SEMANA 09:

INSTRUCTIVO PARA LA PRÁCTICA 09

PRUEBA MOLECULAR DE APOYO AL DIAGNÓSTICOCITO:
HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
Introducción.

La citogenética es la disciplina que estudia las implicaciones genéticas de la estructura y el

comportamiento de los cromosomas; define en un sentido Amplio aquella disciplina que
trata sobre la estructura y el comportamiento de los cromosomas, así como de las
implicaciones genéticas derivadas de su estudio, Actualmente, la mayoría de las técnicas de
citogenética molecular se basan en la tecnología de la hibridación in situ fluorescente o
FISH (fluorescent in situ hybridization).

Esta tecnología abrió la posibilidad de estudiar regiones específicas de la cromatina

directamente sobre los cromosomas, gracias a la información derivada de la secuencia
misma del ADN, y no solamente por simples características morfológicas. La citogenética
molecular ha adquirido una importancia cada vez mayor en los diferentes proyectos de
mapeo genético que se adelantan actualmente.

Los llamados mapas citogenéticos o cromosómicos constituyen una etapa intermedia entre
los mapas físicos (basados en el ordenamiento secuencial de grandes fragmentos
cromosómicos) y los mapas genéticos (derivados de los análisis genéticos o de ligamiento).
La disponibilidad de un mapa citogenético permite posicionar los genes, y los marcadores
ligados a éstos, con respecto a los marcadores de tipo estructural propios de regiones
cromosómicas específicas (por ejemplo, centrómeros, telómeros, constricciones
secundarias). En consecuencia, una información citogenética detallada resulta indispensable
para combinar de manera coherente, la información genética disponible con la estructura
física de los cromosomas.

FISH o Hibridación in situ Fluorescente es una técnica que detecta secuencias de ácidos
nucleicos en células o tejidos preservados mediante el empleo de una sonda marcada con
un fluorocromo, la cual va dirigida hacia un lugar específico del cromosoma y que emite
fluorescencia que puede ser observada por medio de un microscopio. La técnica de
hibridación in situ se fundamenta en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para
hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que
resulta complementaria con otra secuencia a través de puentes de hidrógeno formados entre
las bases adenina- timina (DNA) o uracilo (RNA) y citosina-guanina (DNA y RNA).
(Rodríguez y Suescún, 2013, p. 328)
Instrucciones: Lea el siguiente caso clínico y resuelva las preguntas del cuestionario
Caso clínico-práctico
Un niño de 2 años de edad sin antecedentes patológicos de importancia presentó, 2 meses
antes del diagnóstico, astenia, dolor óseo generalizado y pérdida de apetito; al examen
físico, presentó palidez y aumento de las dimensiones del bazo. El hemograma reportó
anemia microcítica (hemoglobina de 11,7 g/dl), hiperleucocitosis (80,8 x109/L) y
trombocitosis (721x109/L). El frotis de la sangre periférica evidenció eritrocitos maduros
microcíticos e hipocrómicos, neutrofilia asociada a basofilia y blastos (1%). El estudio de
biopsia osteomedular reflejó una marcada hiperplasia mieloide (100% de celularidad);
megacariocitos aumentados en número con frecuentes formas pequeñas monolobuladas y
blastos menos del 3% de la población total
El estudio de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) reportó 46, XY, t(9;22)
(q34;q11.2) con el gen de fusión BCRABL1. El test de RT-PCR (Reverse-Transcription
Polymerase Chain Reaction) para BCR-ABL1 fue positivo. Todos los datos obtenidos
confirmaron el diagnóstico de Leucemia Mieloide Crónica en fase crónica.
El paciente inició tratamiento ambulatorio con mesilato de imatinib 200 mg/día en agosto
de 2010; posteriormente, los estudios de enfermedad mínima residual por RT- PCR para
BCR-ABL1 fueron negativos desde el enero 2012 hasta marzo del 2015. (Amaru, et. al,
2016, p. 57)

Figura 1. Cromosoma Filadelfia.

