal
forma que las perlas individuales pueden encajar en los pocillos resultantes de
tres micras de tamao. Despus del evento de unin, las perlas se identifican
posteriormente. Esta tecnologa utiliza marcadores marcados
fluorescentemente http: // www.
Ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechBeadArray.shtml. Similar a
esto, los arrays de suspensin tambin usan perlas diferenciables pticamente
que estn acopladas a la biomolcula interesante que puede ser, por ejemplo,
oligonucletidos o anticuerpos. La reaccin de hibridacin con sustratos
marcados fluorescentemente tiene lugar en solucin, y un proceso de
clasificacin FACS (seleccin de clulas activada por fluorescencia) posterior
permite la identificacin del proceso de unin. Un ejemplo es la tecnologa
xMAP de Luminex
(http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/)
Los microarrays de ADN han sido ampliamente utilizados como herramienta
de investigacin en el laboratorio, y segn esto, se ha publicado una gran
cantidad de literatura en este campo. Tambin se han desarrollado microarrays
que abordan objetivos especficos como protenas, carbohidratos, tejidos o
clulas, pero no sern revisados aqu. Existen muchas revisiones que tratan
temas como el anlisis de la expresin del genoma completo (ms de 2.200
revisiones en PubMed con las cadenas de bsqueda "microarray" y "anlisis de
la expresin"), la investigacin del cncer (Chibon 2013, Ho et al., 2013) , El
cariotipaje molecular (Dhillon et al., 2014), el anlisis de microarrays
cromosmicos (Brady y Vermeesch 2012), la filogentica / microbiome (Nikolaki
y Tsiamis 2013), o la regulacin de genes a travs de ChIP-chip (Falk 2010,
Powell et al., 2013). Los microarrays de ADN se han utilizado para estudiar
enfermedades del corazn (Phan et al., 2012), aspectos en dermatologa
(Villasenor-Park y Ortega-Loayza 2013), o trastornos mentales como el autismo
(Carter y Scherer, 2013) y muchos otros. En Miller et al., Se ha dado una
descripcin ms detallada de las aplicaciones en microbiologa clnica. (Miller y
Tang, 2009). En la siguiente seccin, se da una visin ms detallada de algunos
microarrays de investigacin seleccionados.
2.3 Microarrays in Infection Biology
El siglo pasado trajo la disponibilidad de vacunas y antibiticos, lo que
condujo a una dramtica cada en la mortalidad causada por enfermedades
infecciosas. Sin embargo, hoy en da casi el 25% de las muertes anuales en
todo el mundo estn directamente relacionadas con patgenos (Morens et al.,
2004). Esto puede atribuirse a la aparicin de nuevas enfermedades como el
VIH, el SARS, el Virus del Nilo Occidental o el reciente brote de Ebola, pero
tambin a un aumento de la resistencia a los antibiticos en patgenos
considerados como derrotados, como Mycobacterium tuberculosis o
Staphylococcus y Enterococcus. Adems, el progreso en la atencin mdica
resulta en una gran proporcin de pacientes inmunodeficientes temporalmente
o durante toda la vida y consecuentemente en un aumento de infecciones
oportunistas que a menudo resulta en sepsis, requiriendo un diagnstico rpido
y preciso para salvar vidas de pacientes. Aproximadamente 1.415 especies han
sido identificadas como patgenas para los seres humanos, incluyendo 538
bacterias y 307 hongos (Cleaveland et al., 2001), lo que indica el problema
multiparamtrico de identificacin del patgeno causante de la enfermedad.
Los microarrays de ADN han surgido como una plataforma viable para la
deteccin de organismos patgenos. Las matrices de deteccin microbiana,
tanto en lo que respecta al coste como al rango de aplicacin, se encuentran
entre ensayos de bajo costo y estrechamente enfocados, como la PCR
multiplex y las tecnologas ms caras y de amplio espectro como la
secuenciacin de alto rendimiento. Las matrices de deteccin de patgenos se
han utilizado principalmente en un contexto de investigacin; Sin embargo,
varios grupos han desarrollado matrices para diagnsticos clnicos, pruebas de
seguridad alimentaria, monitoreo ambiental y biodefensa. Los algoritmos
estadsticos que permiten el anlisis de datos y proporcionan resultados
fcilmente interpretables son absolutamente necesarios para una matriz de
deteccin aplicable.
