ANALISIS DE SEMILLAS

Introducción
La semilla de alta calidad es uno de los principales insumos que se requieren para
lograr mayor productividad; aumentar su uso es primordial para la mayor producción
de granos. En muchos países en desarrollo, la mayor parte de la semilla usada es la
del propio agricultor, guardada desde la cosecha anterior, la cual no es sometida a
certificación y su calidad es desconocida.

El principal objetivo del análisis de semillas es servir al productor, consumidor e

industria semillerista.

Los ensayos de calidad más importantes realizados en los laboratorios de análisis

de semillas son la pureza y la germinación, estos determinan el valor de las semillas
para la siembra. Por ejemplo, conociendo el porcentaje de pureza física y de
germinación de un determinado lote, es posible determinar el Valor Cultural (V.C.),
el cual permite calcular la cantidad de semillas que se deben utilizar en la siembra:

V.C. = % de pureza x % de germinación

100

Otros ensayos son también importantes y siempre que sea posible, hacen parte de
normas oficiales como: determinación de otras especies en número; verificación de
especies y variedades; determinación del peso de 1000 semillas; contenido de agua,
etc.

Muestreo
El objetivo del muestreo es obtener una muestra de tamaño adecuado donde estén
presentes todos los constituyentes y en las mismas proporciones que lo están en el
lote de semillas. Para tomar la muestra es necesario comprobar que el lote sea lo
mas uniforme posible, que no presente durante el muestreo signos de
heterogeneidad.

La muestra debe tener un peso mínimo por especie y un peso máximo de 1.000g.
Se obtiene de la combinación y mezcla de todas las muestras primarias (puntos de
muestreo del lote) cuyo número obedece a la intensidad de muestreo.

Conceptos
a) Lote, es una cantidad limitada de semillas identificables físicamente por letra y/o
número donde cada porción debe estar dentro de límites fijados y ser uniforme,
permitiendo la emisión de un certificado nacional o internacional de análisis.

b) Muestra primaria, es una pequeña porción de semillas tomada al azar de

diferentes sitios del lote obedeciendo a la intensidad de muestreo.

c) Muestra global, es una porción de semillas obtenida mediante la combinación y

mezcla de todas las muestras primarias tomadas del lote.

d) Muestra de envío, es la muestra que se remite al laboratorio de análisis de

semillas - LAS; comprende la muestra reducida al tamaño y peso adecuado, deberá
estar claramente identificada en relación con el lote y deberá estar envasada de
manera que se evite cualquier daño o alteración en las condiciones de las semillas
durante su transporte hasta el laboratorio. Si se destina solamente para los ensayos
de pureza y germinación, deberá estar acondicionada en envases permeables; si se
destina a la determinación del contenido de agua deberá estar acondicionada en
envases herméticos.

e) Muestra de trabajo, es la muestra obtenida en el LAS también por mezclas y

divisiones sucesivas de la muestra de envío. En esta se realizará el ensayo o los
ensayos.

Forma de operar para obtener la muestra de envío

Para emitir el Certificado de un lote de semillas, la persona o el inspector de semillas
responsable por la obtención de la muestra de envío deberá observar los siguientes
requisitos:

1) Tamaño del lote, no deberá exceder la cantidad indicada en la Tabla 1, sujeta a

una tolerancia del 5%. Por ejemplo, para las especies como la soya, arroz, trigo y
maíz, el lote deberá tener un peso máximo de 20 kg, para las especies hortícolas,
un máximo de 10 kg, al igual que para la mayoría de las especies de forrajeras. En
caso que un lote de semillas exceda dicha cantidad, se subdividirá y cada una de las
subdivisiones se identificarán por separado.