Cromosoma 9 ABL: verde; Cromosoma 22 BCR: rojo

Fuente: (Amaru, et. al, 2016, p. 57)

http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-
89582016000100009&lng=es&tlng=es.
 Cuestionario:
1. ¿Qué es la citogenética molecular?
Es una disciplina que fusiona la citogenética clásica y la biología molecular. En
forma general, agrupa un conjunto de técnicas que aplican diferentes métodos de
la biología molecular directamente sobre preparaciones citológicas tales como
tejidos, células, cromosomas y fibras de ADN
2. Defina la técnica FISH
La FISH es una técnica que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluoróforo para
detectar o confirmar anomalías genéticas o cromosómicas que generalmente están
más allá de la capacidad de resolución de la citogenética de rutina.

Esta técnica puede usarse sobre células en metafase para detectar microdeleciones
específicas más allá de la capacidad de resolución de la citogenética de rutina, o
para identificar material extra de origen desconocido.

A la vez se puede usar sobre células en interfase para determinar el número de

copias de uno o varios cromosomas, así como para detectar algunas
reorganizaciones específicas que son características de ciertos tipos de cáncer. La
ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rápidamente
si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere cultivo para la
proliferación de las células.

3. Pasos para la técnica de FISH

En primer lugar, la muestra de DNA (cromosomas metafásicos o núcleos en
interfase) se desnaturaliza, proceso que separa las hebras complementarias de la
estructura bicatenaria en doble hélice del DNA.

A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés, que se

asociará al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso denominado
hibridación, donde se vuelve a formar una doble hélice.

La sonda está unida covalentemente (marcada) con un fluoróforo, que emite una
señal observable mediante un microscopio de fluorescencia; así la muestra de DNA
se puede clasificar según la presencia o ausencia de la señal, lo que desvela la
presencia o ausencia de la secuencia diana en el DNA cromosómico.

Existen una gran variedad de fluorocromos que pueden utilizarse para el

marcado de las sondas, emitiendo así señales de fluorescencia diferentes. La
utilización de sondas marcadas con diferentes fluorocromos permite la
hibridación de múltiples sondas sobre una única muestra aportando valor
añadido a la técnica de FISH (multi-FISH).
4. ¿La técnica FISH permite el estudio de la expresión del ARN? ¿Por qué?
Sí, ya que la hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que
permite la detección de ácidos nucleicos en las células (ADN o ARN); además
existe la técnica ARN FISH que se puede usar para detectar moléculas de ARN en
las células y se proporciona información importante en la regulación de la expresión
génica.

5. ¿La técnica FISH solo nos permite analizar cromosomas en metafase?

No, también permite analizar cromosomas en interfase ya que no siempre es posible

tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH
6. Cuál es la diferencia entre la hibridación cromogénica in situ (CISH) y FISH.

7. Interprete la figura 1
Se observa una translocación recíproca entre el cromosoma 9 (verde) y el
cromosoma 22 (rojo); observamos la señal de cada color fusionado en el mismo
punto. Esto indica que se trata de una imagen obtenida de un paciente con
leucemia mieloide crónica. Más importante aún, el cromosoma observado con dos
colores es el "cromosoma Filadelfia", que se da por la translocación recíproca
entre los brazos largos del cromosoma 2 y el cromosoma 9, lo que da como
resultado a un cromosoma 22 más pequeño y un cromosoma 9 más grande.

Conclusiones:
● La hibridación in situ (FISH) es un técnica rápida, con gran especificidad y
sensibilidad, incluso en células pequeñas; pero, su precisión se puede ver
alterada por una variedad de factores como la calidad de la sonda y de la
fijación, los reactivos de detección y la temperatura de desnaturalización.
● Los tumores hematológicos tienen un origen clonal y tienen una gran
heterogeneidad genética.
● La técnica FISH es muy útil para diagnosticar e identificar aneuploidías y
poliploidías.
 Referencias bibliográficas
Amaru, A., Peñaloza, R., Miguez, H., Patón, D., Oropeza, M. y Amaru, R. (2016). Leucemia
mieloide crónica en niño de 2 años. reporte de caso. Revista Médica La Paz, 22(1), 55-
58.http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-
89582016000100009&lng=es&tlng=es.
Herrera, J. C. (2007). La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas
vegetales. Agronomía Colombiana, 25(1), 26-35.
https://search.proquest.com/scholarly-journals/la-citogenética-molecular-y-su-
aplicación-en-el/docview/1677586702/se-2?accountid=37408
Rodríguez, R. y Suescún, O. (2013). Aplicaciones e inconvenientes de la técnica hibridación in
situ fluorescente (FISH) en la identificación de microorganismos. Salud Uninorte, 29(2)
https://search.proquest.com/scholarly-journals/aplicaciones-e- inconvenientes-de-la-
tecnica/docview/1464952583/se-2?accountid=37408
 SEMANA 9
PRÁCTICA DE EMBRIOLOGIA 09: DESARROLLO EMBRIOLÓGICO DE LA
PIEL Y SUS ANEXOS - I