Uno de los primeros microarrays diseados para una amplia gama de
patgenos fue el ViroChip (Wang et al., 2002). Una versin actualizada fue
publicada poco despus (Wang et al., 2003). Esta matriz, fabricada por
manchas robotizadas de oligos 70-mer, contena inicialmente 1.600 sondas
derivadas de 140 genomas virales disponibles en ese momento. Dado que las
sondas fueron diseadas contra las secuencias conservadas comunes a una
familia taxonmica, podra ser utilizado para identificar nuevos virus dentro de
la misma familia. Por lo tanto, el ViroChip podra contribuir a caracterizar el
nuevo coronavirus responsable del brote de SARS en 2003 (Ksiazek et al.,
2003). Tambin hoy en da el ViroChip todava se utiliza en estudios clnicos. Su
utilidad para la deteccin de virus en las infecciones agudas de las vas
respiratorias en los nios podra mostrarse en un estudio clnico de ms de 200
nios, mostrando resultados superiores con respecto a la sensibilidad y perfil
de especificidad y espectro expandido para la deteccin de virus en
comparacin con serolgico o PCR- (Chiu et al., 2008). La ltima versin de la
matriz se basa ahora en la plataforma de chorro de tinta Agilent (Chen et al.,
2011).
Una de las matrices ms completas ha sido descrita por Gardener et al.
(Gardner et al., 2010), basado en la plataforma tecnolgica NimbleGen. En este
informe se describe un conjunto pan-microbiano de deteccin (MDA) para
detectar todos los virus conocidos (incluyendo fagos), bacterias y plsmidos en
ese momento incluyendo un nuevo mtodo de anlisis estadstico para
identificar mezclas de organismos de muestras complejas hibridadas con el
conjunto . En esta matriz, se seleccionaron sondas especficas de la familia
para todos los genomas completos secuenciales virales y bacterianos. Las
sondas de la serie se disearon para tolerar variaciones de secuencia que
permitan la deteccin de especies divergentes siempre que se da cierta
homologa a los organismos secuenciados, como se describe para la ViroChip.
Utilizando este chip integral en pruebas ciegas en muestras con puntas y en
muestras clnicas fecales, de suero y respiratorias, el chip fue capaz de
identificar correctamente mltiples especies o cepas como lo confirm la PCR.
Adems, se han descrito muchas matrices diferentes que se centran en
patgenos definidos o familias de patgenos, as como patrones de resistencia.
Para detectar infecciones fngicas, especialmente en unidades de cuidados
intensivos en hospitales donde han surgido como causa principal de morbilidad
y mortalidad en pacientes inmunodeprimidos, se ha desarrollado un
microarrays de diagnstico para la identificacin rpida y simultnea de las 12
especies de Candida y Aspergillus ms patgenas . Se disearon sondas
oligonucleotdicas basadas en variaciones de secuencias de las regiones
espaciadoras transcritas internas (ITS) usando una PCR universal que
amplificaba la regin objetivo ITS de hongos. La matriz se valid mediante el
uso de 21 aislamientos clnicos como cegados muestras (Leinberger et al.,
2005).
Se han establecido tambin matrices para detectar determinantes de
resistencia como las lactamasas. Por ejemplo, Leinberger et al. Describi una
matriz de deteccin de beta-lactamasas de espectro extendido capaz de
detectar mecanismos de resistencia basados en el tipo de TEM, SHV o CTX-M
que confieren resistencia a antibiticos beta-lactama en bacterias
gramnegativas (Leinberger et al., 2010). La actividad de estas enzimas frente a
los antibiticos beta-lactmicos y su resistencia frente a los inhibidores puede
estar influenciada por la variacin gentica en el nivel de un solo nucletido. Se
describe que la matriz consiste en 618 sondas que cubren mutaciones
responsables de 156 sustituciones de aminocidos. La validez de la
microarrays de ADN se demostr con 60 aislamientos clnicos cegados, que se
recogieron durante las rutinas clnicas. El chip se caracteriz con xito con
respecto a su resolucin, correlacin fenotipo-genotipo, y la capacidad de
resolver genotipos mixtos.