TABLA 1. Pesos de lote, muestras y número de semillas por gramo utilizados para
análisis de varias especies.
PESO MÍNIMO DE NÚMERO DE
PESO MÁXIMO MUESTRAS (gramos)
ESPECIE SEMILLAS
DEL LOTE (kg)
1* 2* 3* POR GRAMO
Avena sativa 20 1.000 120 1.000 30 - 50
Glycine max 20 1.000 500 1.000 06 - 13
Gossypium spp 20 1.000 350 1.000 07 - 09
Helianthus annuus 20 1.000 200 1.000 10 - 20
Hordeum vulgare 20 1.000 120 1.000 25 - 35
Lolium multiflorum 10 60 06 60 500
Oryza sativa 20 400 40 400 26 - 40
Phaseolus vulgaris 20 1.000 700 1.000 4 -7
Psium sativum 20 1.000 900 1.000 03 - 04
Secale cereale 20 1.000 120 1.000 40
Sorghum bicolor 10 900 90 900 50 - 60
Trifolium repens 10 25 2 20 1.750
Triticum aestivum 20 1.000 120 1.000 25 - 30
Zea mays 20 1.000 900 1.000 03 - 04
1* muestra remitida al laboratorio
2* muestra para análisis de pureza
3* muestra para examen de semillas de otras especies presentes

2) Uniformidad del lote, debe ser lo más uniforme posible y no debe presentar
durante el muestreo signos de heterogeneidad. En caso de una evidente
heterogeneidad, se debe rechazar el lote.
3) Envases, el lote deberá estar envasado, sellado y etiquetado para su
identificación. No debe emitirse un certificado del lote en caso de semillas a granel o
almacenadas en envases que no puedan sellarse.

4) Etiquetado y empaquetado del lote, se considerarán etiquetados los lotes que

presenten una referencia simple de identificación similar a la que se refleja en el
certificado; y empaquetados si es evidente que no se puede abrir sin destruir el
paquete.

5) Aparatos, siempre que sea posible se tomarán las muestras con ayuda de
instrumentos llamados sondas, del tipo de la sonda bastón o del tipo Nobbe. La
primera es de longitud y diámetro variables y adecuados a las diferentes especies
de semillas y a los diferentes tamaños de envases, sus dimensiones deberán ser de
762 mm para semillas ensacadas de cereales y otras que se deslicen con facilidad;
pero el diámetro exterior para los tréboles será de 12,7 mm y para los cereales de
25,4 mm. Las utilizadas para silos deberán llegar hasta 1600 mm de longitud y 38
mm de diámetro. La sonda tipo Nobbe es un tubo puntudo suficientemente largo
para penetrar hasta el centro de los sacos y con un orificio oval en la proximidad de
su punta, su longitud total es de 600 mm lo que permite una penetración hasta la
parte central de los sacos; para los cereales, el diámetro interior del tubo debe ser
aproximadamente 14 mm, para los tréboles y para otras semillas del mismo tamaño
son suficientes 10 mm. Este tipo de sonda no es adecuada para el muestreo de
semillas a granel.

6) Muestreo a mano, para algunas especies de semillas pajosas como Lolium,

Andropogon, Holcus, Panicum etc., el muestreo a mano es el método más
satisfactorio pero es imposible muestrear a una profundidad superior a 400 mm.

Almacenamiento de las muestras

Es necesario esforzarse para comenzar el ensayo de la muestra en el mismo día de

su recepción en el LAS. Si no es posible, deberá ser almacenada en un lugar frío y
ventilado para evitar cualquier cambio en su calidad. En caso de que sean
necesarios nuevos análisis, las muestras deberán ser conservadas durante un largo
período en locales especiales con temperatura y humedad controladas. Éstas
podrán ser conservadas durante un año.

ANÁLISIS DE PUREZA

Es una de las pruebas más importante que se realiza en los laboratorios de análisis
de semillas, ya que permite:

a) La determinación de la composición en porcentaje por peso de la muestra que se

analiza y por consiguiente del lote de semillas, y

b) La identidad de las distintas especies de semillas y de las partículas de materia

inerte constituyentes de la muestra.