1. INTRODUCCION
La piel y sus estructuras asociadas permiten a los seres vivos vivir en los diferentes ambientes
ecológicos. La primera y más importante función es establecer una barrera entre el organismo y el medio
ambiente, manteniendo así la homeostasis interna, reduciendo la fricción de los elementos externos y
protegiendo de rasguños y picaduras de predadores. Adicionalmente la pigmentación y el olor de las
glándulas cutáneas permiten una comunicación social y sexual.
Estructuralmente, la piel está constituida por 2 capas: la epidermis y la dermis que provienen de
diferentes orígenes embrionarios.
LA EPIDERMIS:
Se origina del ectodermo superficial, con participación de la cresta neural y del sistema hematopoyético.
Alrededor de la 2°a 3° semana el esbozo de la epidermis consiste en una CAPA ÚNICA DE CÉLULAS
ECTODERMICAS INDIFERENCIADAS.
Después de la gastrulación el ectodermo superficial está conformado por una sola capa de células que
da origen al sistema nervioso y a la epidermis. Para que el ectodermo desarrolle su diferenciación hacia
epidermis, tienen que expresar proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y también es necesaria la acción
de las moléculas señalizadoras WNT para bloquear a los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF),
ya que si se expresan estos factores de crecimiento el ectodermo se diferenciará a tejido nervioso.
Después de la neurulación la epidermis inicia su desarrollo como una capa única de células epiteliales.
Alrededor de la 5° a 7° semana, las células del ectodermo proliferan y dan origen a una SEGUNDA
CAPA SUPERFICIAL llamada PERIDERMO; en éste momento la epidermis está formada por 2 capas:
la CAPA BASAL O GERMINATIVA con actividad mitótica, compuesta por laminina y fibras
colágenas en la zona de la membrana basal y, el PERIDERMO que es una capa de células aplanadas
con alto contenido de glucógeno que interviene en el intercambio de agua, sodio y posiblemente de
glucosa entre ella y el líquido amniótico.
Alrededor de la 8° a 12° semana de desarrollo, la capa basal prolifera y se forma la TERCERA CAPA
entre ésta y el peridermo, llamada CAPA INTERMEDIA. Las células de la capa intermedia se
diferencian para formar la CAPA ESPINOSA. A medida que avanza el desarrollo, las células de la capa
espinosa se diferencian para formar la CAPA GRANULAR, las cuales finalmente dan origen a la CAPA
CÓRNEA.

Al final del 4° mes se pueden reconocer las capas características de la epidermis posnatal; cuando éstas
capas ya están diferenciadas, desaparece el peridermo (aproximadamente en la semana 21). Las células
peridérmicas que presentan apoptosis y descamación van hacia el líquido amniótico y junto con las
células que se descaman del estrato córneo y el sebo de las glándulas sebáceas van a formar la VERNIX
CASEOSA.
La DIFERENCIACIÓN DE LA EPIDERMIS se inicia a partir de las células madre localizadas en la
capa basal, las cuales se dividen y dan origen a las células hijas llamadas CÉLULAS
TRANSITORIAMENTE AMPLIFICADAS, estas después de algunas divisiones se retiran del ciclo
celular, salen de la capa basal y comienzan a desplazarse hacia la superficie de la epidermis para llevar
a cabo su diferenciación terminal. Para permitir la MIGRACIÓN CELULAR, tiene que haber pérdida
de adhesión a los componentes de la lámina basal como fibronectina, la laminina y el colágeno de los
tipos I y IV. Para poder migrar desaparecen las integrinas de los hemidesmosomas que anclan las células
 basales a las moléculas de la membrana basal de la epidermis, así como las cadherinas de los
desmosomas de las uniones intercelulares.
Durante el desarrollo de la epidermis prenatal, la expresión de diferentes patrones de citoqueratinas se
considera como marcadores de diferenciación. Se ha correlacionado la expresión de las proteínas de
queratina con estadios específicos de diferenciación epidérmica Las células del peridermo expresan las
queratinas K8 y K18. Las queratinas K5, K14 y K15, se expresan en la lámina basal, pero cuando se
desarrolla el estrato espinoso las células de esta v capa expresan K1 y K10.
La diferenciación de la epidermis implica la participación de un gran número de factores de transcripción
y de factores de crecimiento. El primer paso es la activación de genes progenitores que generan una capa
epitelial (el estrato basal). Uno de los factores más importantes es p63, un regulador maestro del
desarrollo epidérmico, pero junto con la activación de p63 se produce la inhibición concomitante de un
conjunto de factores de transcripción (MAF y MAFB), que promueven la diferenciación epidérmica. La
progresión de las células del estrato basal al estrato espinoso requiere desactivar los genes progenitores
epidérmicos y activar los genes de diferenciación epidérmica; estos cambios están provocados por la
activación de p63, por las acciones combinadas de los factores de transcripción MAF/MAFB y por la
señalización de Notch. La última diferenciación, que transporta las células epidérmicas desde el estrato
granuloso al estrato córneo requiere desactivar la actividad p63 a través de la acción de un microARN
miR-203 dentro de las células del estrato granuloso, con este cambio las células salen del ciclo celular.