Tambin se pueden detectar mecanismos de resistencia de patgenos
emergentes como Acinetobacter baumannii utilizando matrices. Dally et al.
Han desarrollado un microarray que puede ser utilizado para detectar 91
secuencias diana asociadas con la resistencia a los antibiticos dentro de 4 h
de un cultivo bacteriano (Dally et al., 2013). La matriz fue validada con 60
cepas de A. baumannii resistentes a mltiples frmacos en un estudio
prospectivo cegado y comparada con los resultados determinados por el
sistema VITEK2, basados en la susceptibilidad fenotpica. Esta matriz es capaz
de detectar todos los determinantes de resistencia relevantes de A. baumannii
en paralelo. De este modo, permite resultados rpidos para iniciar una terapia
antiinfecciosa adecuada para pacientes crticamente enfermos y puede
utilizarse para la vigilancia epidemiolgica.
2.4 Perfiles de expresin de genes basados en microarray en cncer
El perfil transcripcional se ampli rpidamente a la investigacin sobre todos
los tipos de cnceres humanos, comenzando ya antes de que el primer
borrador del genoma humano se publicara en 2001. El cncer de mama ha sido
uno de los cnceres humanos ms intensamente estudiados, con respecto al
perfil de expresin gnica basado en microarrays Para la clasificacin del
cncer, el pronstico y la prediccin. Una de las razones de esto, adems de la
alta frecuencia de cncer de mama en la poblacin, es la observacin de que
aunque aproximadamente el 60% de todos los pacientes con cncer de mama
temprano reciben alguna forma de quimioterapia, slo una minora se
beneficiar de ella (Schmidt et al 2009). Por lo tanto, se necesitan marcadores
pronsticos y predictivos confiables para guiar la seleccin de las terapias
adyuvantes ms apropiadas para pacientes individuales con cncer de mama.
Microarrays realmente contribuido significativamente a un cambio en la
comprensin de cncer de mama como un grupo heterogneo de tumores
complejos en lugar de un solo grupo. El trabajo pionero de Perou y sus colegas
redescubri la gran heterogeneidad de los tumores de cncer de mama a nivel
molecular (Perou et al., 2000). La demostracin de que las clulas tumorales
ER-positivas y ER-negativas son fundamentalmente diferentes en sus perfiles
de expresin condujo a la sugerencia de usar clasificadores de pronsticos
multignicos basados en microarrays, conocidos como firmas de genes o firmas
de diagnstico, como un panel de pronstico / marcador predictivo para las
decisiones teraputicas . En la ltima dcada, varios grupos se han embarcado
en la identificacin de las firmas de genes para el diagnstico de cncer de
mama con el objetivo de predecir si la quimioterapia puede omitirse en el
cncer de mama en etapa temprana o seleccionar el tratamiento ms
adecuado. Una de las primeras firmas pronsticas consisti en 70 genes que
permitieron la identificacin de pacientes de buen pronstico con un riesgo
mnimo de desarrollar metstasis en los prximos 5 aos (van 't Veer et al.,
2002). Esta firma de 70 genes ha sido validada en varios ensayos clnicos, en
general utilizando tejido de biopsia fresca para la preparacin de los perfiles
transcripcionales durante los ltimos aos y ahora est disponible en el
mercado a travs de Agendia como MammaPrint (utilizando Microarrays
basado en la tecnologa Agilent) De cncer de mama en etapa temprana
(Exner et al., 2014). En paralelo, se estableci una firma gentica consistente
en 16 genes de diagnstico (y 5 controles), basada en qRT-PCR (Oncotype DX)
(Paik et al., 2004). Este ensayo tambin se someti a varios ensayos clnicos y
recientemente se evalu positivamente el impacto econmico en el manejo del
paciente (Nerich et al., 2014). Varios otros ensayos se han desarrollado, que
estn bien revisados por Colombo et al. Y por Zanotti et al. (Colombo et al.,
2011, Zanotti et al., 2014).
