PRESENTACION

Ponemos a disposición de nuestros alumnos de FARMACIA Y BIOQUÍMICA de la

Universidad Católica de Santa María, esta Guía de Prácticas de BIOQUIMICA I, que
consideramos será de ayuda para apoyar el proceso enseñanza – aprendizaje de nuestro
curso de Bioquímica y que aprovecha la experiencia acumulada por un grupo de Profesores
de Bioquímica que venimos enseñando el Curso teórico y a la vez realizando las prácticas
respectivas durante muchos años.

Igualmente se podrá observar, que en algunos experimentos, se proporcionan

directamente los resultados, para que el alumno los comente y sobre todo haga la
interpretación correcta y adecuada de los mismos.

Todas las prácticas incluyen un cuestionario, sobre aspectos que trata el tema, donde el
alumno puede aplicar o aportar otros datos a fin de deducir explicaciones y resolver las
interrogantes planteadas.

El estudiante anotará sus resultados, interpretaciones y respuestas en la misma Guía de

Prácticas para optimizar su tiempo.

No dudamos que esta Guía de Prácticas tenga muchos aspectos que puedan ser
mejorados en las próximas ediciones, de allí que los autores seremos muy receptivos a las
sugerencias de los usuarios a quienes desde ya les estaremos muy agradecidos.

Los Docentes

1
 PRACTICA Nº 1

ESPECTROFOTOMETRIA

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:

1. Cáculo del factor de calibración y construcción de una curva de calibración.

2. Determinación del espectro de absorción del anaranjado de metilo.
3. Determinación colorimétrica de colesterol en suero sanguineo

OBJETIVOS:

1. Calcular la concentración de una sustancia presente en solución aplicando la ley

de Beer-Lambert, mediante un método fotocolorimétrico.
2. Comprender los conceptos de factor de calibración y curva de calibración en el
uso de los métodos fotocolorimétricos.
3. Conocer el fundamento de los métodos fotocolorimétricos.
4. Determinar el espectro de absorción de una sustancia y reconocer su importancia.

INTRODUCCION:

Este es un método muy ampliamente usado en bioquímica y análisis de laboratorio para

determinar la concentración de una sustancia presente en solución. Se le utiliza para medir
la concentración de una sustancia presente en un líquido biológico ( sangre total, suero,
plasma, orina, etc. ) También es útil para la cuantificación de una sustancia presente en un
tejido, sea por examen en el tejido de una actividad enzimática por ejemplo o por previa
extracción de la sustancia a partir del tejido y su posterior determinación. También pueden
ser empleados estos métodos para la identificación de una sustancia o examinar algunas
propiedades de ella a través de la modificación de su espectro de absorción por ejemplo.
Así, hay otros usos que los iremos viendo conforme avancemos en desarrollo del curso.

Como se ha visto en la parte teórica, estos métodos hacen uso del espectro
electromagnético como fuente de radiación para hacer las mediciones.

La espectrofotometría utiliza como fuente, luz visible o del espectro ultravioleta (UV)
empleando los aparatos llamados Espectrofotómetros; en tanto que la fotocolorimetría que
vendría a ser una parte de la espectrofotometría, solamente utiliza luz del espectro visible

2
(400 a 800 nm), para hacer las determinaciones, empleando el aparato llamado
fotocolorímetro el cual emplea filtros de color para seleccionar un intervalo de longitud de
onda correspondiente al filtro usado. Tanto a la espectrofotometría como a la
fotocolorimetría, en conjunto, se les da el nombre de fotometría, pero en la actualidad este
término ya casi no se usa.
En la presente práctica sólo usaremos el fotocolorímetro

Fuente de Filtro Muestra Fotocelda Registro

luz

Figura Nº 1. 1.- Componentes de un fotocolorímetro

Los métodos espectrofotométricos y fotocolorimétricos se aplican para medir la fuerza

transmisora de luz de una solución, con el objeto de determinar la concentración de una
sustancia presente en dicha solución, que es la que absorbe la luz. Si la solución de por sí
ya tiene color, lo cual no sucede frecuentemente, se puede comparar la absorbancia
mostrada por la sustancia presente en solución, con la que producen soluciones de la
misma sustancia; pero, de concentración conocida, para así poder determinar la
concentración de esta sustancia en aquella solución en donde no se le conocía.

Si la sustancia presente en solución no tiene color, que es lo que sucede más

frecuentemente, habrá que hacerla reaccionar con ciertos reactivos a fin de que se produzca
un determinado color, cuya absorbancia pueda ser medida en el fotocolorímetro,
comparando su absorbancia con aquellos que producen otras soluciones de la misma
sustancia pero de concentración conocida ( soluciones estándar ), mediante la aplicación de
la ley de Beer-Lambert.

Los espectrofotómetros y los fotocolorímetros miden pues kla absorbancia de las

soluciones que tiene una sustancia cuya concentración se desea medir. Pero, como ya se ha
dicho antes, los fotocolorímetros solamente usan luz visible y se emplea filtros para
seleccionar haces de longitud de onda, correspondientes al filtro que se se usa, ( así, el
filtro azul deja pasar haces de longitud de onda entre 400 a 465 nm; el filtro verde entre

3
500 a 570 nm; y el filtro rojo entre 640 a 700 nm). En tanto que los espectrofotómetros
emplean como fuente de luz tanto la visible como la UV, y se puede seleccionar una
determinada longitud de onda mediante el uso de un prisma y colimador; por lo tanto, en
las mediciones de absorbancia se emplea un haz de longitud de onda deseada. Los
fotocolorímetros se usarán para sustancias que absorben luz visible o UV.

En el curso de Bioquímica, en la mayor parte de los casos utilizaremos la expresión

práctica de la ley de Beer-Lambert, que como ya se ha visto en la parte teórica, es:

Abst Cst
----------- = ----------- (Ecuación 1)
Abx Cx

Es decir las absorbancias son directamente proporcionales a las concentraciones.

Resulta entonces que en cualquier método fotocolorimétrico, en la mayor parte de los
casos, se trabajará con tres tipos de soluciones. La muestra que contiene la sustancia cuya
concentración se desea medir (Cx) y cuya absorbancia se mide en el fotocolorímetro
(Abx); la solución estándar, cuya concentración de la sustancia es conocida (Cst, y cuya
absorbancia tambien se conocerá ya que se la medirá en el fotocolorímetro (Abst);
finalmente tenemos la solución blanco, que generalmente tiene el disolvente puro y/o los
reactivos, pero, sin la sustancia que se desea medir, su absorbancia tambien la medimos en
el fotocolorímetro. Estos tres tipos de soluciones, se tratan siempre de igual manera y con
los mismos reactivos. Antes de aplicar la ecuación 1, hay que de restar la lectura del blanco
a Abx y a Abst (Absorbancias netas) y con estos datos recien podemos proceder a calcular
la concentración Cx, según la ecuación 1:
Cst x Abx
---------------------- = Cx (Ecuación 2)
Abst

El valor Cst / Abst, se llama factor de calibración ( Fc ); así, la ecuación 2 quedaría

como:
Cx = Fc x Abx (Ecuación 3)

En una buena parte de los métodos fotocolorimétricos que se usan para determinar
una sustancia, se emplea, no una solución estándar sino varias, esto con el objeto de dar
mayor precisión a la medida; por lo tanto antes de emplear la ecuación 3, se deberá obtener
un factor de calibración para cada solución estándar, luego sacar el promedio y recien
emplearlo en la ecuación 3.

4
 Otro método que con frecuencia se usa para obtener Cx , es mediante la curva de
calibración. Esto consiste en hacer un ploteo de las concentraciones de los estándar en el
eje “X” , frente a sus absorbancias ( usar siempre absorbancias netas ) en el eje “Y”. Con
esta gráfica se puede extrapolar, usando la absorbancia neta de la muestra X, para ver cual
será su concentración.

Con frecuencia, para hallar la concentración de la sustancia en g % o mg % debemos

hacer operaciones adicionales. Generalmente se usa una muy pequeña cantidad de muestra
para hacer la reacción de coloración y determinar su absorbancia; luego, la concentración
encontrada según los métodos indicados, corresponde a la cantidad de muestra empleada,
para hacer la reacción de coloración, por lo que, para encontra la concentración de la
sustancia en g o mg %, que son las concentraciones como normalmente se expresan,
deberemos hacer una regla de tres simple para encontra dicha concentración en 100 ml de
solución o muestra. Esto se comprenderá mejor cuando hagamos un ejemplo de la
utilización de un método fotocolorimétrico para la determinación de una sustancia, como
lo proponemos en uno de los experimentos que se indican más abajo.

Alternativamente, es posible hallar resultados directamente en porcentaje (g ó mg %),

si se calcula un factor de calibración porcentual; es decir , que el Fc simple encontrado
previamente, se lo corrige para hacer la reacción de coloración; luego, al multiplicar este
factor porcentual por la absorbancia neta de la muestra X, tendremos el resultado
directamente en g % ó mg %. Para el caso de la curva de calibración, podemos calcular las
concentraciones de los estándares en g % ó mg %, así que se plotea absorbancias frente a
concentraciones de los estánda en g % ó mg %, luego la absorbancia neta de la muestra X
se extrapolará en la gráfica, dandonos el resultado directamente en g % ó mg %, con lo que
los cáculos se simplifican.

EXPERIMENTO 1 .

FACTOR DE CALIBRACION Y CONSTRUCCION DE LA CURVA DE

CALIBRACION.

Reactivos:

- Solución de anaranjado de metilo a 1 mg %.

- Solución de anaranjado de metilo de concentración desconocida ( Muestra X ).

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 En este experimento se trata de hallar la concentración de una solución de Anaranjado
de Metilo (Muestra X). Se tendrá cinco concentraciones diferentes de Anaranjado de
Metilo (soluciones Estándar).

Procedimiento. Por el método del Factor de calibración.

En siete tubos de ensayo medir lo siguiente ( en ml ):

Tubo Nº
REACTIVOS
1 2 3 4 5 Muestra Blanco

Anaranjado de Metilo 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 ----- -----

1 mg %
Agua destilada 8.0 6.0 4.0 2.0 ----- ----- 10.0
Sol. de A. Metilo de ----- ----- ----- ----- ----- 10.0 -----
concentr. desconoc.

Mezclar bien y leer en el fotocolorímetro con filtro azul.

Completar el siguiente cuadro:
1 2 3 4 5 Muestra Blanco

Absorbancia o D.O
Absorbancia Neta ------
Concentración en mg % ------ ------
de los estándar de A. M.
Factor de Cali ------ ------
bración
Concentr. de la muestra ------ ------ ------ ------ ------ ------

D. O : Densidad Optica, A. M. : Anaranjado de Metilo

Por lo tanto el factor de calibración será de: _________________

La concentración de la muestra X de Anaranjado de Metilo será de: ____________ mg %

Procedimiento: Por el método de la Curva de Calibración.

Con los datos de las absorbancias netas de los tubos del 1 al 5 y sus respectivas
concentraciones, construir la curva de calibración para el anaranjado de metilo. Usar papel
milimetrado haciendo en cada eje las escalas adecuadas, en el eje X colocar
concentraciones de Anaranjado de Metilo y en el eje Y las absorbancias o Densidades

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Ópticas netas. Trazar la línea tomando los puntos medios. Colocar o pegar la gráfica en el
siguiente espacio:

Figura Nº 1.2 .- Curva de calibración para el anaranjado de metilo

La concentración de la muestra”x” de anaranjado de Metilo, según la curva de calibración

será de: ______________ mg %.

Nota (1): Hay fotocolorímetros que nos dan la absorbancia o densidad óptica (D.O)
directamente. Otros aparatos como los fotocolorímetros Klett dan en unidades
Klett (UK), que son unidades proporcionales a la densidad óptica. Para convertir
D.O. en U.K., multiplicar la D.O. por 500; en tanto que para convertir U.K. en
D.O., multiplicar U.K. por 0.002 ó dividir la U.K. entre 500.

Nota (2): Si por alguna razón no está operativo el fotocolorímetro del laboratorio se puede
trabajar con las siguientes D.O. : Tubo 1: 0.320; tubo 2: 0.460; Tubo 3: 0.650;
Tubo 4: 0.840; Tubo 5: 0.950; Tubo 6 (Muestra x): 0.720 y tubo 7 (blanco):
0.00

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Nota (3): En el caso de no disponerse de soluciones de Anaranjado de Metilo, se puede
trabajar con una de Bicromato de Potasio a 0.1 g %. Procediéndose en forma
semejante a lo señalado en la tabla ya indicada para el Anaranjado de Metilo.

EXPERIMENTO 2.
DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL ANARANJADO DE
METILO.
La determinación de un espectro de absorción siempre debe hacerse usando un aparato
que pueda seleccionar una longitud de onda determinada. Como se sabe, para determinar
un espectro de absorción de una sustancia, hay que medir la D.O. en varias longitudes de
onda determinadas, una por una, y luego hacer un gráfico donde se plotea las D.O. ( en el
eje Y) frente a las longitudes de onda ( en el eje X ). Cada sustancia en solución tiene su
espectro de absorción característico y así podemos identificar de que sustancia se trata.

Procedimiento:

De la solución de Anaranjado de Metilo del experimento 1, que tiene una

concentración de 1 mg %, hacer una dilución 1: 2.5 con agua destilada.

Tomar un fotocolorímetro o espectrofotómetro que seleccione longitudes de onda

determinadas, ajustar a 100 % de transmisión usando un tubo con agua destilada, y luego
medir la absorbancia de la solución diluida de A. de Metilo a las longitudes de onda de
400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550 nm. En el caso de no disponer del aparato indicado,
usar las siguientes lecturas:

Longitud de Absorbancia
onda (nm) (D.O)
400 0.290
420 0.320
440 0.380
460 0.420
480 0.375
500 0.200
520 0.180
550 0.090

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 Construir el espectro de absorción de Anaranjado de Metilo en una hoja de papel
milimetrado, colocando en el eje X las longitudes de onda y en el eje Y las absorbancias
Usar el espacio siguiente para pegar su gráfico

Figura Nº 1.3.- Espectro de absorción de luz del Anaranjado de Metilo

Cuál es la longitud de onda con la que se obtiene mayor absorbancia para el Anaranjado de
Metilo? ___________

INTERROGANTES BIOQUIMICAS.
1. Que es transmitancia y que es Absorbancia. Qué relación existe entre estos términos?
_________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. Que entiende Ud. Por espectro de absorción de una sustancia?

