CROMATOGRAFA.

A.- INTERCAMBIO IONICO: A.1. ANIONICA A.2. CATIONCA

B.- FILTRACIN EN GEL

C.- AFINIDAD

A. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO. Usos 1.- Purificar Protenas 2.- Concentrar Protenas Ventajas a.- Alta resolucin b.- Fcil de usar c.- Resultados altamente reproducibles d.- Bajo costo.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO La separacin por cromatografa de intercambio inico depende de la adsorcin reversible de una molcula de soluto cargada a un grupo de intercambiadores inicos inmovilizados de carga opuesta. La mayora de los experimentos de intercambio se realizan en cinco etapas: 1. Equilibrio de la matriz (pH, fuerza inica) 2. Adsorcin de la muestra 3. Comienzo de la remocin 4. Fin de la remocin 5. Regeneracin de la matriz

1. Principios. La protena desplaza a un ion de bajo peso molecular que se encuentra unido a una matriz de intercambio inico y se une a ella. Es necesario que la protena tenga una carga neta. 1.a. Punto isoelctrico de la protena. Se debe usar un pH que difiera en una unidad del pI de la protena. La protena debe tener una carga neta suficiente para unirse a la matriz, pero no tanta para que se requieran condiciones muy extremas para ser eluda (alta fuerza inica o cambios significativos de pH) 1.b. Unin de la protena a la matriz. La matriz y la protena deben tener cargas opuestas. Matriz con carga positiva, DEAE (dietilamino etilo): intercambio aninica, Matriz con carga negativa, CM (carboximetil): intercambio catinica. 1.c. Purificacin de una protena. Unin diferencial de las protenas a la matriz, (cargas netas diferentes). Las protenas se unen a la matriz con distintas afinidades, se separan usando diferentes concentraciones de sal o variando el pH.

La resolucin (Rs) de una cromatografa de intercambio inico es una medida de la separacin relativa entre dos picos y se puede usar para determinar si es necesaria una optimizacin del procedimiento cromatogrfico. Rs Selectividad x Eficiencia x Capacidad Selectividad. Define la habilidad del sistema para separar los picos, es decir, la distancia entre dos picos Eficiencia. Se relaciona con el ancho de los picos de elucin. Capacidad. Es una medida de la retencin de un componente y no se debe confundir con la capacidad de carga.

Resolucin

Selectivity VR2- V0 VR1-V0

Efficiency 2 VR1 wh

N= 5.54

W= ancho del pico

Vo= Volumen vac o; VR1= Volumen de elucin de peak 1; VR2= Volumen de elucin peak 2; Vt = Volumen total; w1= Ancho de peak 1; w2= Ancho de peak 2; w3= Ancho de peak 3.

Determinacin de la resolucin (Rs) entre dos peaks

Separacin con diferente resolucin

1.d. Estrategias de elucin. Para romper las interacciones electrostticas entre la protena y la matriz, se eleva la concentracin del contra-ion (sal). Contra iones (sodio o cloruro, bajo PM), a.- en concentraciones bajas : son desplazados por la protena, b.- en concentraciones altas : compiten con la protena. 1.e. Elucin con diferentes contra-iones. Diferentes contra iones tienen diferente afinidad por la matriz. Si falla la elucin de la protena con un contra ion, se puede utilizar uno que tenga una mayor afinidad por la columna. 1.f. Otras estrategias de elucin. Al cambiar el pH del buffer, cambia la afinidad de unin de la protena. La disminucin de la afinidad se debe a una disminucin de la carga neta de la protena. Chromatofocusing, es una forma especial de cromatografa de intercambio inico, en donde las protenas se separan en base a la diferencia en los pI.

2. Seleccin de la matriz de intercambio inico Protena con carga negativa: matriz de intercambio aninica. Protena con carga positiva: matriz de intercambio catinica.

2.a. Tipo de intercambiador. Matrices de intercambio inico : Fuertes: permanecen ionizadas en todo el rango til de pH. Dbiles: disminuyen su ionizacin en funcin del pH. Si las condiciones de la cromatografa requieren pH extremos, se debe utilizar un intercambiador inico fuerte.

2.b. Velocidad de flujo. La resolucin de la columna depende del flujo de la columna. 2.c. Capacidad de la matriz. La capacidad de carga determina la cantidad de protena que une. Para una resolucin alta, se debe usar solo una pequea fraccin de la capacidad (10-20%). 2.d. Estabilidad de la matriz a diferentes pH. Es importante cuando se usan condiciones de pH extremas. A pH extremos, las matrices dbiles pueden estar parcialmente ionizadas, por lo tanto se debe usar una matriz fuerte. 3. Elucin de la Muestra La protena unida a la matriz puede ser eluida: a) aumentando la fuerza inica en concentraciones discretas, b) aumentando la concentracin en forma gradual, en una gradiente lineal.

4. Algunos problemas. 4.a. La protena no se absorbe a la matriz. 1. La fuerza inica inicial puede ser muy alta. 2. El pH de la columna puede no ser el adecuado. 3. La columna puede no estar equilibrada adecuadamente. 4.b. Rendimiento bajo. El rendimiento normal es de 60-80%. Un rendimiento mas bajo pueden ser porque: 1. La protena permanece unida a la columna; se requiere una fuerza inica mayor. 2. El pH de la columna no es el adecuado. Si el pH es muy diferente al pI, la protena se puede unir muy fuertemente a la columna. 3. Se ha perdido un cofactor. 4. Una proteasa est presente en la preparacin.

4.c. Baja resolucin. 1. El flujo de la columna es muy rpido. 2. La columna es muy corta para permitir una adecuada separacin. 3. Se ha cargado mucha protena en la columna. 4. La pendiente de la gradiente es muy inclinada. 4.d. Prdida de actividad. 1. Prdida de un cofactor. 2. La protena no es estable en las condiciones de elucin. 4.e. Aumento de la actividad. 1. Se ha removido un inhibidor.

A.2. Concentracin de una Solucin de Protenas. Se lava con un pequeo volumen de una solucin de fuerza inica alta. Se obtiene, de manera rpida y simple, una solucin concentrada de protena. El rendimiento (60-80%) es similar al esperado en una precipitacin con sulfato de amonio.