La transcripción del gen P63 es un factor clave en el control de la morfogénesis de la piel, ya que participa
en varios procesos del desarrollo de la epidermis: Mantiene el potencial proliferativo de las células madre
epidérmicas. Es necesario para la formación de las capas de la epidermis. Interviene en la diferenciación de
los queratinocitos. Es importante para la adhesión entre los queratinocitos. Controla la adhesión de los
queratinocitos a la membrana basal y la formación de ésta. Participa en la formación de la barrera
epidérmica. Desempeña un papel importante en la interacción epitelio- mesénquima, indispensable en el
desarrollo de los anexos de la epidermis.
Las alteraciones en la expresión del gen p63 están asociadas con el desarrollo de displasias ectodérmicas.
ORIGEN DE LAS CÉLULAS EPIDÉRMICAS: Tienen diferentes orígenes:
QUERATINOCITOS: Provienen del ectodermo superficial después de la neurulación. Forman el
epitelio plano estratificado de la epidermis.
MELANOCITOS: Se originan al final de la etapa embrionaria cuando las células de la cresta neural
migran a la dermis en desarrollo y de ahí a la epidermis, estas células desarrollan abundantes
prolongaciones ramificadas, diferenciándose a melanoblastos. Cuando los melanoblastos inician la
producción de melanina se diferencian a melanocitos. Estos melanocitos no desarrollan desmosomas ni
otro mecanismo de adherencia con los queratinocitos. Si por alguna causa el proceso de producción de
la melanina no es adecuado, da lugar a varias enfermedades de la piel, por lo que no presentan su color
normal.
CÉLULAS DE LANGERHANS: Son células presentadoras de antígeno que se originan en la médula
ósea. Migran hacia la epidermis al final de la semana 12, alojándose principalmente en el estrato
espinoso donde terminan su diferenciación, no establecen adhesión a través de desmosomas con los
queratinocitos, son responsables del reconocimiento de antígenos presentes en la epidermis, para
tratarlos y presentarlos a los linfocitos T, induciendo una respuesta inmunitaria.
CÉLULAS DE MERKEL: Se originan de las células madre epidérmicas a través de un proceso de
maduración regulado por activación secuencial de genes específicos. Están presentes desde la semana 8
de desarrollo prenatal. Se localizan entre las células basales a las cuales están adheridas por desmosomas
y contienen filamentos de queratina en su citoplasma. Funcionan como mecanorreceptores de tacto
ligero que son necesarios para la discriminación de forma y textura de objetos. Son abundantes en los
pulpejos de los dedos, palmas y plantas.

2. COMPETENCIAS DEL LOGRO

2.1. Refuerza los conocimientos teóricos sobre el desarrollo embriológico de la piel y sus derivados.
2.2. Reconoce y explica la morfología y la función de las estructuras embriológicas de la piel y sus
derivados