En resumen, esto demuestra cmo en los ltimos 15-20 aos el desarrollo de
microarrays permiti la instalacin exitosa de ensayos multignicos, diseados
para apoyar a los mdicos y pacientes en la toma de decisiones clnicas en el
cncer de mama en etapa temprana.
 2.5 Deteccin de pequeos ARN no codificantes y sus precursores
Los ARN no codificantes, especialmente microRNAs, se han descrito en la
ltima dcada como reguladores clave del desarrollo (Bushati y Cohen 2007).
Por lo tanto, se han realizado esfuerzos considerables para desentraar la
funcin de los miARN y utilizarlos como marcadores diagnsticos,
especialmente en cncer (Jansson y Lund, 2012, Zhang et al., 2014), pero
tambin en otras enfermedades, incluidas las neurodegenerativas (Gandhi et
al., 2013 ), Enfermedades cardiovasculares (Ellis et al., 2013) y enfermedades
infecciosas (Shrivastava et al., 2013). La deteccin de pequeos ARN no
codificantes como los microARN es un desafo, ya que son muy cortos en su
forma madura, que no contienen ni cola ni tampn poli (A) de forma natural y
adems de la forma madura existen en forma prima y una preforma que se
procesan Y transportado fuera del ncleo por una secuencia compleja de
acontecimientos segn lo repasado agradable por Bartel (Bartel 2004). Se han
descrito varios sistemas que permiten la deteccin de microARN en una
plataforma de microarrays. Por ejemplo, Agilent ha desarrollado una plataforma
que incluye una tecnologa de etiquetado especial que permite la deteccin de
miRNAs para biopsia de tejido o fijada con formalina (D'Andrade y Fulmer-
Smentek 2012). El perfil de diferentes niveles de maduracin de miARN en
paralelo es importante para una clasificacin integral del cncer (O'Hara et al.,
2008). Por lo tanto, es deseable distinguir entre maduras, pri y preformas.
Dado que el miARN maduro es tambin parte de las preformas, los sistemas de
microarrays disponibles en general no son capaces de distinguir entre los
miRNAs prematuros y maduros sin exclusin costosa de tamao o anlisis
aproximado de datos. Sin embargo, utilizando un sistema de matrices de
cdigo postal junto con un enfoque de etiquetado definido, un sistema que
permite la distincin entre pre-miRNAs y su forma madura fue descrito
recientemente por Weishaupt et al. (Weishaupt et al., 2013). Marcando todas
las formas de miRNAs con una cola poli (A), pueden distinguir entre miARN que
contiene todava una secuencia precursora y un miARN maduro que contiene la
cola poli (A) en proximidad directa a la secuencia madura. Esto se hace usando
reacciones de extensin de cebador en combinacin con dos cebadores
distintos de cdigo postal que se hibridan con el miARN maduro apuntado y el
ZIP especfico complementario en la matriz. Los dos cebadores de cdigo
postal se usan para dos reacciones de marcado distintas que contienen (1) slo
dTTP no marcado junto con Cy3-dUTP en la reaccin de marcado que permite la
deteccin de la forma madura y (2) dATP, dCTP, dGTP y dTTP sin marcar Junto
con Cy3-dATP en la reaccin de etiquetado para la deteccin de la forma
precursora como se muestra en la Fig. 2. Combinando ambas reacciones de
etiquetado en una matriz, ahora podemos identificar a travs del cdigo ZIP
complementario especfico la cantidad de miARN prematuro y maduro. Esto es
posible debido a que el miARN precursor es la nica especie que es capaz de
transportar dATP marcado, ya que la cola poli (A) directamente despus de la
forma madura no permite la integracin de dATP en la forma madura (para la
reaccin de marcado ver Fig. 2 ), Y el miARN maduro es la nica especie que es
capaz de contener Cy3-dUTP a travs de la cola poli (A). La reaccin de la
etiqueta tiene que ser realizada por separado para conseguir esto y se mezcla
en una matriz para la lectura. Utilizando un conjunto de cebadores de cdigo
ZIP bien definidos y evaluados, se pudo demostrar una lectura cuantitativa.