La muestra de trabajo se clasifica en tres componentes: semilla pura, otras

semillas y materia inerte, determinándose el porcentaje de cada uno por peso.
Componentes

Semilla pura, son todas las semillas de la especie indicada por el expedidor
(productor en general) o encontrada como predominante en el análisis, incluyendo
todas las variedades botánicas y cultivares de dicha especie. Los elementos
incluidos en esta fracción comprenden:

a) Semillas maduras y no dañadas de la especie considerada;

b) Semillas de un tamaño inferior a la normal, arrugadas, no maduras, germinadas,
siempre que puedan identificarse como pertenecientes a la especie considerada,
con excepción de aquellas que hayan sido transformadas por los patógenos;
c) Fragmentos de semillas resultantes de roturas cuyo tamaño sea superior a la
mitad del tamaño original, si la semilla tiene una abertura en la testa, el analista
deberá decidir si la parte restante es superior a la mitad del tamaño original. Si esta
determinación no se puede hacer con facilidad, la semilla se considerará pura;
d) Flósculos de gramíneas y de cereales así como las espiguillas uniflorales con
evidente endospermo;
e) Coriópsides desnudas de gramíneas y de cereales desprovistas de sus glumas
(palea y lemma).

Otras semillas, se incluyen todas las semillas y seudo semillas de cualquier

especie distinta a la de la semilla pura y con las mismas características diferenciales
establecidas para ellas.

Materia inerte, se incluyen:

a) Fragmentos de semilla de la especie en examen y de semillas de otras especies

de cultivo cuyo tamaño es igual o inferior a la mitad de su tamaño original;
b) Semillas de leguminosas, crucíferas y coníferas cuyos tegumentos se hayan
desprendido por completo, así como las estructuras en que sea evidente que no
existe una semilla verdadera;
c) Flósculos vacíos de malezas y de especies de cultivo que sólo contienen anteras
u ovarios sin desarrollar;
d) Glumas vacías, lemas, paleas, flores estériles sueltas, tierra, arena, piedras,
tallos, agallas de nemátodos, esclerocios de hongos, etc.; o sea, todas las demás
materias que no sean semillas.

Forma de operar

El análisis de pureza se efectuará sobre una muestra de trabajo obtenida de la

muestra de envío y cuyo peso está de acuerdo con lo exigido para la especie Ej.:
trigo 120g, soya 500g, maíz 900g, etc.

El análisis puede efectuarse aún sobre dos submuestras de la mitad de este peso,
como mínimo y tomadas independientemente.

La separación de los componentes en semillas puras, otras semillas y materia inerte

se basará en un examen visual o mecánico de cada partícula de la muestra y según
sus características de manera de no destruir la semilla para que no se modifique su
capacidad de germinar.
Cálculo y expresión de los resultados

El porcentaje en peso de cada constituyente se calculará con una cifra decimal. Los
porcentajes se basarán en la suma de los pesos de los componentes y no en el
peso inicial de la muestra de trabajo; así todo, la suma de los pesos de los
componentes deberá compararse con el peso inicial, como comprobación de una
posible pérdida de material o cualquier otro error.

Indicación de los resultados

Los porcentajes de semilla pura, otras semillas y materia inerte se anotarán en los
espacios correspondientes del certificado de análisis. Para los componentes
menores de 0,05% se indicarán como "TRAZAS" y para el resultado nulo se
expresará 0,0.

Se anotará el nombre latino de la especie y de las especies de otras semillas.

Cuando una clase particular de materia inerte o alguna especie de otras semillas
alcance o sobrepase el 1%, se indicará su porcentaje en el certificado.

Aparatos

Entre los equipos y materiales necesarios para la realización del análisis de pureza
están la luz reflejada y harneros para separar las flores estériles de gramíneas y los
fragmentos de semillas procedentes de roturas, ataques de enfermedades/insectos;
así como los aventadores de semillas para separar los constituyentes livianos como
pajas y flores vacías de gramíneas, de las semillas mas pesadas; lentes; balanzas
sensibles y muestrario de semillas.

DETERMINACIÓN DE OTRAS ESPECIES EN NÚMERO

En el comercio, este análisis se utiliza para determinar la presencia de semillas

perjudiciales o no deseables.

La determinación se realiza por un conteo e identificación con el nombre latino de

este tipo de semillas encontradas en la muestra de trabajo. El resultado se expresa
como el número de semillas encontradas en la cantidad real examinada. La muestra
de trabajo tiene un peso de 5 a 10 veces mayor que el peso exigido para el análisis
de pureza.

Para tener una idea de la importancia de esta determinación, para la aprobación de

un lote de semillas de soya para su comercialización en el Estado de Río Grande do
Sul, Brasil, éste puede presentar apenas una semillas de otra especie cultivada y
ninguna de las consideradas silvestres nocivas por 1000g de muestra analizada.