3. CONSIDERACIONES

La construcción de los tejidos del organismo implica distintos fenómenos de desarrollo en dos niveles
de organización. El primero es el nivel de las células individuales, en el que cada una de las células que
constituye un tejido experimenta una especialización progresiva a través de un proceso denominado
citodiferenciación. En el siguiente nivel de complejidad, varios tipos celulares se desarrollan de un modo
coordinado para originar tejidos específicos a través de un proceso denominado histogénesis
La piel junto con sus estructuras anexas (pelo, uñas y glándulas) se originan en el ectodermo superficial.
Los melanocitos, que dan color a la piel, provienen de las células de la cresta neural que migran hacia
el interior de la epidermis. Las células nuevas se producen en la capa germinativa. Una vez que llegan a
la superficie, las células se desechan en la capa córnea. La dermis, o capa profunda de la piel, procede
del mesodermo de la placa lateral (extremidades y pared corporal), de los dermatomas que se desarrollan
a partir de los somitas en el mesodermo paraxial (espalda) y de las células de la cresta neural (cara y
cuello).

4. CONTENIDO:
OBSERVE Y DESCRIBA CADA UNA DE LAS SIGUIENTES IMÁGENES SOBRE
DESARROLLO EMBRIOLOGICO DE LA PIEL

En la imagen 1:
 IMAGEN 1: Fotomicrografía de piel de feto humano
DESCRIPCIÓN:
2.- Figura “A”: Fotomicrografía de piel de feto humano:
a.- Reconozca las estructuras numeradas.
1. Dermis
2. Capa Basal
3. Peridermo
b.- Respecto a la estructura “3”, comente: Semana de desarrollo, función, destino final.
El Peridermo es una capa transitoria de células aplanadas, se forma en la 7ma semana, a partir de la
proliferación de las células del ectodermo, conforme avanza el desarrollo, las células de la capa basal
continúan proliferando y es a finales del cuarto mes en el que podemos reconocer a cuatro capas: estrato
basal, espinoso, granuloso, córneo. Una vez que están formadas estas capas, las células del peridermo
presentan apoptosis y descamación continua y son sustituidas por células del estrato germinal.
Las células de peridermo se desprenden hacia el líquido amniótico que junto con las células de las glándulas
sebáceas formarán la vernix caseosa, la cual va a proteger la piel del feto de la exposición al líquido
amniótico.

En la imagen 2:
 Fotomicrografía de piel de feto humano
a.- Reconozca las estructuras enumeradas, e indique la semana de desarrollo a la que
corresponde.

Número 1: Yema del pelo, comienzos de la novena semana

Número 2: Capa basal, séptima semana

Número 3: Peridermo, séptima semana

Número 4: Capa intermedia, décima semana

b.- Explique cómo se ha desarrollado la estructura “4”.

A partir de la décima semana, las células de la capa basal o germinativa (capa más profunda de la
epidermis) proliferan formando una capa entre la capa basal y el peridermo denominada capa intermedia
la cual contribuye a la formación de la epidermis queratinizada madura. Después, las células de la capa
intermedia sufren un proceso de diferenciación de modo que forman la capa espinosa que es la primera
capa suprabasal.
En la imagen 3:

Fotomicrografía de piel de feto humano.

a.- Mediante un esquema muestre la diferenciación de la epidermis. Señale que

procesos del desarrollo participan en la formación de la epidermis.
b.- Indique la semana a la que corresponde; que tipo de piel es la que se muestra en
la figura 3. Explique
Corresponde a un bebe recién nacido, observando a los melanocitos en la capa basal de
la epidermis y la forma en la que sus prolongaciones se extienden entre las células
epidérmicas para la transferencia de melanina.
TIPO DE PIEL: Piel gruesa por la presencia de los 5 estratos.

Elabore de autoría grupal, un organizador gráfico donde se muestre el origen

embriológico de la piel.
CONCLUSIONES:

● Estructuralmente, la piel está constituida por 2 capas: la epidermis y la dermis que

provienen de diferentes orígenes embrionarios.
● Las interacción entre el ectodermo (epidermis) y el mesénquima (dermis) involucran
mecanismos inductivos por la vía de señalización WNT, el Factor de crecimiento
Fibroblástico (FGF) o el factor β de crecimiento transformador (TGF-β ).

5. BIBLIOGRÁFIA
● Arteaga, M y Garcia, I. Embriología humana y biología del desarrollo. 2°ed.
Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2017.
● Sadler, T. Langman: Embriología Médica. 14.ª ed. Madrid: WOLTERS KLUWER;
2019.
● Carlson, B. Embriologia humana y biología del desarrollo. 5° ed. Elsevier España. 2014.
● Moore K.L. Embriología clínica. 11ª ed. Barcelona, España: Elsevier; 2020