_________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. Que es una curva de calibración y que es Factor de calibración. Como se las obtiene?

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_________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

4. Si una sustancia en solución tiene una transmitancia de 48 cuál será su absorbancia?

Respuesta: ……………………………….

PRACTICA Nº 2

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 PROTEINAS I

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Separación de proteínas por diálisis del suero.
2. Acción tampón de las proteínas del suero sanguíneo.
3. Estudio de la solubilidad de la caseína a diferentes pH.
4. Reacción de la ninhidrina.

INTRODUCCION

Dada la compleja estructura proteica y por lo tanto su elevado peso molecular, las
proteínas son consideradas como macromoléculas, esto determina una serie de propiedades
que posibilitan su aislamiento y análisis.

Debido a su gran tamaño las proteínas son incapaces de atravesar membranas

semipermeables, lo que posibilita que en una solución en donde existen proteínas y otros
constituyentes de menor peso molecular (aminoácidos, monosacáridos, urea, creatinina,
sales, iones, etc.), las primeras puedan ser separadas al no poder pasar a través de los poros
de las membranas semipermeables, en tanto que los otros constituyentes, de menor peso
molecular, pasarán sin problema alguno.

Las proteínas tienen un rol muy destacado en el control del pH celular y

extracelular. Esta acción amortiguadora se explica por la presencia de grupos ionizables en
las cadenas laterales de los aminoácidos, los cuales son capaces de fijar protones y evitar
que el pH baje; o ceder protones al medio para neutralizar los oxidrilos y evitar de este
modo que el pH aumente.

La concentración de hidrogeniones en el medio en que se encuentra disuelta una

proteína, determina importantes variaciones en la carga eléctrica de la misma. En general
una proteína se carga positivamente cuando se encuentra disuelta en un medio de pH
inferior al de su punto isoeléctrico (pI), en tanto que se carga negativamente cuando el pH
del medio en que encuentra es superior al valor de su pI. El punto isoeléctrico de las
proteínas con un alto contenido en aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina), es
alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de pI de 10,7. Cuando una proteína
tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y glutámico), tendrán un

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pI bajo, como el caso de la pepsina que tiene un pI cercano a 1. En general la mayor parte
de las proteínas globulares tiene un pI que varía entre 5,0 y 9,0.

Cuando la proteína está en un medio de pH que coincide con su valor de pI, no solo
es incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad llega al mínimo,
incluso algunas llegan a precipitar.

EXPERIMENTO 1

SEPARACION DE PROTEINAS ( DIALISIS DEL SUERO ).

Objetivos
1. En base al carácter macromolecular de las proteínas utilizar un método para
separarlas de otros componentes de menor peso molecular.
2. Estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre la solubilidad de las proteínas del
suero sanguíneo.
3. Constatar la acción del ácido tricloroacético (TCA) como agente precipitante de
las proteínas.

Método: ( Diálisis del suero sanguíneo utilizando como membrana semipermeable una
bolsa de celofán o colodión ).

Procedimiento:
a) Medir en el interior de una bolsa de celofán, 5 ml de suero sanguíneo y cerrar la
bolsa.
b) Colocar la bolsa de celofán en el interior de un beaker conteniendo agua destilada,
la misma que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).
c) Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a un
tubo de centrifuga y centrifugar por 5 minutos a 2500 r.p.m.
d) Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y añadirle 5 ml de ácido
tricloroacético al 10%. Observar lo que sucede.
e) Trate de disolver el precipitado que quedó en el tubo de centrifuga utilizando agua
destilada, de no ser posible, añada unas gotas de NaCl al 10% y observe si se
solubiliza.

Resultados:

1. Escriba si observó precipitado en el interior de la bolsa y a que puede corresponder.

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 ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. ¿Qué observó al añadir el ácido tricloroacético al 10%?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. ¿Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

4.- ¿Qué ocurrió al añadir el NaCl al 10%?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

INTERROGANTES

1. ¿Por qué es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto tiempo?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2. ¿Cuál es el fundamento de la precipitación de las proteínas por el ácido tricloroacético?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. ¿Con qué experimento(s) podría Ud. demostrar que las proteínas no difundieron a
través de la bolsa de celofán?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

Complete la siguiente tabla:

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 ALBUMINA GLOBULINAS

Solubilidad en el agua
Solubilidad en soluciones salinas diluidas

EXPERIMENTO 2.

ACCION TAMPON (BUFFER) DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos
Demostrar la acción amortiguadora de pH de las proteínas del suero sanguíneo

Método: Volumétrico o titidimétrico.

Se estima los miliequivalentes de HCl y de NaOH gastados para hacer variar el pH del
suero sanguíneo, hacia el lado ácido y hacia el lado alcalino, respectivamente, y comparar
estos resultados con los obtenidos al utilizar suero desproteinizado en lugar de suero
sanguíneo

Procedimiento:

a) Medir en un Erlenmeyer, 2 ml de suero sanguíneo diluido al medio (1.0 ml de

suero más 1.0 ml de agua destilada) y titular con NaOH 0.01 N hasta un pH
aproximado de 8.5, usando como indicador la fenolftaleína. Anotar el volumen
gastado de la soda.
b) A la misma solución añadir dos gotas de anaranjado de metilo y titular con HCl 0.1
N hasta pH 3.4, anotar el volumen de ácido gastado. Para reconocer el color que
toma este indicador a pH 3.4, preparar un tampón de dicho pH y añadirle dos gotas
de anaranjado de metilo.

c) Repetir los pasos 1 y 2, utilizando en este caso suero desproteinizado ( o agua

destilada). Para obtener el suero desproteinizado, mida cierto volumen de suero en
un tubo de ensayo, y caliente en baño María hirviente por dos minutos; después de
filtrar o centrifugar, usar el filtrado o el sobrenadante, según el caso

Resultados.

1. Con los datos obtenidos en este experimento complete la siguiente tabla:

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 SUERO AGUA
SANGUINEO DESTILADA
Gasto de NaOH 0.01 N en ml.
Gasto de HCl 0.1 N en ml.

1. Estimar los micromoles o miliequivalentes de ácido y base necesario para hacer

cambiar en una unidad el pH del suero y del agua destilada.

SUERO AGUA
SANGUINEO DESTILADA
Gasto de NaOH 0.01 N en miliequivalentes
Gasto de HCl 0.01 N en miliequivalentes

INTERROGANTES

1. ¿Cuántos grupos ionizables tiene el pentapeptido H-K-M-A-D-E?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. ¿Qué carga eléctrica predominante tiene a pH 7,4?

______________________________________________________________________
3. ¿Cuál es su pI?
______________________________________________________________________
4. ¿Qué puede decir de la composición de aminoácidos de una proteína cuya acción
buffer esta en las proximidades del pH 4.0?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

5. Una proteína se encuentra a una concentración de 7 g %. Si al tomar 5 ml de esta

solución, gastamos1,12 ml de NaOH 0.1 N para hacer variar su pH de 3 a 5, estime con
aproximación cuantos residuos de aspártico y glutámico que debe tener dicha proteína,
considerando que su peso molecular es de 25, 000.

___________________ residuos

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EXPERIMENTO 3.

ESTUDIO DE LA SOLUBILIDAD DE LA CASEINA A DIFERENTES pH

Objetivos
1. Demostrar como varía la solubilidad de una proteína en función del pH.
2. Precisar las alteraciones que ocurren en la solubilidad de la caseína cuando se
encuentra en un medio de pH cercano al valor de su pI.
3. Determinar experimentalmente el pI de la caseína .

Método
A través de la turbidez, apreciar la solubilidad de la caseína en medios de diferentes pH.

Procedimiento.

a) Rotular una serie de 9 tubos de ensayo, del 1 al 9

b) En el tubo 1 medir 9 ml de ácido acético 0.178 N
c) En el tubo 2 medir 9 ml. de la solución de ácido acético preparada mezclando 10
ml. de ácido acético 0.178 N y 10 ml de agua destilada.
d) En el tubo 3 medir 9 ml. de la solución de ácido acético obtenida al mezclar 10 ml.
de la solución anterior con 10 ml de agua destilada.
e) Proceder sucesivamente con la misma dilución progresiva, hasta completar los 9
tubos.
f) A cada uno de los tubos, añada 1 ml. de la solución de caseína al 0.5 % en acetato
de sodio 0.1 N.
g) Mezclar bien y observar la turbidez o precipitación, inmediatamente y a los 15
minutos.
h) Con ayuda del papel indicador, estime el pH en cada uno de los tubos.

Expresión de resultados.

Anote sus resultados en la siguiente tabla.

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Relación SAL / ACIDO
pH (teórico)
pH estimado con papel indicador
Precipitación o insolubilidad a 15’

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INTERROGANTES
1. Cuál es el pI de la caseína? Fundamente su respuesta.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
2. Se altera la estructura primaria de las proteínas, cuando se encuentran a un pH que
coincide con el valor de su pI? Fundamente su respuesta.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
3. Por qué precipita la caseína en su pI? Es este proceso reversible?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
4. El pI de la ureasa es de 5.0 será mayor su solubilidad si se encuentra disuelta en un
tampón acetato 4.7 o si se encuentra disuelta en un tampón fosfato 7.8. Por qué?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

EXPERIMENTO 4.

REACCION DE LA NINHIDRINA

Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina ( hidrato de triceto hidrindeno ), en

caliente, y rinden CO2, amonio y un aldehído de un átomo de carbono menos que el
aminoácido original. La reacción rinde una coloración azul púrpura, que resulta muy útil
para la identificación de los aminoácidos.

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Objetivo:
Realizar e interpretar la reacción de color de la ninhidrina para la identificación de
aminoácidos

Método: Colorimétrico Cualitativo.

Procedimiento:

a) En un tubo de ensayo medir 2 ml de la solución del aminoácido al 2%

b) Agregar 0,5 ml de la solución de ninhidrina y colocar el tubo en baño maría
hirviente por 3 minutos. Observar

Resultados:
Anote en el espacio su observación
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

INTERROGANTES
1. Utilizando el espacio que sigue, escriba con palabras los elementos del complejo de
color que se constituye en esta reacción
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. Cite dos procedimientos para cuantificar los aminoácidos usando la reacción de la

ninhidrina
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. ¿Porque algunas muestras dan positiva (ejemplo Reacción de Millón) solo después de
ser sometidas al calor?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
PRACTICA Nº 3
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 PROTEINAS II

RELACION DE EXPERIMENTOS

1.- Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo

2.- Desnaturalización de proteínas y actividad biológica
3.- Identificación de la presencia de proteínas en la orina
4.- Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo

INTRODUCCIÓN

La determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo es una determinación de

laboratorio muy utilizada en clínica. Es la cuantificación se suele hacer por diversos
métodos, sin embargo, aquellos que utilizan ciertas reacciones de color, que dan las
proteínas, son los más difundidos. Uno de ellos es el que utiliza la reacción de Biuret.

Desde hace mucho tiempo se conoce que al calentar la urea hasta 180°C, se
descompone para rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este último, en
presencia de iones cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración violeta.

No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias que tienen dos
radicales CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso estos radicales están
unidos mediante átomos de carbono o de nitrógeno. De la misma manera, los péptidos con
más de dos enlaces peptídicos dan positividad a esta reacción, que es comúnmente
conocida como la reacción de Biuret.

Con aplicación de la reacción de Biuret se ha estandarizado un método para la

determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo y que se utilizará en la presente
práctica. Los valores normales para este método son de 6 a 8 g%. Por debajo de 6 g% se
habla de hipoproteinemia y por encima de 8g% hablamos de hiperproteinemia.

A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero, normalmente no

se detectan proteína en la orina, explicable por la incapacidad de las proteínas
(macromoléculas) de atravesar los poros de la membrana basal del glomérulo renal. Por
esta razón el encontrar proteínas en cantidades demostrables en la orina de un paciente, es
una situación de mucho cuidado desde el punto de vista médico.

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 Las proteínas pueden ser identificadas en la orina, de amanera muy sencilla, al calentar
una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo de la desnaturalización de
las proteínas por el calor. Sin embargo debe tenerse en cuenta que los fosfatos también
pueden enturbiar la orina; la distinción puede hacerse considerando que los fosfatos se
vuelven solubles en medio ácido.

En muchos casos no resulta suficiente hacer la determinación de las proteínas del

suero sanguíneo, sino que es también necesario establecer las concentraciones de las
diferentes fracciones proteicas. En este sentido , se usa un procedimiento denominado
electroforesis de las proteínas del suero, que nos permite aislar las diferentes fracciones y
cuantificarlas.

El procedimiento de la electroforesis está basado en el procedimiento de las moléculas

eléctricamente iónicas según el pH del medio, serán moléculas susceptibles de ser
separadas por electroforesis. La velocidad de migración de estas macromoléculas
dependerá de la intensidad de su carga eléctrica, su tamaño y forma, la naturaleza del
soporte sobre el cuál migran, la fuerza iónica del medio, la temperatura, etc. Se entiende
que este procedimiento también será de utilidad para la separación de las proteínas de otros
líquidos biológicos , como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, orina, etc.

La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente se realiza,

determina la separación de 5 fracciones proteicas, que ordenadas en función de su
velocidad de migración, son las siguientes: albúmina, alfa 1 globulina, alfa2 globulina, beta
globulina y gamma globulina. La albúmina es la más homogénea, no contiene lípidos, su
peso molecular es de 69,000; su PI es aproximadamente 4,9 y es la de mayor velocidad de
migración. Tiene como función importante su participación en el equilibrio hídrico y
además el transporte de una serie de sustancias como la bilirrubina, los ácidos grasos, etc.
La albúmina también se une a drogas que son poco solubles en el agua, como barbitúricos,
digitálicos, aspirina, etc. Normalmente, el 50% del calcio plasmático está unido a la
albúmina y esto debe tomarse muy en cuenta para explicar las manifestaciones de
hipocalcemia asociadas a las situaciones en las cuales disminuye la concentración de
albúmina plasmática.