3 Microarrays de ADN: Ya en el Laboratorio Clnico?
 Existen muchas plataformas de microarrays de ADN comercialmente
disponibles para aplicaciones de investigacin como se introducen en la Sec. 1.
Sin embargo, los arreglos que se utilizan con fines de diagnstico en las clnicas
son raros. Los sistemas basados en microarrays de ADN a menudo se enfrentan
a problemas como la reproducibilidad, la sensibilidad, la facilidad de uso y el
riesgo de contaminacin.
Sin embargo, hay varios ejemplos de microarrays de ADN que lo convirtieron
en diagnsticos. Un ejemplo es el AmplichipCYP450 de Roche, basado en el
sistema Affymetrix. Es la primera prueba farmacocintica basada en
microarrays aprobada para uso clnico. "El AmpliChip CYP450 Test proporciona
una deteccin completa de las variaciones genticas-incluyendo deleciones y
duplicaciones- de los genes CYP2D6 y CYP2C19, que juegan un papel
importante en el metabolismo de un 25% estimado de todos los medicamentos
recetados. Est destinado a ser una ayuda a los mdicos en la determinacin
de la estrategia teraputica y la dosis de tratamiento para los productos
teraputicos metabolizados por el producto del gen CYP2D6 o CYP2C19
"(http: //www.roche.com/products/product-details.htm?typeproduct&id17).
El perfil MammaPrint de 70 genes liberado por la FDA comercialmente
disponible de Agendia como se ha descrito anteriormente es uno de los
ejemplos para una matriz de perfiles de transcripcin que permite predecir el
riesgo de formacin de metstasis para el cncer de mama. El tejido biopsiado
o incrustado en formalina se analiza mediante anlisis de expresin. Agendia
tambin tiene varias pruebas de cncer en su cartera, por ejemplo, para la
recurrencia del cncer de colon o ensayos de anlisis de mutaciones para
EGFR, KRAS, BRAF y PIK3CA para seleccionar pacientes apropiados para la
terapia (http://www.agendia.com/managed-care /). El ViroChip descrito
anteriormente es un ejemplo de un dispositivo de diagnstico para
enfermedades respiratorias, que sin embargo no se comercializa como tal por
una empresa sino que se utiliza como una herramienta de investigacin. Sin
embargo, varios productos comerciales estn disponibles o estaban disponibles
para la deteccin de paneles (parcialmente) solapados de virus respiratorios,
basados en microarrays como el mtodo de identificacin (Miller y Tang 2009).
Estos productos incluyen el ensayo ResPlex II de Qiagen (Valencia, CA); El
MultiCode-PLx RVP de EraGen Biosciences (Madison, WI); El Infiniti RVP de
AutoGenomics, Inc. (Carlsbad, CA); El ensayo de ASR del virus respiratorio de
Ngen de Nanogen (San Diego, CA); Y el xTAG RVP de Luminex Molecular
Diagnostics (Toronto, Canad).
Randox tambin ofrece microarrays de ADN en el campo del diagnstico
molecular (http://www.randox.com/evidence.php). Se proporcionan kits de
ensayo para la prediccin del riesgo cardiaco, la hipercolesterolemia familiar, el
ensayo KRAS / BRAF / PIK3CA, la matriz de multiplex respiratorio o una matriz
multiplex para enfermedades de transmisin sexual. Euroimmun Medizinische
Labordiagnostika AG ofrece un sistema de armarios de uso prctico. La
empresa utiliza la llamada tecnologa BIOCHIP. Pequeas placas de vidrio de
microarrays de ADN se adhieren a portaobjetos de plstico EUROArray objeto.