VERIFICACIÓN DE ESPECIE Y CULTIVAR

El objeto de este examen es determinar los límites dentro de los cuales la muestra
remitida corresponde a la especie o cultivar indicado. Esta determinación es válida
solamente si el remitente de la muestra señala la especie y el cultivar, así como si
dispone en el laboratorio de una muestra de referencia para efectuar la
comparación. Los caracteres comparados pueden ser morfológicos, fisiológicos,
citológicos o químicos y se usan otros métodos no utilizados en el análisis de
pureza.

Según la especie, la determinación se efectúa sobre las semillas, plántulas o plantas

cultivadas en laboratorio, invernadero, cámaras o parcelas en el campo.

En el caso de especies o cultivares que sean uniformes en uno de los varios

caracteres de identificación (especies autógamas) se efectúa un conteo de las
semillas, plántulas o plantas que no se consideren genuinas. En el caso que esto no
ocurra (especies alógamas) se hace un conteo de todos los individuos claramente
fuera de tipo y se emite un resultado de conjunto sobre la autenticidad de la muestra
de ensayo.

Examen en semillas

La muestra de trabajo deberá ser como mínimo de 400 semillas (4 repeticiones de

100) tomadas al azar.

Se observan los caracteres morfológicos como tamaño, forma y color de las

semillas, en el caso de los cereales, son necesarios aparatos de aumento
adecuados, la luz del dia o la luz de un espectro limitado como la luz ultravioleta.

Para observar las características químicas, fisiológicas, citológicas o patológicas, las

semillas serán tratadas con el reactivo apropiado y su reacción será anotada.

Examen en plántulas

La muestra de trabajo deberá ser también con mínimo de 400 semillas tomadas al
azar, las semillas se pondrán a germinar en 4 repeticiones de 100; cuando las
plántulas hayan alcanzado un estado adecuado de desarrollo, serán examinadas en
parte o en su totalidad, con o sin tratamiento adicional.

Los cereales pueden ser clasificados según el color de sus coleóptilos, que pueden
variar de color verde hasta el violeta dependiendo de la cantidad de antocianina. La
coloración puede ser intensificada humedeciendo el substrato con una solución de
HCl al 1% o iluminándose las plántulas durante su desarrollo o empleándose luz
ultravioleta por 1 a 2 horas antes de efectuarse la observación.

Examen de plantas en parcelas de campo

Es necesario sembrar cada muestra por lo menos con 2 repeticiones, junto a las
parcelas de referencia; las repeticiones deberán situarse en campos diferentes o en
diferentes puntos del mismo, podrán tener cualquier tamaño, pero la distancia entre
líneas deberá ser suficiente para permitir el completo desarrollo de los caracteres
que se quiere observar.

Las observaciones se harán durante todo el período de desarrollo; sin embargo, es

en el período que sigue al espigado (cereales) o al comienzo de la floración (otras
especies) cuando se manifiestan más claramente las diferencias entre plantas que
pertenecen a cultivares diferentes y que deben examinarse individualmente.

Debe hacerse un conteo de las plantas que se reconozcan como pertenecientes a

otro cultivar o especie, los resultados se expresán en porcentaje.

Otras pruebas empleadas en la identificación de especies y cultivares

Se puede utilizar métodos físicos, químicos, físico-químicos, bioquímicos, citológicos

y de resistencia a las enfermedades.

Métodos físicos

Prueba de la radiación ultra violeta, las diferencias más importantes con esta prueba
se puede observar entre las avenas blancas (con fluorescencia azul) y amarillas
(con fluorescencia pardo obscura) y entre algunos cultivares de Lolium perenne y
Lolium multiflorum, en la mayoría de los cultivares de L. multiflorum ocurre la
flourescencia de los exudatos de las raíces, mientras que para los cultivares de L.
perenne no ocurre.

Métodos químicos

a) Prueba del fenol, las variedades se diferencian en la medida en que su semilla

se colorea al tratarla con una solución de fenól al 1%. La coloración se procesa
porque algunas enzimas de las capas superficiales de la semilla causan una
oxidación en la cual el fenol forma una sustancia oscura, la intensidad de la
oxidación es una característica de la variedad y por esto el grado de coloración varía
de una variedad a otra.