Las alfa globulinas incluye dos fracciones electroforéticas, las alfa 1 PI (5.1) y las alfa
2 (5.5 - 5.8). las principales alfa 1 globulinas, son la proteína C reactiva y las lipoproteínas
de alta densidad (HDL): en tanto que las alfa 2 globulinas son la haptoglobina,

20
ceruloplasmina y protrombina. La beta globulina (PI 5.4 - 6.3) incluye la proteína
transportadora de fierro (transferrina) y a las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las
gamma globulinas (PI 6.3 - 7.3), contiene las diferentes inmunoglobulinas, como la
inmunoglobulina G (Ig G) que corresponde al 80%, la inmunoglobulina A (Ig A) que
representa un 13% y a otras inmunoglobulinas, que se encuentran en menor concentración
(Inmunoglobulinas M, D, E, etc.).

La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del suero
sanguíneo por electroforesis consiste en depositar unos microlitros de suero en una tira de
papel filtro humedecida con buffer barbital pH 8.6. Los extremos de la tira luego son
introducidos en dos recipientes que contienen el mismo tampón y que están en contacto
con los electrodos.

En vista que el PI de todas las fracciones, es menor que el pH del tampón, se cargarán
negativamente y por lo tanto migrarán al polo positivo. Como quiera que la intensidad de
carga de las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño, migrarán a diferente
velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente eléctrica,
quedarán separadas las fracciones y será posible su identificación si las teñimos con un
colorante específico para proteínas (como el amido black). La cuantificación de cada
fracción se hará en función de la intensidad de color que tiene cada banda y que puede
hacerse por diversos métodos, como con el uso de un aparato llamado densitómetro que
nos grafica un pico para cada fracción y cuya área es proporcional a su intensidad de color.

La tabla siguiente muestra los valores que podemos considerar como normales tanto
en valores absolutos (g%) como en valores relativos (porcentaje). En la tabla 2 se muestran
las variaciones en la concentración de las diferentes fracciones electroforéticas de las
proteínas del suero sanguíneo en algunas enfermedades, en donde este método es de gran
ayuda en su diagnóstico.

TABLA 1: VALORES NORMALES PARA LAS DIFERENTES FRACCIONES PROTEICAS

DEL SUERO SANGUINEO SEPARADAS POR ELECTROFORESIS AL PAPEL

Albúmina Alfa 1 Alfa 2 Beta Gama

globulina globulina globulina globulina
Porcentaje 50 - 58 4-7 7 - 11 11 - 15 14 – 22
Gramos por 100 3.24 - 4.42 0.26 - 0.48 0.5 - 0.72 0.78 - 1.04 0.80 - 1.60
ml de suero

21
TABLA 2. VARIACION DE LAS FRACCIONES DEL ELECTROFORETOGRAMA
DE LAS PROTEINAS SÉRICAS EN ALGUNAS ENFERMEDADES.

ENFERMEDAD P.T. Albumi Alfa -1 Alfa - 2 Beta Gama

Infecciones agudas N N A (+)
Endocarditis bacteriana N N A (++)
Plasmocitoma beta N N A (++)
Artritis reumatoide N D (+) A (+) A (++)
Hipogamaglobulinemia NóD N D (++)
Mieloma múltiple A N A (+++)
Síndrome nefrótico D (+) D (++) A (+)
Desnutrición D (+) D (+)
Cirrosis hepática D (+) D (+) A (+)

N : Normal A: Aumento D: Disminución

Rietmann y Daniels señalan que la electroforesis de las proteínas séricas ("serum

protein electrophoresis" SPE), junto con la determinación de las proteínas séricas totales
debe ser considerado como un procedimiento rutinario para cualquier paciente, como
ayuda en el diagnostico y en el control de la enfermedad que tiene.

EXPERIMENTO 1.

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos.
Mediante el uso de la reacción de Biuret y la aplicación del método fotocolorimétrico,
hacer la determinación cuantitativa de las proteínas de una muestra biológica (suero
sanguíneo).

Método
Determinación de las proteínas totales del suero por el método de biuret

Procedimiento.
a) A 0,1 ml de suero sanguíneo añadir 1,9 ml de agua destilada y mezclar
b) Medir 1 ml de la solución anterior en un tubo de ensayo y añadir 4 ml del reactivo
de biuret. Mezclar

22
 c) Dejar en reposo 30 minutos y medir la absorbancia en el fotocolorímetro utilizando
filtro verde
d) Preparar al mismo tiempo un blanco, que llevará 1 ml de agua destilada en lugar
del suero diluido
e) Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura del estándar,
que se preparará en la misma forma que la muestra, solo que en lugar de suero
sanguíneo se usará una solución de proteínas, de concentración 7 g %.

Resultados

Llenar los espacios en blanco :

Lectura bruta Lectura neta

Tubo Muestra ( M ) ___________ ___________

Tubo Blanco ( B ) ___________ ___________
Tubo Estándar ( St ) ___________ ___________

FACTOR DE CALIBRACION : ______________

Concentración de proteína de la muestra en el volumen del suero usado : _____ g por 100
ml de suero.

INTERROGANTES

1. Se puede hacer la determinación fotométrica de la concentración proteica, sin utilizar

una reacción de color ?. Fundamente su respuesta
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. Cuál es el objeto de preparar el blanco ?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

23
3. Por qué se utilizó el filtro verde del fotocolorímetro para medir la absorbancia de la
solución en el experimento 1 ?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

EXPERIMENTO 2.

IDENTIFICACION DE LA PRESENCIA DE PROTEINA EN LA ORINA.

Objetivo:

Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de proteínas en la

orina

Método
Coagulación de las proteínas por el calor

Procedimiento.

a) Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición. Observar

lo que sucede
b) En caso observe enturbiamiento, añada alguna gotas de solución de ácido acético
al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece
c) Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán
proporcionadas.

Resultados.
1.- Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y - cuando no la hay o
cuando desaparece la turbidez

ORINA X ORINA Y ORINA Z

Calentando la muestra
Añadiendo Ac. Acético
DIAGNOSTICO

24
INTERROGANTES.

1.- Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret. Fundamente su respuesta
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2.- Que puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio y con el
añadido de unas gotas de limón desaparece su turbidez
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

EXPERIMENTO 3

DESNATURALIZACION DE PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA

Objetivos
1. Verificar como la desnaturalizacion de la proteína determina la perdida de su
actividad biológica
2. Verificar la acción de varios agentes desnaturalizantes

Método
Estudio de la actividad de la catalaza de los hematíes en presencia de diversos
agentes desnaturalizantes a través de la producción de oxígeno.

Agentes
desnaturalizantes

Catalasa
X Catalasa
desnaturalizadaa
Nativa

H2O2 H 2 O + ½ O2 (g)

Figura Nº 3.1.- Fundamento del método

Procedimiento
a) Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0,1 ml de sangre
diluida (dos gotas de sangre en 100 ml de agua destilada), 0,1 ml de sangre diluida

25
 hervida, sangre diluida en presencia de Urea 8 M y sangre diluida en SDS al 3 %
(0,1 ml)
b) Medir en cada tubo 5 ml de peróxido de hidrogeno 0,05 M y mezclar
c) Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un circulo de
papel filtro y tomar el tiempo que tarda en cada tubo para subir hasta la superficie

Resultados

Complete la siguiente tabla:

1 Sangre 2 Sangre 3 Sangre 4 Sangre
diluida diluida diluida con diluida
normal con SDS Urea 8 M hervida
Tiempo que tarda en subir el
papel hasta la superficie

INTERROGANTES

1.- Junto al nombre de cada agente desnaturalizante describa su mecanismo de acción

a) Urea 8 M ____________________________________________________________
b) SDS : _____________________________________________________________
c) DTT : _____________________________________________________________

2.- Escriba la reacción química catalizada por la catalasa

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3.- Es la catalasa una proteína simple o conjugada?. Fundamente su respuesta

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

4.- Con qué experimento (s) podría demostrar que la desnaturalización no afecta la
estructura primaria de la proteína
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

5.- Que importancia podría tener en clínica la búsqueda de actividad catalásica en la orina
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

26
EXPERIMENTO 4

ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS DEL SUERO SANGUINEO

Objetivos
1.- Reconocer las diferentes fracciones proteicas que aparecen luego de realizada la
electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo
2.- Identificar las alteraciones cualitativas y cuantitativas en el electroforetograma y
proponer un diagnostico en los casos de alteración.

Método.

Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo en un medio de Buffer barbital pH

8,6 y usando como soporte papel para electroforesis (papel Watman N°1).

Procedimiento.

a) Cada mesa dispondrá de varios electroforetogramas y su trazo densitométrico.

b) Identificar cada fracción y marcar sus límites utilizando lápiz
c) Contando los cuadraditos estimar el área de cada fracción y estimar el
porcentaje del área total que le corresponde.
d) Con el valor de las proteínas totales del suero, que será proporcionado, estime la
concentración absoluta de cada fracción en g%.

Resultados.

1.- Llene la Tabla con las cifras obtenidas. Junto a cada valor de las cifras absolutas (g
%) anote A(+), A(++),A(+++), D(+), D(++) ó D(+++), según encuentre aumento o
disminución, con respecto a lo normal. Considere (+) cuando el aumento o
disminución es hasta un 10%, (++) cuando el aumento o disminución está entre 10 -
25%; considere (+++), cuando el aumento o disminución sea mayor del 25%.

MUESTRA P.T. Albúmin. Alfa 1 Alfa 2 Beta Gama

A Valor en %
Valor en g %
B Valor en %
Valor en g %

27
2.- De acuerdo a la tabla 2, el diagnostico probable es:
Muestra A _______________________________________________
Muestra B _______________________________________________

INTERROGANTES

1.- Cómo será el electroforetograma de las proteínas del plasma sanguíneo

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2.- Si en lugar de buffer de pH 8,6, se emplea otro de pH 3,8, que diferencias importantes
esperaría encontrar en el electroforetograma
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
3.- Cuál sería la diferencia fundamental entre el procedimiento usado para la separación de
las proteínas séricas y para la separación de las lipoproteínas séricas
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
4.- Si las proteínas totales de una muestra de suero fueron 4.74 g % y el porcentaje para las
diferentes fracciones fue de 23.2%, 8.0 %, 31.1 %, 17.7% y 20.0 % para albúmina,
alfa1, alfa2, beta y gamma, respectivamente, estimar la concentración absoluta de cada
una
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

28
29
 PRACTICA N° 4

QUIMICA DE CARBOHIDRATOS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:
1. Estudiar reacciones propias de los carbohidratos.
2. Identificar los carbohidratos en una muestra problema

INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza tanto en
vegetales como en animales. Su estructura química permite funciones estructurales así
como de reserva en organismos simples, como en células superiores en donde cumplen
también funciones específicas y especializadas.

La glucosa es el carbohidrato más importante; la mayor parte de los carbohidratos

de la dieta se absorben a nivel intestinal en forma de glucosa pasando luego al torrente
sanguíneo; otros azucares se convierten en glucosa en el hígado. La glucosa es el
combustible metabólico más importante de los mamíferos (excepto los rumiantes), y un
combustible universal para el feto. Es el precursor de la síntesis de todos los otros
carbohidratos en el cuerpo, incluidos el glucógeno para almacenamiento, la ribosa y a
desoxirribosa en los ácidos nucleicos, y la galactosa en la lactosa de la leche, en
glucolípidos, y en combinación con las proteínas en las glucoproteínas y los
proteoglicanos.

Las enfermedades que se relacionan con el metabolismo de los carbohidratos

incluyen a la Diabetes Mellitus, galactosemia, enfermedades por almacenamiento del
glucógeno e intolerancia a la lactosa.

EXPERIMENTO Nº 1

PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

1. REACCIÓN DE MOLISH:

Identifica en forma general a los carbohidratos aun estando unidos a proteínas o lípidos

Fundamento:

30
 Los carbohidratos se deshidratan con ácido sulfúrico concentrado dando origen a
furfurales (furfural si es pentosa e hidroximetilfurfural si es hexosa). Estos pueden
condensarse con compuestos fenólicos como el alfa-naftol para dar sustancias quinónicas
coloreadas (anillo violáceo).

Procedimiento:

- En un tubo de ensayo medir 1 ml. de la muestra

- Agregar 2 gotas del reactivo de Molish
- Luego añadir lentamente por las paredes del tubo, 1.5 ml del ácido sulfúrico
concentrado.

Observar y anotar sus resultados. Hacer una discusión de los mismos.

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________

2. REACCION DE SELIWANOFF. (Identifica cetohexosas.)

Fundamento:

Por acción del ácido clorhídrico en caliente las cetohexosas se convierten en

hidroximetilfurfufural, el cual al condensarse con el resorcinol da un color rojo cereza.

31
Procedimiento.
- A un 0,5 ml de muestra añadir 1,0 ml del reactivo de Seliwanoff
- Colocar el tubo posteriormente en baño María hirviente.
- Observar el color a los 2, 5 y 10 minutos de calentamiento.

Anotar sus resultados y discutirlos.

_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

3. PRUEBA DE IODO (Identifica polisacáridos.)

Fundamento:
Algunos polisacáridos tienen la característica de reaccionar con el yodo formando
complejos de absorción entre el metaloide y esta macromolécula, originando diversas
coloraciones que permiten su identificación. El color de la reacción se debe a que el iodo
atrapado absorbe más luz; así por ejemplo, la amilosa da color azul, la amilopectina da
color violeta, el glucógeno da color café rojizo
La prueba es positiva para el almidón si aparece el color azul con el Iodo.

Procedimiento.
- En un tubo de ensayo colocar 2 ml. de la solución de carbohidrato.
- Añadir una gota de iodo
- Observar la aparición de color y anotar en el cuadro

32
Coloque el tubo aquel donde aparece el color en baño María hirviente y observe la
coloración, luego enfríe y observe nuevamente. Haga una discusión de sus observaciones.
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________

4. REACCIÓN DE BENEDICT:
Identifica azúcares reductores.

Fundamento
Los grupos aldehídicos y cetónicos libres o potencialmente libres de los carbohidratos
presentan poder reductor el cual puede actuar sobre el ion Cu ++ reduciéndolo a Cu+. La
reacción es positiva cuando hay formación de un precipitado de color ladrillo o color rojo
ladrillo que corresponderá al óxido cuproso.