La hibridacin se realiza de forma estandarizada utilizando la tecnologa
TITERPLANE. (Por ejemplo, la deteccin de alelos asociados a la enfermedad
reumtica del antgeno B27 de los leucocitos humanos (HLA-B27) o la
deteccin de alelos asociados a la psoriasis de HLA-Cw6) o un ensayo para la
deteccin de antgenos Tipos de virus del papiloma humano (HPV), se
proporcionan (http://www.euroimmun.de/index.php?idstartseite). Greiner Bio
One International AG tambin ofrece kits de prueba de microarrays certificados
por CE-IVD. Su lnea de productos oCheck comprende microarrays de ADN
para el diagnstico de 24 tipos diferentes de HPV o 20 patgenos periodontales
e incluso un microarrays de ADN para la identificacin de especies animales
para el control de alimentos. Alere ofrece una plataforma de matriz abierta
para el desarrollo de pruebas multiparamtricas para la investigacin y el
diagnstico. El sistema ArrayTube consiste en un microarray personalizado
integrado en un tubo de microrreaccin. La paralizacin es permitida por el
sistema ArrayStrip. Aqu, los ensayos estn disponibles en un formato
compatible con microplacas. Pueden implementarse varios tipos de ensayo,
como cido nucleico, as como matrices basadas en protenas y pptidos. En su
sitio web (http://alere-technologies.com/en/ science-technologies /
publications.html) se ofrece un resumen de las publicaciones pertinentes.
3.1 Dispositivos Lab-on-a-Chip: aplicables para pruebas
multiparamtricas con necesidad de informacin rpida
Hay varios pasos manuales en el diagnstico con microarrays de ADN de la
muestra a resultado como extraccin de cido nucleico, amplificacin o
transcripcin reversa, etiquetado, hibridacin, lectura de datos y anlisis de
datos. Cada paso es un riesgo potencial de contaminacin y errores. Una
posibilidad para superar estas limitaciones es la automatizacin mediante el
uso de los llamados sistemas de anlisis de micro total (TAS) o de dispositivos
de laboratorio (LoC) que permiten una preparacin completa de muestras,
anlisis y lectura en un solo dispositivo cerrado. En tales dispositivos
microfludicos, los volmenes de , nano o incluso picolitros son transportados
a travs de canales de tamao micromtrico y son filtrados, mezclados,
procesados adicionalmente y detectados. A menudo, el transporte de fluidos se
somete a presin, pero tambin se induce mediante flujo electroosmtico o
fuerzas capilares. La automatizacin completa cuenta con varias ventajas,
como la obtencin de volmenes de muestras ms pequeos, un menor riesgo
de contaminacin, un procesamiento ms rpido del anlisis debido a
pequeas formas de difusin, una termodinmica eficiente y una relacin
superficie-volumen favorable, as como capacidades multiplex y de alto
rendimiento. Sin embargo, la implementacin de procesos completos de la
muestra para resultar en dispositivos LoC es compleja. Primero, uno tiene que
implementar unidades funcionales nicas que al final tienen que ser
combinadas para funcionar en concierto en un proceso completo. Desafos
junto a otros son la eleccin del material que tiene que ser compatible con
todas las etapas de ensayo, el proceso de ensamblaje y la modificacin del
ensayo biolgico para una mxima compatibilidad. Muchas instituciones de
investigacin estn trabajando en el desarrollo de dispositivos de LoC. Sin
embargo, revisar stos est ms all del alcance de esta revisin. El enfoque
se centra en dispositivos basados en matriz que han encontrado o pueden
encontrar su camino en el laboratorio de rutina clnica.
Varias compaas estn trabajando en dispositivos de LoC para anlisis de
cidos nucleicos; Algunos de ellos utilizan microarrays de ADN como sistema
de deteccin, como Curetis, una empresa en Holzgerlingen, Alemania, que
utiliza una tecnologa patentada de matriz especial en un dispositivo LoC. La
lisis celular se realiza en una unidad de procesamiento separada. Todos los
dems pasos (purificacin, amplificacin y deteccin) se realizan entonces en
un solo cartucho. La tecnologa Curetis se puede utilizar para diagnosticar
infecciones. Se ofrecen cartuchos certificados CE para la deteccin de
patgenos y marcadores de resistencia para neumona (Unyvero P50) e
implantes e infecciones de tejidos (Unyvero i60 ITI). La autorizacin de la
FDA es aspirada. Nanosphere desarrolla otra solucin completa con deteccin
basada en array. Su sistema Verigene permite la prueba simple de cido
nucleico y protena en una sola plataforma
(http://www.nanosphere.us/technology). Para la deteccin de dianas de ADN o
ARN, se utiliza la tecnologa de sondas de nanopartculas. La extraccin
automatizada de cido nucleico y la amplificacin por PCR a partir de una
muestra clnica tienen lugar en el Verigene Processor SP. Los cidos nucleicos
eluidos se transfieren automticamente a un cartucho de prueba Verigene para
la hibridacin del ADN diana para capturar oligonucletidos en un microarray.