En esta prueba las semillas deben ser remojadas en agua destilada por 14 a 24
horas y después transferidas para un papel secante donde permanecerán por 40 a
60 minutos, luego son colocadas sobre un papel filtro humedecido con 5 ml de una
solución de acido fénico al 1% para trigo y 2% para la cebada. La coloración de las
semillas es observada después de 4 a 24 horas de tratamiento. Algunas especies se
colorean rápidamente y otras no.

b) Prueba del lugol, utilizada para semillas del género Lupinus, ya que poseen un
alcaloide venenoso y amargo. Su presencia constituye un elemento de identificación
de cultivares cuando las semillas son tratadas con una solución de lugol. El método
es sencillo, primero las semillas son remojadas en agua corriente por 24 horas,
cortándose después unas láminas delgadas y se disponen los cortes sobre una
superficie blanca y se añade sobre cada una de las láminas 1 o 2 gotas de la
solución de lugol, la presencia de una coloración pardo rosada en las láminas indica
la presencia del alcaloide.

c) Prueba de la peroxidasa, la identificación de los diferentes cultivares de soya en

laboratorio es muy difícil cuando se trabaja solamente con los aspectos morfológicos
de las semillas, por eso se usa la coloración o forma del hilo o la coloración y brillo
de la semilla. La peroxidasa es una enzima que está presente en la mayoría de los
tejidos vivos; puede presentar desde una alta actividad (positiva) para semillas de
soya de algunas cultivares a una baja actividad (negativa) para otras cultivares.

El procedimiento es muy sencillo, primero se separa la testa de 10 semillas de soya

y se las coloca individualmente en tubos de ensayo separados, es importante
recordar que ningún pedazo del embrión o de los cotiledones puede estar adherido
a la testa, para facilitar el proceso se ponen las semillas entre dos hojas de papel
humedecido durante una noche a una temperatura de 30 o 40°C; en cada uno de
los tubos de ensayo que contienen las testas se ponen 10 gotas de una solución de
alcohol a 0,5% y aumenta enseguida una gota de una solución de peróxido de
hidrógeno (H2O2) después de 1 minuto, se toma nota de los resultados. Si la
solución obtenida en los tubos queda con una coloración pardo-rojo fuerte la
reacción se considerará como positiva (+), si no ocurre ninguna coloración, la
reacción es considerada como negativa (-).

Método físico-químico, prueba de la electroforesis basada en las proteínas de las

semillas. Dentro de las técnicas de laboratorio para la identificación de la pureza
varietal, la electroforesis ha demostrado ser de gran aplicación práctica y
excepcional versatilidad, además de la rapidez de resultados.

La gran mayoría de los estudios sobre moléculas de interés bioquímico y biológico y

su régimen de separación envuelven por lo menos una de las varias formas de
electroforesis.

Este método está basado en el hecho de que las moléculas como el ADN, ARN y
proteínas son eléctricamente cargadas y por lo tanto tienen la hábilidad de
dislocarse cuando son colocadas en un campo eléctrico. Diferentes cargas
eléctricas han sido usadas para separar esas substancias individuales, posibilitando
la caracterización. Generalmente, cada cultivar posee un úníco padrón
electrofóretico de proteínas y enzimas, los cuales pueden ser observados por
coloración o espectrofotometría.

Método de resistencia a las enfermedades, se producen anualmente un gran

numero de cultivares con resistencia a una o más enfermedades, la confrontación
del desarrollo de plántulas de variedades conocidas, resistentes y no-resistentes,
con la variedad que se quiere identificar, todas inoculadas con patógenos, es una de
las formas que se tiene para hacer una diferenciación entre cultivares.

La literatura presenta muchos ejemplos de este tipo de prueba para diferentes

cultivos, tales como:

a) reacción de las variedades del melón a Fusarium niveum;

b) reacción de las variedades del pepinillo a virus que causa el mosaico;
c) reacción de las variedades de avena a las diferentes razas de Puccinia
graminis o de Puccinia coronata;
d) reacción de las variedades de soya a las diferentes razas y Peronospora
manchurica.