Procedimiento:
- Colocar 2.0 ml de reactivo de Benedict en un tubo de ensayo
- Añadir 2 gotas de la solución de carbohidrato. Mezclar bien.
- Colocar los tubos en baño hirviente durante 5 minutos.
La reacción positiva se manifiesta por la aparición de un precipitado que varía del verde al
amarillo o rojo ladrillo, según la cantidad de carbohidrato
Anotar sus observaciones y discutirlas.

5. REACCION DE BARFOED
Fundamento
En esta reacción ocurre también reducción del Cu++ a Cu+ , pero como la reacción se
realiza en medio ácido su velocidad es mucho más lenta: Esta reacción se utiliza para
diferenciar monosacáridos de disacáridos. Tanto las aldosas como las cetosas dan la
reacción. Las hexosas actúan con mayor rapidez e intensidad que los disacáridos a
concentraciones equivalentes. La maltosa y lactosa, en medio ácido se hidrolizan más
rápidamente que la sacarosa, de modo que los dos primeros carbohidratos dan la reacción
positiva luego de un tiempo de ebullición entre 15 a 20 minutos, mientras que la sacarosa
da una reacción ligera o negativa luego de largo tiempo de ebullición.

Procedimiento:
- Colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml. de la solución de carbohidrato.

33
 - Agregar 2.5 ml. de reactivo de Barfoed
- Mezclar y colocar el tubo en un baño de agua hirviente.
Controlar el tiempo en que aparece el color. Aproximadamente entre 7 a 10 minutos, la dan
los monosacáridos, dentro de los 15 20 la maltosa y lactosa, luego de ese tiempo es
negativo o ligeramente positivo para la sacarosa. La positividad de la reacción se
manifiesta por la aparición de un precipitado color naranja.

6. REACCIÓN DE TAUBER

Se utiliza para reconocer pentosas libres o unidas a nucleótidos (Como los ácidos
nucleicos).

Fundamento:
El ácido acético deshidrata a las pentosas formando furfurales; estos reaccionan con la
bencidina dando una coloración rojo cereza.
Procedimiento
- Colocar en un tubo de prueba 0.5 ml de reactivo de Tauber.
- Añadir una gota de carbohidrato en prueba.
- Hervir a baño María por poco tiempo y enfriar inmediatamente después en agua
fría.

Observar y anotar sus resultados

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

7. REACCIÓN DE BIAL U ORCINOL:

Identifica aldopentosas.

Fundamento:
Por acción del ácido clorhídrico en caliente las aldopentosas se transforman en furfural el
que se condensa con el orcinol en presencia de Fe+++ dando un color verde oscuro. El ácido
glucorónico da también reacción positiva previa descarboxilación.

34
Procedimiento
- Colocar en 1 tubo de ensayo 0,5 ml. del reactivo de orcinol.
- Añadir respectivamente 0,5 ml de la muestra problema.
- Calentar a baño María hirviente durante 5 minutos.
- Enfriar los tubos y observar el color.

Anotar y discutir sus observaciones.

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

INTERROGANTES:
1. Haga hasta donde se pueda la ecuación química de la reacción de Benedict y Iodo.

2. Si la amilopectina es más abundante que la amilosa. ¿Por qué la reacción con yodo del
almidón es azul?

35
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

3. ¿A qué se debe la desaparición del color en la reacción yodo-almidón al calentarla?

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

4. Escriba la fórmula de la forma reductora de la maltosa.

5. Complete la siguiente tabla colocando los carbohidratos con los cuales Ud. Trabajó y
determine la positividad o negatividad de las reacciones realizadas para cada uno de ellos.

1 2 3 4 5 6
- Molish
- Benedict
- Yodo
- Seliwanoff
- Barfoed
- Orcinol
RESULTAD
O

Comentarios:

36
37
 PRACTICA Nº 5

QUÍMICA DE LÍPIDOS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:

1. Saponificación de una grasa

2. Adición de Yodo
3. Investigación del colesterol en muestras biológicas
4. Determinación cuantitativa del colesterol

INTRODUCCIÓN

Los lípidos son compuestos orgánicos de estructura química muy variada, insolubles
en el agua pero fácilmente solubles en solventes orgánicos, siendo los ácidos grasos parte
estructural importante en la mayoría de ellos.

Estas moléculas cumplen importante rol biológico ya sea como componentes

estructurales de la membrana celular, constituyendo formas de almacenamiento de
energía, moléculas combustibles, agentes emulsificantes, vitaminas, hormonas, etc. El
estudio de los lípidos y su metabolismo se hace aún más importante por la relación que
tienen con muchas enfermedades como la ateroesclerosis, diabetes mellitus, enfermedad
coronaria, hipertiroidismo, etc.

El suero sanguíneo normal, contiene lípidos en cantidades muy variables, donde están
comprendidos los ácidos grasos, colesterol libre y esterificado, acilglicéridos y
fosfolípidos, los mismos que se unen a proteínas transportadoras, constituyendo las
lipoproteínas complejos de naturaleza lábil y fácilmente disociables. Por lo general se
estima que la lipemia en un individuo normal es de 600 mg % por término medio,
oscilando entre 400 a 800 mg %. Se habla de hiperlipidemia cuando los valores
encontrados en los pacientes es superior a la cifra mencionada. Se produce hiperlipemia en
las siguientes condiciones : ayuno prolongado enfermedades endocrinas como la diabetes
mellitus e hipotiroidismos, ictericia de tipo obstructivo después de la ingestión de comidas
ricas en grasas, se presenta hipolipemia en el- hipertiroidismo y anemia perniciosa.

De otro lado el contenido de lípidos en los alimentos es muy variable así como la
calidad de los mismos dependiendo éste de la naturaleza y fuente de origen. La calidad de

38
los lípidos puede ser valorada por el contenido y clase de ácidos grasos presentes, donde
cabe señalar que las grasas o aceites de origen vegetal tienen un alto contenido de ácidos
grasos poliinsaturados (esenciales), comparados con las de origen animal, como se
demuestra en la siguiente tabla :

Oleico Linoleico Linolénico Palmítico Esteárico

Manteca de Cerdo 43.9% ----- 2.1% 21% 13.8%
Aceite de Semilla de algodón 33.0% 43.5% ----- 21% 2.0 %
Aceite de oliva 83.0% 7.0% ----- 6.0% 4.0%
Aceite de linaza (Lino) 5.0% 61.5% 25.0% 5.0% 3.5%

La naturaleza de los ácidos grasos presentes en las grasas neutras puede conocerse
también a través de los índices. El Índice de saponificación se define como los
miligramos de KOH necesarios para saponificar un gramo de grasa; mientras que el índice
de iodo se define como los gramos de iodo absorbidos por 100 gramos de grasa.

En la siguiente tabla se muestran los índices de Yodo para algunas muestras:

Índice de lodo Índice de Saponificación

Aceite de semilla de algodón 103-111 185 – 196
Aceite de-oliva 79-88 185 – 195
Aceite de linaza 192-195 190 - 195

Algunas investigaciones han indicado que los ácidos grasos poliinsaturados de la

dieta tienen valor como factor preventivo de la aterosclerosis. Por esta razón se aconseja el
consumo de aceites más ricos en ellos, en vez de grasas de origen animal. Se ha encontrado
cierta correlación entre incidencia de aterosclerosis y consumo de grasas animales en la
alimentación.

EXPERIMENTO 1.

SAPONIFICACIÓN DE LA GRASA

Objetivos
1. Hidrólisis de los triglicéridos y obtención de los jabones de potasio
2. Obtención de jabones de-calcio (insolubles)

39
 3. Regeneración de los ácidos grasos a partir de la solución de hidrólisis.
Procedimiento
a) Colocar en un Erlenmeyer de 125 ml aproximadamente 5 gr de manteca de cerdo
y agregar 15 ml de solución alcohólica de KOH
b) Calentar en baño maría hasta que al colocar una gota de la solución alcohólica en
un tubo con agua, la gota se disuelva
c) Agregar 25 ml de agua destilada y mezclar. Observar lo que ocurre y anotar
d) Tomar 5 tubos de prueba y colocar en cada uno de ellos 5 ml de la solución de la
etapa anterior y proceder de la manera siguiente :
- Al tubo 1 dejarlo en reposo
- Al tubo 2 añadirle 1ml de CaCl2 al 10 %
- Al tubo 3 añadir de 10 a 15 gotas de HCl concentrado hasta obtener un
aspecto lechoso.

CH2O–CO–(CH2)n–CH3 CH2OH H3C – (CH2)n- COOK

KOH
CH-O–CO–(CH2)n–CH3 CH OH + H3C – (CH2)n- COOK
Calor
CH2O–CO–(CH2)n–CH3 CH2OH H3C – (CH2)n- COOK

Resultados:

1. Complete la siguiente Tabla:

El tubo 1 contiene
El aspecto del tubo 2 corresponde a
El aspecto lechoso del tubo 3 se debe a

EXPERIMENTO 2

ADICIÓN DE IODO

Objetivo
Demostrar por comparación el grado de instauración de los ácidos grasos presentes
en aceites de diferente origen

Procedimiento:

40
 a) Colocar en cada uno dé 3 tubos de ensayo 1 ml de los siguientes aceites : aceite de
oliva, de algodón y de linaza (de éste último preparar dos tubos ).
b) Diluir añadiendo a cada tubo 2 ml de cloroformo y añadir 2 gotas de solución de
iodo al 1% en cloroformo, observar el color que da iodo.
c) Dejar en reposo y observar cada dos minutos el decoloramiento. De acuerdo al
tiempo de decoloramiento clasifique a los aceites ensayados según su contenido en
ácidos grasos insaturados

CH2O – CO – (CH2)n – CH = CH – (CH2)n – CH3

CH2O – CO – (CH2)n – CH = CH – (CH2)n – CH3 2 gotas de

Iodo
CH2O – CO – (CH2)n – CH = CH – (CH2)n – CH3

I
I I
I
I I 3 ml de
cloroformo
CH2O – CO – (CH2)n – CH – CH – (CH2)n – CH3
I I
1 ml de aceite
CH2O – CO – (CH2)n – CH – CH – (CH2)n – CH3
I I
CH2O – CO – (CH2)n – CH – CH – (CH2)n – CH3
I I

Resultados:

Escriba sus resultados en el siguiente cuadro:

Tubo Aceite Tiempo de decoloración Ácidos grasos insaturados

1
2
3

EXPERIMENTO 3.

INVESTIGACIÓN DEL COLESTEROL EN MUESTRAS BIOLÓGICAS (Reacción

de Lieberman – Buchard)

El colesterol es un componente importante dé las membranas celulares cuando una

célula se divide y forma nuevas membranas, cuando las repara de una lesión tiene.
necesidad de colesterol. Se ha calculado que más del 93 % del colesterol de nuestro
organismo está presente en las membranas celulares, mientras que sólo el 7 % circula en

41
el plasma, pero es el nivel del colesterol plasmático el que está implicado como causa de
ateroesclerosis. El colesterol también es precursor de compuestos de importancia biológica
como los ácidos biliares, las hormonas esteroideas, la vitamina D3.

La determinación de colesterol tiene importancia desde un punto de vista médico

porque se encuentra relacionado con procesos como la aterosclerosis. xantomatosis,
acumulo de colesterol en las vías biliares (formación de cálculos) lo que nos permite
evaluar el proceso evolutivo de estas enfermedades.

Objetivo.
Determinar cualitativamente la presencia de colesterol en una muestra biológica.

Procedimiento.

a) En un tubo de ensayo colocar 2 ml de una solución clorofórmica de colesterol o

suero o muestra a investigar
b) Añadir 10 gotas de anhídrido acético y dos gotas de ácido sulfúrico
c) Mezclar y observar los cambios de color que se dan.

Resultados.

Escriba en el espacio los cambios de color que se observan :

Normal ______________________________________________
Patológico____________________________________________

EXPERIMENTO 4
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL COLESTEROL. (Método de Zlatkis)

Objetivo
1. Determinar cuantitativamente la concentración de colesterol en una muestra
biológica ( suero sanguíneo).

Procedimiento
a) En un tubo de prueba se coloca 0.2 ml de suero sanguíneo, se añade 0.2 ml de
agua destilada. De esta muestra se mide 0.1 ml y se coloca en otro tubo al que
se añade 2.9 ml de ácido acético y 2.0 ml de reactivo de color (FeCl 2 y H2SO4)

42
 se mezcla bien y luego que haya .enfriado se lee al fotocolorímetro con filtro
verde.
Determinación del factor de calibración :

Tubo Estándar (ml) Ácido acético Reactivo de color Absorbancia

1 0.1 2.9 2.0 ml 0.60
2 0.2 2.8 2.0 ml 1.18
3 0.3 2.7 2.0 ml 1.81
Blanco ---- 3.0 2.0 ml 0.07

La solución Estándar tiene una concentración de 100 mg %.

Mezclar bien, dejar en reposo 2 minutos. Leer con. filtro verde.

Calcule en el espacio el Factor de calibración (Fc): ________________

Calcular el Fc % ________________

Calcular la concentración de colesterol de la muestra problema. _________________

(Mostrar los cálculos)

EXPERIMENTO Nº 5.
DETERMINACION DEL INDICE DE SAPONIFICACION

El índice de saponificación depende del tamaño de las moléculas de los ácidos grasos
que constituyen la grasa en estudio. Las relaciones son inversas. Desde que las grasas son
mezclas de acilglicéridos, la mayoría de tipo mixto, el índice de saponificación da un
promedio de tamaño molecular de los ácidos grasos presentes en los acilglicéridos
constituyentes de dichas grasas.

Objetivos:
1.- Determinar el índice de saponificación de una muestra de aceite o mantequilla.

Procedimiento:
a) Marcar dos Erlenmeyers con X y Bl
b) Colocar en el Erlenmeyer X un gramo de mantequilla o de aceite de algodón.
c) Añadir 10 ml de solución alcohólica de KOH 0.5 N tanto al Erlenmeyer X, así
como al marcado con Bl.