La deteccin se realiza mediante oligonucletidos mediadores especficos y
sonda de nanopartculas de oro; La amplificacin de la seal de las sondas
hibridadas se realiza mediante un proceso de tincin con plata. El anlisis
cualitativo automatizado de los resultados se realiza en el Verigene Reader. Se
tratan enfermedades como infecciones bacterianas o pruebas cardacas.
Rheonix (http://www.rheonix.com/technology/technol ogy-overview.php)
desarrolla la plataforma Encompass. Las tarjetas desechables con reactivos a
bordo y un sistema de deteccin basado en microarrays o qPCR de baja
densidad son el corazn del sistema. La compaa afirma que cada prueba
diseada por el usuario o la futura prueba aprobada por la FDA se puede
ejecutar en su tarjeta debido a la alta flexibilidad del sistema. Programas de
desarrollo de productos para enfermedades infecciosas, farmacogenmica y
aplicaciones ambientales estn en progreso.
Junto a la deteccin basada en microarrays de ADN en dispositivos LoC se
pueden encontrar PCR cuantitativa en tiempo real, deteccin mediada por pH o
tecnologas NGS como estrategia de lectura. Cepheid
(http://www.cepheid.com/us/) ha desarrollado un analizador de benchtop
integrado (GeneXpert) para la deteccin de varios patgenos y marcadores de
resistencia. Tienen un cartucho microfludico en el que se realizan tcnicas de
lisis ultrasnica y multiplex en tiempo real de PCR en tiempo real. La compaa
tiene cartuchos certificados CE para la deteccin de Staphylococcus aureus
resistente a la meticilina (MRSA), por ejemplo, Clostridium difficile (C. difficile),
o norovirus y pruebas aprobadas por la FDA para e. G., MRSA o tuberculosis.
Focus Diagnostics (http: // www.focusdx.com/3m-integrated-cycler/ud-intl)
desarroll el Ciclador Integrado 3M para un sistema analtico basado en
qPCR basado en disco. 96 muestras se pueden ejecutar en paralelo. Se ofrecen
ensayos para la deteccin de infecciones causadas por virus como el dengue,
la influenza y la mononucleosis infecciosa (virus de Epstein-Barr) o para la
deteccin de bacterias como las especies de Bordetella o C. difficile. Idaho
Technologies [ahora BioFire (Biomerieux)] desarrolla una serie de productos
basada en el FilmArray (Poritz et al., 2011). Esta nueva plataforma de
diagnstico combina la preparacin automatizada de muestras, la extraccin
de cidos nucleicos y la deteccin basada en PCR de mltiples objetivos de una
sola muestra sin procesar en 1 h. Combina el anidamiento y la multiplexacin
de la PCR (denominada aqu multiplex anidado o "nmPCR") junto con el anlisis
de la curva de fusin del ADN para detectar y distinguir mltiples patgenos
simultneamente. El FilmArray y el FilmArray Respiratory Panel (RP) bolsa han
recibido desde entonces la aprobacin de la FDA para su uso como un
dispositivo de diagnstico in vitro (IVD). Advanced Liquid Logic
(http://www.liquid-logic.com/technology) que fue adquirida por Illumina en julio
de 2013 tiene una tecnologa microfludica digital que se basa en el uso de
electrowetting para manipular con precisin las gotitas en una superficie. Para
electrowetting, se aplica un voltaje entre una gotita y un electrodo aislado que
puede hacer que la gotita se extienda sobre la superficie y permita la
manipulacin precisa de gotitas dentro de un LoC microfludico sellado. Illumina
est principalmente interesada en ofrecer el flujo de trabajo de secuenciacin
de siguiente generacin (NGS) ms simple y ms eficiente de la muestra para
responder (comunicado de prensa). DNA Electronics (http://dnae.co.uk/
technology / overview /) desarrolla soluciones electrnicas de microchip para la
deteccin de ADN y ARN. Un transistor de efecto de campo sensible a iones
(ISFET) se utiliza para la genotipificacin o secuenciacin basada en
semiconductores. Siempre que se amplifica el ADN o el ARN, se libera un ion H
+ que puede ser detectado por el ISFET. Por lo tanto, se pueden detectar
eventos de hibridacin especficos. Las aplicaciones sanitarias dirigidas estn
en el campo de la investigacin personalizada de la medicina y de la infeccin.
