HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE EN LOS CROMOSOMAS

De la misma manera que las sondas de hibridación de ácidos nucleicos se utilizan para
Identificar fragmentos de DNA en la transferencia Southern, los especialistas en
citogenética pueden hibridar sondas marcadas con colorantes fluorescentes con el DNA
contenido en los cromosomas e inmovilizado en portaobjetos de microscopio para la
visualización de aberraciones cromosómicas (v. caps. 5 y 6). Esta técnica se denomina
hibridación in situ fluorescente (FISH, fluorescence in situ hybridization) debido a que el
DNA de los cromosomas en metafase fijados en los portaobjetos es desnaturalizado allí
mismo (de aquí la denominación «in Situ») para exponer las dos cadenas de DNA, lo
que permite que una sonda marcada se hibride con el DNA cromosómico. La sonda
hibridada emite fluorescencia cuando los Cromosomas son visualizados con una luz
cuya longitud de onda estimula el colorante fluorescente. A continuación, la localización
de la señal de hibridación y, por tanto, la localización del segmento de DNA con el que
la sonda presenta hibridación, se determina al microscopio.
Una clase de sondas utilizadas con mucha frecuencia para la FISH es un fragmento de
DNA procedente de una localización específica de un cromosoma. Estas sondas dan
lugar a hibridación con marcaje del sitio en cada cromosoma homólogo correspondiente
a la localización normal de la secuencia que constituye la sonda. Una sonda de FISH
también puede ser una mezcla compleja de DNA obtenido de todo 0 parte de un brazo
de un Cromosoma, 0 incluso de un cromosoma completo. Según la constitución de la
sonda, se producirá la tinción de todo 0 parte de un cromosoma con la sonda hibridada
fluorescente. Estas sondas mezcla se denominan sondas de «pintado» cromosómico
(hay ejemplos de ello en los capítulos S y 6). Finalmente, se pueden combinar 24 sondas
de pintado cromosómico distintas, una por cada uno de los 24 cromosomas humanos;
cada una de estas sondas está marcada con una combinación diferente de colorantes
fluorescentes que emiten luz con distintas longitudes de onda.

Cualquier cromosoma humano puede ser marcado con una sonda que emite
fluorescencia con su propia combinación característica de longitudes de onda
luminosas. Después, se pueden combinar las 24 sondas correspondientes a los
cromosomas humanos para aplicarlas en (a FISH de los cromosomas en metafase, una
técnica que se denomina cariotipado espectral (SK Y, spectral karyotyping; v. fig. 5-B,
láminas en color). Dado que cada sonda específica de cromosoma emite su propia
combinación de longitudes dc onda de fluorescencia, con la SKY es fácil detectar los
cromosomas anómalos constituidos por fragmentos de cromosomas diferentes, y
también se pueden identificar fácilmente los cromosomas implicados en el
reordenamiento. La FISH con aplicación de una única secuencia genómica contigua, de
una sonda de pintado cromosómico específica o de una SKY con sondas de pintado
para la combinación de todos los cromosomas, es una técnica que se utiliza con mucha
frecuencia en citogenética clínica diagnóstica para la detección de aberraciones
cromosómicas como deleciones, duplicaciones y translocaciones (v- caps. S y 6).