43
 d) Colocar los dos Erlenmeyers en un sistema de reflujo (o baño de agua hirviente),
durante 50 minutos. Agitar continuamente.
e) Transcurrido el tiempo indicado, se deja enfriar espontáneamente y se añade
luego 0.5 ml de fenolftaleína a cada uno de los Erlenmeyers.
f) Titular el contenido de cada uno de los frascos con una solución de HCl 0.5 N
g) Anotar los mililitros de ácido gastados.

Sistema
Blanco o Sistema X o
experimental Circulación
Control de agua

10 ml de 1 g de
10 ml de
KOH 0.5 N Grasa ó
KOH 0.5 N
1 ml de
aceite

Ebullición durante Ebullición durante

1 hora 1 hora

Cálculos

A los ml. de HCl gastados para titular el blanco restar los ml. de HCl gastados para
titular el frasco X. Esta diferencia expresa los ml de KOH 0.5 N que se habrán utilizado
para saponificar los ácidos grasos presentes en la muestra de grasa empleada. Con estos
datos se puede calcular los mg de KOH necesarios para saponificar 1 g de grasa (Indice de
Saponificación)

Expresión de Resultados

Se gastaron.............. ml de HCl 0.5 N para titular el blanco

Se gastaron.............. ml de HCL 0.5 N para titular el frasco X
Los ml. de KOH 0.5 N que se usaron para saponificar la grasa fueron: ..................
Por lo tanto, el Índice de Saponificación es: .......................

44
INTERROGANTES:
1.-Cuál es el objeto de añadir KOH y HC1 en el experimento 1
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. Explique mediante una ecuación química la reacción que se efectúa en el tubo 3:

3.-A qué se debe la decoloración del iodo

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
4.-Que es lo que permite la adición de iodo a los ácidos grasos?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

6.-Si se añade iodo a una solución alcohólica de lecitina podría adicionarla? Por qué?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

7. Qué funciones metabólicas cumple el colesterol?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

8. Teniendo en cuenta que la saponificación completa de un mol de TG ocasiona un gasto

de 3 equivalentes gramo de KOH. Estimar el PM del TG considerando que su índice de
saponificación es de 210 (PM del KOH = 56).

45
 PRACTICA Nº 6

EXTRACCION DE ADN E IDENTIFICACION DE SUS COMPONENTES

RELACION DE EXPERIMENTOS

1. Extracción y purificación del DNA de un tejido animal

2. Identificación de desoxirribosa: Reacción de Dische
3. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico

INTRODUCCION

Los ácidos nucleicos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada
nucleótido, el cual está constituido por:

a. - Una pentosa : ribosa o desoxirribosa

b. - Una base nitrogenada : púrica o pirimidínica
c. - Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)

La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleósido.

Finalmente la unión éster de un nucleósido con ácido fosfórico se conoce como nucleótido.

El DNA es el responsable de la transmisión de los caracteres hereditarios. El DNA está

formado por dos cadenas polinucleotidicas, enrolladas en espiral a lo largo de un eje
común. Las dos cadenas de la doble hélice corren en direcciones opuestas. El esqueleto
azúcar fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hélice y
las bases nitrogenadas están en el interior. Las dos cadenas están unidas por puentes de
hidrógeno establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrógeno entre los
pares A-T y tres puentes de hidrógeno entre los pares G-C.

46
 La adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre se unirá con la citosina.
Los puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y por agentes químicos,
obteniéndose un DNA desnaturalizado.

El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su propiedad de

absorber luz a la longitud de onda de 260 nm.

Figura Nº 7.1. Estructura helicoidal del ADN

3.4 nm
( 10 pb )

OH
3’

O-
5’
- O–P=O
O CH2
O
H2C
T A O
O -
O=P-O

- O–P=O O
CH2
O
G C O
H2C
O
O=P-O
-
O

- O–P=O O
O CH2
A T O
H2C
O
O=P-O
-
5’
O-
47
3’
OH
 Figura Nº 7.2. Modelo de la molécula de ADN según Watson y Crick

OBJETIVOS
1. Obtención del DNA usando como fuente, timo de ternera
2. Identificación del componente desoxirribosa del DNA : Reacción de Dische
3. Desnaturalización del DNA: Observación del efecto hipercrómico

Procedimiento
1. Aislamiento del DNA
a) Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 ml de una solución
salina 0,15 M más EDTA 0,1M pH 8
b) Transferir el homogenizado anterior a una probeta de 100 ml y añadir 2 ml de
detergente anionico ( Lauril Sulfato al 25%, mezclar )
c) Colocar en baño maria a 60 oC durante 10 min.
d) Añadir 6,3 ml de NaCl 5 M; mezclar.
e) Añadir solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24 :1 v/v) en un volumen
igual al obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 ml, agitar
vigorosamente
f) Centrifugar a 10 000 rpm. por 15 minutos.
g) Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se
desnaturalice y colocarlo en una probeta de 100 ml. Agregar dos volúmenes de
alcohol etílico al 95%. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con una
varilla de vidrio se trata de enrollar el DNA.
h) Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y
disolverlo en 20 ml de solución salina citrato (0,015 - 0,0015 M). Dejar en reposo
30 min.
i) Añadir 2 ml de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0,001 M de
EDTA.
j) Mezclar con una varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 9,5
volúmenes de isopropanol para precipitar selectivamente al DNA. Seguir
mezclando con la varilla de vidrio tratando de enrollar el DNA.

48
 k) Disolver el DNA obtenido en 20 ml. de solución salina citrato.

1. Identificación de Desoxirribosa : Reacción de Dische

Fundamento:
Desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y sulfúrico con difenilamina
(DPA), dando como resultado un color azul.
Se ha conseguido mayor sensibilidad adicionando a la reacción ácido perclórico y
acetaldehído y dejando que desarrolle el color por 17 horas a 30 ºC. El color azul
producido por el ADN, sólo mide los azúcares enlazados a purinas, ya que el reactivo DPA
reacciona solamente con las moléculas de desoxirribosa unidas a purinas.

Según Stacey y col., se ha identificado al intermediario responsable del desarrollo del

color azul, el cual corresponde a un compuesto llamado: Hidroxilevulínico aldehído.

H3C – CO – CHCH2 – COOH HOH2C – CO – CHCH2 – CHO

Ac. Levulínico  OH levulínico aldehido

En cambio las desoxirribosas enlazadas a pirimidinas pueden ser detectadas por el

reactivo Carbazol. Pruebas con varios tejidos usando los reactivos DPA y Carbazol, han
mostrado que la cantidad de ADN es la misma, sin considerar cual reacción se empleó para
la determinación. Esto indica por supuesto que el ADN de estos tejidos contienen iguales
proporciones de nucleótidos púricos y primidínicos, puesto que del apareamiento de bases
según Watson-Crick, se asume que la suma de A + G = T + C .

Procedimiento:

a) Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera :

X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control)
b) En cada tubo medir lo siguiente :

C X
Solución de ADN obtenido ------- 2.0 ml.
Agua destilada 2.0 ml. -------
Reactivo difenilamina en 4.0 ml 4.0 ml.
solución ácida

c) Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.

49
 d) Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de
desoxirribosa se revela por la aparición de un color azul

3. Identificación de fosfato.

Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato, luego se

identificara éste mediante una reacción de coloración.
a) Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la manera siguiente:
X (solución de DNA obtenida en la práctica) C(control)
b) Luego medir lo siguiente:

X C
Solución de DNA obtenida en la práctica 0.5 ml -----
Solución salina citrato ----- 0.5 ml
Acido perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml

c) Colocar en cada tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Luego colocarlo
en baño hirviente durante 30 minutos.
d) Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera:

C X
Contenido del tubo X después de la hidrólisis ----- 0.5 ml.
ácida.
Contenido del tubo C después de la hidrólisis ácida. 0.5 ml. -----

Agua destilada 3.5 ml. 3.5 ml.

Molibdato de amonio al 2.5 % 0.5 ml. 0.5 ml.
Reactivo Reductor (ácido amino reductor naftol 0.5 ml. 0.5 ml.
sulfónico

e) Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Observar la

presencia de fosfato inorgánico que se manifiesta por la aparición de un color azul.

4. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico.

Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la constante

dieléctrica del medio, pH extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como la
urea y la formamida pueden debilitar las fuerzas que unen las dos cadenas
complementarias del ADN y rompen los puentes de hidrógeno lo que origina que las dos
50
cadenas se desenrollen y se separen, proceso conocido como desnaturalización del DNA.
En estas condiciones las bases nitrogenadas quedan más expuestas que en su estado nativo
y tienden a absorber mayor luz a 260 nm, hecho que se conoce con el nombre de efecto
hipercrómico. Cuando la temperatura desnaturaliza el 50 % del ADN esta se le conoce
como Tm o Temperatura de Fusión; esta es mayor o menor según la proporción de pares
de bases G, C o A,T respectivamente.

Calor Calor

DNA Nativo DNA Desnaturalizado

Figura Nº 7.3.- Esquema que explica el proceso de desnaturalización del DNA

Procedimiento.

a) Medir en un tubo 5 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar

el tubo en baño hirviente durante 15 min., enfriar.
b) Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
c) Si la solución del DNA es muy concentrada, diluirla con solución salina citrato y
determinar nuevamente la absorbancia, hasta que ésta arroje una absorbancia
entre 0.5 y 1.0 .
d) Medir la absorbancia a varias longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
e) Hacer lo propio con la solución de DNA nativo obtenida en la práctica
f) Comparar la absorbancia obtenida, con ambas soluciones de DNA.

Expresión de Resultados.

51
 Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la
presente, se obtuvieron los resultados que a continuación se muestran en el presente cuadro

Longitud de onda en Absorbancia del ADN Absorbancia del ADN

nm. nativo desnaturalizado
320 0.005 0.020
310 0.019 0.026
300 0.025 0.038
290 0.062 0.125
280 0.135 0.335
270 0.205 0.520
260 0.283 0.650
250 0.235 0.600
240 0.175 0.420
230 0.140 0.350

En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores,

colocando en el eje de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las
LONGITUDES DE ONDA tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el
mismo gráfico.

52
INTERROGANTES

1. Que otros tejidos podrían ser utilizados para aislar DNA en la presente práctica.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. Porqué razón se usan 6,3 ml de NaCl 5 M en una de las etapas de extracción del DNA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. Si luego de la extracción del DNA realizada en la práctica al leer la absorbancia a 260

nm se obtiene una lectura de 1,25 D.O. y al calentarla durante un tiempo considerable,
en baño hirviente la lectura es de 1,26 D.O. Que explicación daría Ud.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

4. Indique qué otras formas para identificar el DNA aparte de la reacción de DISCHE
conoce Ud.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

5. Qué bases se encuentran comúnmente formando la molécula del DNA y RNA

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

6. Qué bases no comunes se encuentran también en las moléculas de los ácidos nucleicos
y particularmente cuál ?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

53
7. Qué importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el
interior de la doble hélice ?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
8. Qué tipos de RNA conoce Ud. donde se encuentran localizados en la célula?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

9. Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

10. Cuál es el fundamento de la reacción del DISCHE?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

11. Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAasa II ?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

54
55
 PRACTICA Nº 7

ENZIMAS I

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Determinación del amoniaco y construcción de la curva de calibración.
2. Determinación de la actividad ureásica.

OBJETIVOS
1. Familiarizarse en el trabajo con enzimas
2. Determinar la actividad de una enzima ( ureasa )
3. Aplicar los conocimientos adquiridos en la resolución y explicación de problemas
que se suscitan cuando se trabaja con enzimas

INTRODUCCION

Todos los organismos vivos dependen de las enzimas para su desempeño normal de
sus actividades; por lo tanto, es necesario conocer cómo trabajan las enzimas. Este tema es
muy importante en bioquímica; de allí que hemos dedicado dos sesiones de prácticas para
desarrollar este tema. El rasgo cinético más importante que distingue a los procesos
enzimáticos de las reacciones no catalizadas, es que las primeras muestran saturación.
Como ya se ha visto en la parte teórica, casi todas las reacciones catalizadas por enzimas
muestran una taza de velocidad de primer orden con respecto al sustrato a bajas
concentraciones, pero en lugar de incrementar su velocidad indefinidamente cuando la
concentración de sustrato aumenta, la velocidad se aproxima a un límite, en el cual ya no
hay dependencia de la concentración de sustrato, y por lo tanto, la reacción llega a ser de
cero orden con respecto al sustrato.

Los primeros investigadores que nos dieron una clara interpretación de dicha conducta
fueron A. J. Brown y Henry; y posteriormente, L. Michaelis y M. Menten y G. E. Briggs y

56
J. B. S. Haldane, quienes señalaron interpretaciones más adecuadas al comportamiento de
la velocidad con respecto a la concentración del sustrato. A ellos debemos casi toda la
teoría de la cinética enzimática que desarrollaremos en esta práctica y en la siguiente.

La enzima empleada en la presente práctica es la Ureasa, cuyo nombre sistemático es

Urea amidohidrolasa (EC. 3.5.1.5).

Esta enzima cataliza la siguiente reacción:

NH2 Ureasa
O= C + H2 O CO2 + 2 NH2 (1)

NH2

La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el

organismo humano, una buena fuente son los microorganismos tales como las bacterias.

La velocidad de una reacción enzimática, como la velocidad de cualquier reacción en

general, puede ser determinada midiendo la cantidad de sustrato transformado en un
determinado tiempo de reacción, generalmente un minuto. También puede ser medida
determinando la cantidad de productos formados, cualquiera de ellos, basta con uno sólo,
lo que nos permite deducir que cantidad de sustrato ha formado cierta cantidad de
producto. Para el caso de la reacción catalizada por la ureasa ( reacción 1 ) en virtud de lo
dicho, podemos medir su velocidad determinando la cantidad de sustrato ( urea )
transformado por minuto. En cuanto a los productos podemos medir el amoniaco o el CO2
formado. Si medimos el NH3 , deducimos que dos moléculas de amoniaco provienen de
una molécula de urea, de acuerdo con la reacción. Si medimos CO 2, diremos que una
molécula de CO2 proviene de una de urea.