Otra tecnologa de sensores es desarrollada por GeneFluidics. La tecnologa
permite la cuantificacin de cidos nucleicos y protenas en una sola
plataforma con deteccin electroqumica. Se anuncia una alta sensibilidad
incluso en muestras biolgicas no purificadas y no purificadas. Los resultados
se entregan en 1 h. Las superficies del sensor son funcionalizadas por
anticuerpos o ADN. Despus del evento de unin y de las etapas de lavado, se
aplica un anticuerpo secundario con HRP (unin de la enzima reportera). Las
seales que ocurren durante la conversin enzimtica del sustrato de HRP son
proporcionales a la concentracin del analito (http:
//www.genfluidics.com/technology). HandyLab, adquirida por BD en 2009,
desarroll cartuchos desechables con reactivos secos a bordo y tecnologa de
PCR microfludica patentada en tiempo real. Los cartuchos se podan ejecutar
en un instrumento de sobremesa que integraba calefaccin, vlvulas
mecnicas para el control de fluidos y deteccin de fluorescencia. Pruebas
aprobadas por la FDA estaban disponibles para MRSA, C. difficile y
Streptococcus del grupo B. Estas pruebas y una prueba adicional (Enterococci
resistente a la vancomicina) fueron aprobadas para su uso en Europa. Otro
sistema interesante y completamente diferente es el sistema lab-in-a-tube
(sistema Liat ) de IQuum (http://www.iquum.com/products/technology.shtml).
Todos los reactivos de ensayo se preenvasan en segmentos de tubo separados
por sellos desprendibles en el Liat. El Liat es comprimido por los actuadores de
procesamiento de muestras del analizador de Liat de modo que los reactivos se
liberan selectivamente de segmentos de tubo, la muestra se mueve de un
segmento a otro y las condiciones de reaccin se controlan. Puede comenzar
con una variedad de matrices de muestra, incluyendo sangre entera, plasma,
orina y muestras de hisopo. Todos los procesos de ensayo requeridos,
incluyendo la preparacin de reactivos, la purificacin de cidos nucleicos, la
amplificacin y la deteccin en tiempo real, son realizados por el analizador en
20 min-1 h, dependiendo del ensayo. La amplificacin por PCR rpida y la
deteccin en tiempo real estn integrados. Los productos son el Ensayo H1N1
de la Influenza A / 2009 de Liat (slo para investigacin), una deteccin de
ARN viral completamente automatizada en 26 minutos que recibi la
Autorizacin de Uso de Emergencia de la FDA en 2009 (desde que expir) y la
Influenza Liat Ensayo A / B (producto IVD). Los ensayos para el VIH, el CMV,
los subtipos de influenza y el dengue estn en la tubera del producto.

Figura 2. Principio de la matriz de miRNA ZIP-cdigo para la diferenciacin

de maduro (a) y precursor miRNA (b) formas (Weishaupt et al., 2013).
MiARN especficos cZIP-primer con una parte idntica complementaria a la
secuencia de miARN maduro y una cZIP-parte individual se utilizan en las
reacciones de etiquetado individual para cada miRNA analizados. El miARN
maduro (a) se marca con Cy3-dUTP en presencia de dTTP no marcado;
Precursor miARN se marca con Cy3-dATP en presencia de los cuatro dNTP
no marcados. La diferenciacin tiene lugar durante el proceso de
hibridacin (c) en el que los cdigos cZIP individuales se hibridan con sus