De estas tres posibilidades para medir la velocidad de dicha reacción la más fácil es
medir la cantidad de amoniaco (NH3) que se forma en un determinado tiempo. La razón es
por que el amoniaco se mide mediante una reacción sumamente sencilla con reactivos a la
mano y baratos, por eso elegimos medir amoniaco. La medición de la urea, aunque fácil,
usa reactivos más difíciles de conseguir y además más caros: solamente por eso no la
determinaremos, pero como hemos dicho, al medir amoniaco podemos deducir cuanto de
úrea ha entrado en la reacción. Podríamos medir también el CO 2 producido, el cual es un

57
gas y por lo tanto necesitaremos métodos gasométricos que son más dificultosos por usar
aparatos más sofisticados y caros. Finalmente, podríamos medir también la velocidad de la
reacción midiendo el sustrato agua, pero como todos los reactivos empleados son acuosos,
la cantidad de moléculas de agua que entran en la reacción es sumamente pequeña en
comparación con las que tenemos en el tubo de ensayo, y por otro lado, medir agua es muy
difícil por lo que esto lo descartamos. Por lo tanto, en esta práctica para medir la velocidad
de la reacción catalizada por la ureasa vamos a medir el amoniaco formado.
EXPERIMENTO 1.

DETERMINACION DEL AMONIACO Y CONSTRUCCION DE LA CURVA DE

CALIBRACION.

Conforme lo indicado, en esta práctica mediremos el amoniaco y, por lo tanto,

debemos hacer una curva de calibración para amoniaco, puesto que vamos a hacer una
determinación cuantitativa. Esta curva nos servirá para todos los experimentos que
hagamos en ésta y en la siguiente práctica, ya que en todos ellos determinaremos velocidad
inicial como amoniaco formado por minuto.

Se usará un método fotocolorimétrico para la determinación de amoniaco. Dicho

método emplea el Reactivo de Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio, que
al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo que tiene color
anaranjado castaño. No se conoce bien la estructura de dicho complejo, pero ha sido
propuesto que la reacción entre el reactivo de Nessler y el amoniaco es la siguiente:

2 K2HgI4 + NH3 + 3 KOH Hg2ONH2I + 7 KI + 2 H2O (2)

La intensidad de color formado será directamente proporcional a la cantidad de

amoniaco presente en cada tubo y mediremos la absorbancia de cada tubo en el
fotocolorímetro con filtro azul.

Dado que haremos una determinación cuantitativa del amoniaco con alta precisión
haremos una curva de calibración para amoniaco a fin de convertir absorbancia en
micromoles ( moles ) o nanomoles ( nmoles ) de amoniaco o amonio.

Se preparará varios tubos con diferentes concentraciones de amoniaco. Para esto

tendremos una solución de sulfato de amonio:

58
 (NH4)2 SO4 , 5 x 10-4 M
Procedimiento.

Es conveniente tener concentraciones entre 50 a 500 nmoles de sulfato de amonio en

cada tubo, por lo tanto:

a) Medir en cada uno de seis tubos 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; y 0.6 ml de sulfato de
amonio.
b) Medir en el tubo blanco, solamente agua un volumen de 4.5 ml.
c) Completar con agua todos los tubos para que tengan un volumen final de 4.5 ml
d) Luego, agregar a cada tubo 0.5 ml. de Reactivo Nessler, mezclar bien y dejar en
reposo por 10 minutos a temperatura ambiente.
e) Medir la absorbancia en el fotocolorímetro con filtro azul.

Si la experiencia está bien hecha, se obtendrá resultados de absorbancia semejantes a

los siguientes: 0.216; 0.332; 0.442; 0.560; 0.680; 0.790; para los tubos del 1 al 6
respectivamente; y para el blanco 0.100.

Expresión de Resultados.

1. Complete el siguiente cuadro haciendo los cálculos necesarios

nmoles nmoles
Tubo H2O (NH4)2 SO4 de de úrea Reactivo Absorban- Absorban-
ml 5 x 10-4 M amonio por tubo Nessler cia cia Neta
por tubo

1 0.1 ml 0.5 ml 0.216

2 0.2 ml 0.5 ml 0.332

3 0.3 ml 0.5 ml 0.442

4 0.4 ml 0.5 ml 0.560

5 0.5 ml 0.5 ml 0.680

6 0.6 ml 0.5 ml 0.790

Blanco 4.5 ---- 0.5 ml 0.100

59
3. Con los datos del cuadro anterior, hacer la curva de calibración en papel milimetrado,
colocando en el eje X, la concentración de amoniaco ( o de amonio que es lo mismo )
en nanomoles y en el eje Y las absorbancias netas.

En el espacio que sigue adjunte la curva de calibración.

Figura Nº 5.1.- Curva de calibración para la urea (sulfato de amonio )

Esta curva de calibración nos servirá para convertir absorbancias en nanomoles de

amoniaco, y por consiguiente podemos deducir los nanomoles de urea hidrolizada.

EXPERIMENTO 1.2

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD UREASICA.

Como se ha visto en la parte teórica del curso, la cuantificación de la actividad de una

enzima se hace mediante la medida de las Unidades de Actividad Enzimática, medida de
Actividad Específica y de la actividad molecular.

60
 Antes de hacer estudios cinéticos, es conveniente tener una idea de la actividad
ureásica de nuestro preparado enzimático; por lo tanto, en este experimento calcularemos
la actividad ureásica de la muestra enzimática, midiendo las unidades de actividad y la
actividad molecular.
Se dispondrá para este experimento de los siguientes reactivos:
 Solución de urea 0.3 M
 Buffer fosfato 0.05 M pH 7.4
 Solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH 7.4 que contiene EDTA 5 x
10-4 M ( debe mantenerse en hielo).

Cada sistema de ensayo ( tubos ) para la medida de la actividad ureásica contendrá las
siguientes condiciones: Volumen total 3.0 ml
Sustrato ( urea ) : 0.04 M
Ureasa: 20 g / ml

Calcule que volumen de los reactivos mencionados previamente habrá que usar para
preparar el sistema de ensayo mencionado. Como el volumen total del sistema es de 3.0 ml
habrá que completar el volumen del sistema con buffer fosfato pH 7.4 para que éste
alcance el volumen mencionado.

Debe usarse un tubo control o blanco, el cual se preparará en forma semejante al

sistema señalado, pero solamente no llevará enzima; en vez de ureasa, se debe colocar el
mismo volumen, pero de agua o buffer fosfato pH 7.4 .

Vaya llenando los datos que se señalan en el cuadro adjunto. Una vez que se tenga los
cálculos pedidos, proceder de la siguiente manera.

Procedimiento.

a) Medir en los tubos ( sistema y blanco ), primero la solución de urea y el buffer

fosfato.
b) Preincubar los tubos en baño maría a 37 ºC por 5 minutos.
c) Agregar la enzima al sistema y agua al tubo blanco, mezclar rápidamente y poner
a 37 ºC durante 15 minutos, exactamente.

OJO: Tenga cuidado de medir exactamente este tiempo de incubación, ya que la reacción
marcha rápidamente a partir del momento en que se agrega la enzima, así que para este

61
experimento, o los demás, esta recomendación debe seguirse estrictamente; de esto
depende la obtención de buenos resultados.

d) Terminado el tiempo de incubación, poner los tubos en hielo picado a fin de para
la reacción por unos 5 minutos
OJO: Tenga cuidado que los tubos estén bien sumergidos en el hielo, por lo menos la parte
del tubo que contiene líquido, esto es importante porque si no la reacción sigue avanzando
y no se obtendrán buenos resultados.
e) Luego, para medir el amoniaco formado, proceder de la siguiente manera:
 Con anterioridad, cuando se está midiendo la actividad ureásica, marcar
2 tubos: Sistema y Blanco, y agregar a cada uno 4.2 ml. de agua
destilada y colocarlos sobre hielo picado.
 Con una pipeta retirar 0.3 ml. de cada uno de los tubos: Sistema y
Blanco, donde ocurrió la actividad ureásica y colocarlos sobre los tubos
que tienen agua destilada y que ya estaban sobre hielo.
 Mezclar bien y agregar inmediatamente 0.5 ml. del reactivo de Nessler.
 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente por 10 minutos.
 Leer la absorbancia en el fotocolorímetro con filtro azul.

Urea 0.3 M 5 min.

............ ml
............ Buffer Fosfato pH 7.4
ml ...... Ureasa 0.6 mg / ml
...... ml
3.0 ml
15 min. 37 ºC
0.5 ml Reactivo
NESSLER

Preparar un Blanco con 0.3 0.3 ml

ml de Agua destilada en
lugar de solución de
reacción

Reposo

Hielo
37 °C

LEER
ABSORBANCIA 4.2 ml
62 Detener la
Agua
destilada reacción en hielo
 Figura N° 5.2.- Procedimiento para la medida de la actividad Ureásica

Expresión de Resultados.
Anote en la siguiente tabla los volúmenes de los reactivos que midió para cada sistema
Sistema de ensayo Blanco o Control

Solución de úrea 0.3 M

Buffer Fosfato pH 7.4

Solución de ureasa 0.6 mg / ml

Volumen total del tubo

Las absorbancias obtenidas, fueron:

a) Sistema de ensayo ______________
b) Blanco ______________

Complete lo siguiente:
a) nmoles de urea hidrolizada: ____________
b) nmoles de urea hidrolizada por minuto: (vi) ____________

PROBLEMA:
En base a la actividad ureásica obtenida. Calcular la actividad molecular de la Ureasa
Nota : Para el cálculo de la actividad molecular considerar que el PM de la ureasa es de
500,000.
Cálculos:

Respuesta: …………………………..

63
64
 PRACTICA N° 8

BIOCATALISIS
I. OBJETIVOS

 Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

 Determinar el pH óptimo para la actividad de la pepsina.
 Estudiar la influencia de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.
1.
II. MARCO TEORICO

Las enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químicas de los
organismos vivos, incrementando la velocidad de estas hasta alcanzar su punto de
equilibrio.

En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la
reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de
los correspondientes substratos, en tanto que la enzima permanece inalterable.

La actividad enzimática usualmente es expresada por:

a) La desaparición del sustrato (P)

b) La aparición del producto (P)
c) La modificación de los cofactores

Diversos factores modifican la actividad enzimática:

a) El pH del medio

65
 b) La concentración de la enzima
c) La temperatura de la reacción
d) La concentración del sustrato
e) La fuerza iónica ambiental
f) El tiempo de reacción
g) El efecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica se estudiará algunas de las propiedades de las reacciones

enzimáticas. Para ello utilizaremos como modelo experimental, la acción hidrolítica de
la pepsina sobre la proteína albumina de huevo.

La ovoalbúmina es una proteína globular presente en altas concentraciones en la clara

de huevo, apareciendo en el huevo fresco como una solución viscosa y ligeramente
opalescente. Esta proteína en su estado natural tiene las dimensiones de 13 mµ, y está
constituida de 584 residuos de aminoácidos dispuestos en una sola cadena
polipeptídica, con un PM de 64500 y un pI de 4.6. Esta es la proteína que será
utilizada como sustrato de la pepsina, previa desnaturalización. La desnaturalización
de la albumina se logra hirviendo él hubo por algunos minutos; entonces, se extrae la
clara, se la licua con agua destilada y esta solución se la filtra a través de una gasa. Se
obtiene así, una solución no viscosa pero turbia. Ud. tiene que observar
cuidadosamente esta solución antes y después de añadirle pepsina.

Recuerde Ud. que la pepsina es una enzima proteolítica secretada por las células
principales del estómago al estado de “zimógeno” o “proenzima” (pepsinógeno). Su
activación requiere de un pH muy ácido e implica la remoción de un péptido
bloqueador de su extremo amino terminal.

La enzima así activada, digiere a las proteínas hidrolizando los enlaces peptídicos
situados hacia el lado amino de los residuos de fenilalanina, tirosina y triptófano,
además de aspartato, glutamato y leucina (R2). No actúa si el aminoácido anterior es
prolina.

III. PARTE EXPERIMENTAL

A) Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática

Procedimiento:

66
1. Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: ( los valores se encuentran
en ml )

1 2 3 4 5

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

HC1 1.0 N 2.0 0.5 0.0 0.0 0.0

Na2CO3 10% 0.0 0.0 0.0 0.5 2.0

Agua destilada 0.0 1.5 2.0 1.5 0.0

2. En otros 5 tubos de prueba pequeños, medir 3 ml de una solución de pepsina al 1%

3. Preincubar los 10 tubos en baño maría a 37° C por 5 minutos
4. Agregar rápidamente a cada uno de los 5 primeros tubos, los 3 ml de la solución de
pepsina preincubada en cada uno de los segundos tubos.

5. Mezclar bien y continuar la incubación a 37° C por 10 minutos. Observar

cuidadosamente cada tubo antes y después de agregar la enzima.
6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5
cruces, al final de 1,5 y 10 minutos.

1 2 3 4 5

pH estimado

1 minuto
Aclaramient
o 5 minutos

10 minutos

7. Haga el cálculo teórico del pH de los tubos 1 y 2 y compruebe con papel indicador el
pH de todos los tubos.

Resultados:

1. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje
de abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimática

67
2. El pH óptimo de la pepsina es …………..………………………………………….......

Interrogantes:

1. ¿Por qué se debe cocer un huevo antes de comerlo?

2. ¿Por qué la solución de ovoalbúmina que Ud. utiliza como sustrato tiene un aspecto tan
diferente a la clara de huevo?

3. ¿Cómo define la “desnaturalización” de una proteína? ¿Puede esta ser irreversible?

4. ¿Habrán diferencias en las dimensiones de las moléculas de ovoalbúmina contenidas en

la clara de huevo y en la solución sustrato? Si las hubiera, ¿Cuál es la razón?

5. ¿Por qué ocurre aclaramiento de la solución sustrato de ovoalbúmina cuando se le

añade pepsina?

6. ¿Por qué el pH afecto la actividad de las enzimas?

B) Efecto de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Procedimiento

8. Preparar 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: ( los valores se encuentran

en ml )

1 2 3 4

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1.0 N 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua destilada 1.5 3.5 4.2 4.2

Preincubar los 4 sistemas como en la experiencia anterior y luego añadir:

68
 1 2 3 4

Pepsina 1% preincubada 3.0 1.0 0.3 0.0

Pepsina 1 % hervida 0.0 0.0 0.0 0.3

1. Mezclar bien y continuar la incubación a 37°C por 10 minutos. Observar

cuidadosamente cada tubo antes y después de agregar la enzima.
2. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5
cruces, al final de 1,5 y 10 minutos.

1 2 3 4

1 minuto

Aclaramient 5 minutos
o
10 minutos

3. Calcule la concentración de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por

tubo.

Resultados:

1. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje
de abscisas la [E] y en el eje de ordenadas la actividad enzimática.

69
 PRACTICA Nº 9

ENZIMAS II (CINETICA ENZIMATICA)

RELACION DE EXPERIMENTOS.

1. Efecto de la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad inicial.

2. Efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial.
3. Efecto del pH sobre la velocidad inicial
4. Efecto de la concentración de la enzima (ureasa) sobre la velocidad inicial.

OBJETIVOS

1. Caracterizar los factores que afectan la velocidad inicial de las reacciones

enzimáticas, tales como la concentración de sustrato, la temperatura, el pH y la
concentración de la enzima.
2. Interpretar las curvas cinéticas obtenidas con cada uno de los factores
mencionados.

EXPERIMENTO 1.
INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÖN DE SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD INICIAL.

Se hará un experimento donde se tengan varios tubos con diferente concentración de

sustrato, midiendo la velocidad inicial en cada tubo.

Usar las mismas condiciones que en el experimento 2 de la práctica anterior, pero

habrá que usar varios tubos: por ejemplo 6 tubos con diferentes concentraciones de

70
sustrato, éstas pueden variar entre 0.003 M y 0.06 M. Calcular cuántos ml. de solución de
úrea 0.3 M se deberá medir para cada sistema. Se usará la misma cantidad de enzima que
en el experimento anterior y calcular cuánto de buffer fosfato pH 7.4 le deberá
corresponder a cada sistema.

No olvide que cada tubo o sistema tiene un volumen total de 3.0 ml. y deberá usar un
tubo o sistema blanco o control.

Proceda a completar la siguiente tabla:

Sol. de Buffer Ureasa
TUBO (S) Úrea 0.3M Fosfato 0.6 Absorb Absorb Vi.
Nº mM mg/ml. 1 / (S) D.O. Neta nmol/mi 1 / Vi
ml. ml. ml.
1 60 0.6 2.30 0.1 0.625
2 40 0.4 2.50 0.1 0.610
3 30 0.3 2.60 0.1 0.592
4 15 0.15 2.75 0.1 0.528
5 10 0.1 2.80 0.1 0.468
6 5 0.05 2.85 0.1 0.362
Blanco 40 0.4 2.60 0.1 * 0.080
* Agua destilada

Siga los mismos pasos que para el experimento 2 de la práctica anterior. Al final
determinar el amoniaco a través de la reacción del Nessler.

EXPRESION DE RESULTADOS.
Complete la tabla de arriba, expresar la velocidad inicial en nanomoles por minuto.
Para los cálculos puede usar los datos de la tabla o los que haya obtenido en su
experimento.
En el espacio siguiente y usando papel milimetrado haga el ploteo de Michaelis-
Menten.

71
 Haga el Ploteo de los inversos 1 / Vi frente a 1 /(S) (lineweaver – Burk) en papel
milimetrado y utilice el siguiente espacio:

Dependiendo del tiempo disponible, puede hacer otros tipos de Ploteo.

Calcular:
Según ploteo de Michaelis Según ploteo de Lineweaver -
Burk
KM.
V max.

EXPERIMENTO 2.
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL

72
 En este experimento se examinará el efecto de por lo menos cinco temperaturas sobre
la velocidad inicial. Se trabajará con las siguientes temperaturas:
Baño de hielo : 0 A 4 ºC Baño María : 50 ºC
Agua T. Ambiente : 20 ºC Baño hirviente : 92 – 96 ºC
Baño María : 37 ºC
En cada temperatura usar un sistema igual al del experimento anterior. Proceder de la
misma forma. Hacer un blanco para cada temperatura; no obstante, si hay limitaciones en
el material es importante hacer solamente el blanco de las temperaturas de 50 ºC y baño
hirviente.

Expresión de Resultados.

1. Complete la siguiente Tabla:

TUBO 1 2 3 4 5 Blanco
Temperatura 0–4ºC 20 ºC 37 ºC 50 º C 92 ºC 37 ºC
Absorbancia 0.188 0.391 0.693 0.285 0.154 0.100
Absorb. Neta
Velocidad Inicial
nmoles / minuto.

Puede trabajar con estos datos o con los obtenidos en el experimento.

2. Utilizando papel milimetrado, haga la gráfica del ploteo velocidad inicial versus
temperatura y péguelo en el espacio siguiente:

73
 3. Estimar lo siguiente:
Temperatura óptima de la ureasa : _____________ Q10 : _________
EXPERIMENTO 3.
INFLUENCIA DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL.

Se examinará la velocidad inicial a diferentes pH. Se preparará diferentes sistemas o

tubos con diferentes pH, que pueden variar entre 6.2 y 8.2 . Se usarán las mismas
condiciones que en el experimento 2 de la práctica anterior, solamente que en cada pH se
deberá usar diferentes buffer fosfato. Se recomienda un blanco para cada pH; pero si esto
no es posible, usar blancos para los sistemas que crea conveniente.

Expresión de Resultados.
1. Calcular la velocidad inicial para cada pH y anotarla en la siguiente Tabla.

1 2 3 4 5 Blanco
pH 6.6 7.0 7.4 7.8 8.2 7.4
Absorbancia 0.410 0.590 0.785 0.398 0.256 0.126
Absorb. Neta
Vi (nmoles/min.)

2. Hacer un ploteo de velocidad inicial versus pH, utilizando el espacio siguiente.

74
Completar:
El pH óptimo de la ureasa es: _____________

EXPERIMENTO 4.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD

INICIAL.

En este experimento se examinará el efecto de por lo menos 4 concentraciones de

enzima. Para tal efecto se puede usar las siguientes concentraciones de enzima ( ureasa ):
5, 10, 15 y 20 g / ml. Tener en cuenta que el volumen total de cada sistema es de 3 ml. ;
es decir, las mismas condiciones que en los experimentos anteriores, solamente que en
cada tubo hay diferente concentración de enzima.

Expresión de resultados.

2. Complete la tabla siguiente, anotando la velocidad inicial en nmoles/minuto que

corresponde a cada concentración de enzima.

TUBO Sol. de Sol. de Buffer

Urea 0.3 Ureasa (E) Fosfato Absorb. Absorb. Vi
Nº M 0.6 mg/ml. g / ml pH 7.4 ( D.O ) Neta nmoles/min
( ml.) ( ml.) ( ml.)

1 0.4 0.100 20 2.500 0.490

2 0.4 0.075 15 2.525 0.400
3 0.4 0.050 10 2.550 0.304
4 0.4 0.025 5 2.575 0.220
Blanc 0.4 0.100 * --- 2.500 0.110

75
* Agua destilada.

3. Usando papel milimetrado, haga el ploteo de la velocidad inicial ( Vi ) frente a la

concentración de la enzima ( E ) y péguelo en el espacio indicado abajo. Puede
trabajar con los datos señalados en la Tabla o con los obtenidos en su experimento.

INTERROGANTES.

1. Qué es la KM y que importancia y significado tiene? En que unidades se la expresa.

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

2. Qué es la velocidad máxima? En que unidades se le expresa.

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

76
3. Cómo se explica el efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial de una enzima?
Qué es temperatura óptima?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
4. Cómo se explica el efecto del pH sobre la velocidad inicial de una reacción
enzimática? Qué es pH óptimo?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

5. Cómo explica el efecto de la concentración de las enzimas sobre la velocidad de

reacción que catalizan?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

6. Qué otros factores pueden influenciar sobre la velocidad de una reacción enzimática?
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

7. El pH y la KM puede ser afectados por la temperatura?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

8. Si alcanzada la velocidad máxima, se aumentara más enzima qué ocurre?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

77
78
 PRACTICA Nº 10

VITAMINAS

RELACION DE EXPERIMENTOS.

1. Determinación cuantitativa de Vitamina C, en jugos de frutas cítricas.

OBJETIVOS.
1. Cuantificar el contenido de vitamina C en diferentes frutos
2. Interpretar el fundamento de la determinación de vitamina C.

INTRODUCCION.

Las vitaminas son compuestos orgánicos de estructura química diversa, que cumplen
destacada función en el mantenimiento de la salud y que al no poder ser sintetizadas por el
organismo, deben ser ingeridas necesariamente en la alimentación; no obstante sólo se
requiere de ellas, cantidades muy pequeñas.

Las vitaminas no tienen roles plásticos, ni energéticos y su mecanismo de acción es

básicamente regular el metabolismo directamente o a través de la constitución de
coenzimas y/o grupos prostéticos. No obstante, algunas vitaminas cumplen además roles
específicos.

79
 El indicar la incapacidad de la síntesis de las vitaminas, por los animales superiores,
no es del todo cierto, ya que está demostrado que el ácido nicotínico ( niacina ) puede ser
sinteizado a partir del aminoácido triptófano. De otro lado, existen otras vitaminas (ácido
pantoténico, biotina) cuyas manifestaciones carenciales en el hombre, no han podido ser
detectadas adecuadamente.

EXPERIMENTO Nº 1.

DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA VITAMINA C EN PLASMA

SANGUINEO O EN FRUTOS CITRICOS.

La vitamina C pura ( ácido L-Ascórbico ) es una sustancia blanca cristalina, de sabor

ácido, insoluble en la mayoría de solventes orgánicos; en el agua su solubilidad es de 1 g
en 3 ml. Tiene un fuerte poder reductor, que deriva de la facilidad con que puede perder los
átomos de hidrógeno que constituyen los grupos hidroxilo unidos a los átomos de carbono
que conforman el doble enlace ( enediol ).

C=O C=O
-2H
C – OH O C=O O
+2H
C – OH C=O
H–C H–C
HO – C – H HO – C – H

ÁcidoCH 2OH
Ascórbico CH2OH
Ácido deshidroascórbico

Su función mejor conocida corresponde a su participación en la producción de los

tejidos de origen mesenquimatoso, como el colágeno, dentina, etc., aunque su mecanismo
de acción aún no está aclarado; no obstante se piensa que la síntesis de hidroxiprolina está
perturbada cuando hay un déficit de vitamina C. También se ha postulado la participación
del ácido L-ascórbico en otras reacciones de hidroxilación, como la conversión del
triptófano en serotonina. También se ha reportado la intervención de la Vitamina C en la
absorción del Fe en el intestino de humanos.

Experimentalmente es factible producir escorbuto en el hombre, primates, y en el

cobayo. En cambio en otros animales resulta dificultoso en razón a la capacidad que tienen
éstos de poder sintetizar la vitamina. A las manifestaciones clínicas propias del escorbuto y

80
que se observan muy bien en cobayos, se suman otras alteraciones bioquímicas, como un
metabolismo anormal de la tirosina. En este sentido la administración de tirosina o
fenilalanina, determinan una considerable excreción urinaria de p-hidroxifenilpirúvico. Se
asume que la actividad de la p-hidroxifenilpirúvico hidroxilasa que cataliza la
transformación del p-hidroxifenilpirúvico en ácido homogentísico, está disminuida en
animales escorbúticos.

Cl Cl

+2H
HO N O HO N OH
-2H H
Cl Cl

La determinación de la vitamina C en líquidos biológicos ( suero o plasma sanguíneo,

jugos de frutas ) se funda en la reducción del 2, 6 diclorofenolindofenol en presencia de
ácido acético y ácido metafosfórico los que previenen la oxidación aeróbica de la vitamina
y además precipitan a las proteínas.

Procedimiento.

a) A 2 ml de plasma (o Jugo de frutas), añadir un volumen igual de solución acética-

metafosfórica (ácido acético al 8 % (p/v) y ácido metafosfórico al 2 % (p/v).
b) Titular con una solución 0.05 % 2, 6 diclorofenolindofenol, hasta una coloración
rosada débil y persistente durante 5 segundos.
c) Titular un blanco como control ( agua en lugar de muestra ).
d) Para efecto de los cálculos asuma que cada 1ml de 2, 6 diclorofenolindofenol
equivale a 0.12 mg. de ácido L-ascórbico

Expresión de resultados.

En un cuadro anote la concentración de vitamina C en el plasma o las diferentes

soluciones problema (jugos) en mg %.

2, 6 diclorofenol indofenol mg. de Ac. Ascórbico / 100 ml de

MUESTRA gastados (ml.) jugo
Naranja

Limón

81
 Mandarina

INTERROGANTES.
1. Comente brevemente la síntesis de vitamina C en otros animales.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. Cómo se explica que la vitamina C no sea tal para la rata?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

3. Qué propiedad del ascorbato se utiliza para su determinación?

______________________________________________________________________

4. Como determinaría colorimétricamente la vitamina C?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

5. Cite Ud. las funciones que cumple la vitamina C en humanos.

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
6 Explique el fundamento en que se basa la determinación de la vitamina C.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

7. Una madre adolescente trae a su hijo, de 10 meses de edad, a su consulta. El lactante

presenta inflamación dolorosa en las piernas, esternón hundido, purpura (lesiones
hemorrágicas en la piel), y lesiones en las encías alrededor de los 4 dientes que ya han
82
 brotado. Durante la entrevista, la madre le dice que la dieta del bebe consiste solamente
en leche, ya que ella ha oído que es mejor que los niños no tomen nada excepto leche
hasta que cumplan un año de edad, por lo cual el niño no recibe actualmente
jugos, frutas o vegetales. Según la madre, el niño recibe sol todos los días.
De acuerdo a esta información, usted ya sospecha que los signos y síntomas del niño se
deben a un déficit de:
a) Vitamina A b) Vitamina B1 c) Vitamina B2 d) Vitamina B6 e)Vitamina B12 f)
Vitamina C g) Vitamina D h) Vitamina E i) Vitamina K

8. Paciente femenina de 30 años de edad acude a su oficina muy ansiosa, debido a que
tiene un atraso de 10 días en su menstruación. La paciente le refiere que está tratando
de salir embarazada, ya que perdió un embarazo dos años antes, debido a que el bebé
nació con anencefalia. Usted le indica pruebas de embarazo, las cuales resultan
negativas. No obstante, y aunque la paciente no está embarazada, tiene un buen estado
general y goza de buena salud, usted considera importante prescribirle el siguiente
micronutriente:

a) Ascorbato b) Calcio c) Cianocobalamina d) Folato e) Hierro f) Niacina

g) Riboflavina h) Vitamina A i) Vitamina D j) Vitamina E k) Vitamina K

Justifique.

83
84
 PRACTICA Nº 11

OXIDACIONES BIOLOGICAS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:
1. Xantino deshidrogenasa de la leche
2. Oxidación del Lactato y succinato por un homogenizado de músculo cardiaco

OBJETIVOS:

1. Estudiar la oxidación del Succinato y del Lactato por un homogenizado de

músculo cardiaco
2. Estudiar la necesidad de cofactores y acción de inhibidores.
3. Estudiar la actividad de la xantino deshidrogenasa de la leche.

INTRODUCCION:

Como es sabido, en la membrana mitocondrial interna existe una serie de

transportadores de hidrógeno y/o electrones, que en conjunto se conocen como cadena
respiratoria mitocondrial. Así, diversos sustratos en determinadas vías metabólicas, al
oxidarse pierden 2 hidrógenos (2 protones y 2 electrones) por acción de deshidrogenasas
ya sea NAD o FAD dependientes, estableciéndose desde aquí un verdadero proceso de
transferencia de hidrógenos y/o electrones, dando como resultado final la reducción del
oxígeno y su conversión en agua y la consecuente liberación de energía libre que es
aprovechada en la formación de ATP.

85
 PIRUVATO
LACTATO

ADP + Pi
ASCORBATO
NAD FMN ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi ATP
Rotenona
Barbitúricos
Piericidina CoQ Cit b Cit c1 Cit c Cit (a + a3) 1/ O2=
Clorpromacina 2
Antimicina A CN-
FAD BAL CO
MALATOISOCITRA Feniletilbiguanidas Azida Sódica
TOGLUTAMATOO Naptoquinona Sulfuro de H
H Acil CoA SUCCINATO
 Ceto
Glutarato

Figura Nº 1.1.- Cadena Respiratoria Mitocondrial

En el esquema que presentamos, se observan los componentes de la cadena
respiratoria mitocondrial de mamíferos. Se observan también algunos sustratos que al
oxidarse, los protones y / o electrones perdidos en estos procesos son transportados
por la cadena respiratoria. Así mismo, se muestra el sitio de acción de algunos
inhibidores, lo mismo que los lugares donde se genera ATP.

Está bien claro entonces que cuando funciona la cadena respiratoria mitocondrial, hay
consumo de oxígeno. Así en presencia de mitocondrias y los sustratos adecuados, la
medida del consumo de oxígeno es un índice del grado de funcionamiento de la cadena
respiratoria mitocondrial. Sin embargo, la existencia de algunos compuestos que se
comportan como aceptores artificiales de hidrógenos y/o electrones, hacen factible también
el estudio de la oxidación de algunos sustratos oxidables por la cadena respiratoria
mitocondrial.

Entre los aceptores artificiales de electrones, se tiene al azul de metileno, matasulfato

de fenazina, al diclorofenol indofenol, entre los más conocidos y que tienen la
característica particular de presentar un color cuando están oxidados y otro cuando son
reducidos por algún intermediario de la cadena respiratoria.

EXPERIMENTO Nº 1.

XANTINO DESHIDROGENASA DE LA LECHE.

Rotular 4 tubos de ensayo y medir como se señala en el siguiente cuadro:

86
 TUBO 1 2 3 4
Leche cruda 5.0 ml ------ 5.0 ml 5.0 ml
Leche hervida ------ 5.0 ml ------ ------
Uretano 50% ------ ------ 1.5 ml ------
Na CN 0.008 N ------ ------ ------ 0.5 ml
Aldehido fórmico 0.1 M 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml
Azul de metileno 0.001 M 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml

a) Mezclar con cuidado cada uno de los tubos.

b) Cubrir cada tubo con una capa de 1 ml. de parafina líquida (o aceite) y colocarlos
en baño maría a 37ºC.
c) Observar el grado de decoloración cada 5 min.
EXPRESION DE RESULTADOS:

Observar el aclaramiento de los tubos cada 5 min. y anotarlo en cruces de acuerdo al

siguiente esquema:
- Tubo permanece azul
+ Ligero aclaramiento
++ Aclaramiento mayor que el anterior
+++ Tubo casi completamente claro
++++ Tubo completamente claro

TUBO Nº 1 2 3 4
Tiempo 0 min.
Tiempo 5 min.
Tiempo 10 min.
Tiempo 15 min.
Tiempo 20 min.
Tiempo 30 min.

Se puede utilizar más tiempo de lecturas si fuera necesario.

EXPERIENCIA Nº 2

OXIDACION DEL LACTATO Y SUCCINATO POR UN HOMOGENIZADO DE

MUSCULO CARDIACO.

Rotular 7 tubos de ensayo y medir lo siguiente.

87
 1 2 3 4 5 6 7
Azul de metileno 3 gts. 3 gts. 3 gts. 3 gts. 3gts. 3 gts. 3gts.
Lactato 0.1 M 2 ml. 2ml. ---- ---- ---- ---- ----
Succinato 0.1 M ---- ---- ---- ---- 2 ml. 2 ml. ----
Succinato 0.3 M ---- ---- ---- ---- ---- ---- 2 ml.
NAD 0.1 ml. --- 0.1 ml. ---- ---- ---- ----
Malonato ---- ---- ---- ---- ---- 2 ml. 2 ml.
Agua destilada 1.9 ml. 2.0 ml. 3.9 ml. 4.0 ml. 2.0 ml. ---- ----
Preparación enzimática 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml.
de músculo cardiaco

Mezclar y añadir a cada tubo 1 ml. de parafina líquida (o aceite)

Incubar en baño maría a 37ºC.

EXPRESION DE RESULTADOS:

TUBO Nº 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo 0 min.
Tiempo 5 min.
Tiempo 10 min.
Tiempo 15 min.

Puede utilizarse más tiempo de lectura si fuese necesario.

INTERPRETACION E INTERROGANTES BIOQUIMICOS

1. Los potenciales redox de los sistemas A y B, son respectivamente, - 0.23 y –0.32

voltios, indicar cuál es el sistema oxidante y cuál es el reductor.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________

2. Es necesario agregar NAD para que el lactato se oxide? Si __ No __ Qué tubo apoya
su respuesta:
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_________________________________________________________________

88
3. El lactato se ha oxidado en forma máxima en el tubo Nº ___. Explique qué es lo que
ha sucedido en dicho tubo:
______________________________________________________________________
________________________________________________________________

4. Por qué el aclaramiento del tubo 2 es menor que el del tubo.

_________________________________________________________________________________

5. Hay aclaramiento en el tubo Nº 3? Si __ No __ . Por qué?

______________________________________________________________________
________________________________________________________________

6. Hay aclaramiento en el tubo Nº 4 ? Si __ No __ . Por qué?

______________________________________________________________________
________________________________________________________________
7. Cómo explica Ud. lo sucedido en el tubo Nº 5:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________

8. Explique que pasó en el tubo Nº 6 . se aclaró? Si ___ No ___ . Qué función está
cumpliendo el malonato ?
______________________________________________________________________
________________________________________________________________

9. Qué objeto tiene el Nº 7 :

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________

10. De qué color aparecerían los tubos de no agregar la parafina? Por qué?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

11. Escriba la reacción catalizada por la Xantino deshidrogenasa de la leche en el tubo Nº 1

89
 ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

12. Por qué el cianuro no inhibe la oxidación del aldehido fórmico en el tubo Nº 4?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

13. La Xantino deshidrogenasa es una enzima mitocondrial? Si __ No __. Qué otras

fuentes tisulares podrían usarse en esta experiencia?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

14. En el tubo Nº 3 observaría aclaramiento? Si __ No __ . Cuál sería la acción del

uretano?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

15. Cuál es el sustrato natural de la Xantino deshidrogenasa y cuál es su rol fisiológico?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
___________________________________________________________

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Apellidos y Nombres: ___________________________________________
Fecha: ________________________ Firma: ________________________

PRACTICA -TALLER Nº 12

FOTOSINTESIS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Fosforilación fotosintética

OBJETIVOS.
1. Procesar las lecturas obtenidas en el aparato de Warburg para obtener la
producción de oxígeno en microlitros en el tiempo de lectura
2. Conocer la manera como se hacen los cálculos para encontrar la relación P/O en
cada momento en que se hace la lectura del experimento de fosforilación
3. Interpretar adecuadamente los resultados presentados en el experimento

MANOMETRIA

Los métodos manométricos permiten estudiar los procesos bioquímicos en general o

reacciones bioquímicas en particular en donde se consumen o se producen gases, como el
caso de la respiración celular, la fotosíntesis, la oxidación de los ácidos grasos, etc., para

91
hablar de procesos o como el caso de la Descarboxilación del piruvato, la hidrólisis de la
urea, etc, para hablar de reacciones. El proceso o la reacción se lleva a cabo en un vaso
cerrado conectado a un tubo manométrico que contiene un líquido y cuya variación de
nivel permitirá medir cuantitativamente los cambios gaseosos producidos. Los aparatos
diseñados para hacer estas determinaciones se denominan respirómetros y uno muy usado
es el de Warburg.

Aparato de Warburg.

Consiste de un manómetro graduado en milímetros, que se adapta a un frasco por

medio de una superficie perfectamente esmerilada. Durante la operación, el frasco, unido
al manómetro , es colocado en un baño de agua a temperatura constante y con agitación
permanente para mantener la temperatura uniforme en toda la masa de agua. El baño
dispone de un termostato muy sensible que contribuye a evitar variaciones en la
temperatura mayores a 0.05°C. Resulta fundamental mantener la temperatura muy
constante para la exactitud de las medidas.
El manómetro es un tubo de vidrio en U, cuyas dos ramas tienen aproximadamente 30
cm de longitud y un calibre interior de aproximadamente 1 mm. La extremidad inferior
esta conectada a un reservorio de goma que contiene el líquido manométrico. La rama del
manómetro que comunica con el frasco tiene además una prolongación que posee una llave
que permite abrir o cerrar el sistema; la otra rama del manómetro queda abierta.

El frasco es de forma cónica, esmerilado interiormente para hacer conexión con el

tubo manométrico. En su centro tiene una copa cilíndrica para colocar álcali concentrado,
destinado a absorber el CO2 que pudiera formarse en el curso del experimento. El frasco
también tiene un brazo lateral cuyo fin es contener reactivos que deben ser mezclados con
aquellos del compartimiento principal para dar inicio a la reacción.

Manómetro
Warburg
Compartimient
o principal
Frasco
Warburg

Nave Brazo
Baño maría lateral
Warburg central Frasco Warburg
92
 manométrico

Figura Nº 10.1.- Respirómetro de Warburg

Las variaciones que pudieran producirse en la lectura del manómetro independientes

del consumo o producción de gases en el experimento, como aquellas derivadas de
pequeñas variaciones externas en la presión o en la misma temperatura de los sistemas, se
corrige con la operación de otro sistema (frasco-manómetro) que es denominado como
termobarómetro (TB). Este sistema contiene en su frasco un volumen de agua igual al del
líquido en donde ocurre la reacción y se hacen sus lecturas al mismo tiempo que la de los
otros sistemas. Las lecturas del TB se sumarán o restarán de la correspondiente al sistema
experimental para obtener la lectura neta que sólo corresponde a la originada por el
consumo o producción de gases en el proceso o reacción estudiada.

Cada sistema tiene una constante para medir el consumo de oxígeno (KO2) o la
producción de CO2 (KCO2). Estas constantes son muy prácticas ya que basta multiplicar la
lectura neta del manómetro del sistema experimental, por su valor, y obtener según el caso,
el consumo de oxígeno en μL o la producción de CO2 en μL, en el tiempo de estudio.

Constantes del sistema cerrado.

A partir de algunos datos experimentales y aplicando la ecuación de los gases

perfectos, se ha determinado una constante para medir consumo o producción de oxígeno
(KO2) ; o para medir consumo o producción de CO 2 (KCO2) ; estas constantes resultan de
mucha utilidad ya que basta multiplicar la altura de variación en el termobarómetro (h) por
su valor y obtener el consumo o producción del gas en microlitros.

El valor del KO2 se estima con la aplicación de la siguiente fórmula :

Vg . 273 / T + Vf .  O2
KO2 =
10

93
 Donde : Vg es el volumen del gas en el manómetro
T es la temperatura de incubación en grados absolutos
Vf es el volumen del líquido en el frasco
 O2 es el coeficiente de solubilidad del oxígeno a la temperatura de trabajo

EXPERIMENTO 1.

FOSFORILACION FOTOSINTETICA

Utilizar los resultados obtenidos en un experimento de fotofosforilación para hacer

cálculos de la producción de oxígeno y del consumo de fosfato e interpretarlos
adecuadamente.

Procedimiento utilizado para la obtención de los resultados publicados

a) Una suspensión de cloroplastos de espinaca en un tampón adecuado, y 0,2 ml de

K2HPO4 (40 mM) se colocaron en el compartimiento principal de 2 frascos de
Warburg
b) Al frasco de Warburg 2, se añadió 0,2 ml de ADP 50 mM
c) El volumen de ambos frascos ( 1 y 2 ) fue llevado hasta 2,8 ml con agua destilada
d) Al brazo lateral de cada frasco de Warburg se añadió 0,2 ml de K 3Fe(CN)6 y en
la copa central de cada frasco de Warburg se midió 0,2 ml de KOH al 40%
e) Cerrados cada sistema manométrico (manómetro y frasco), se procedió a su
equilibrio, estando el baño a 16 oC. A esta temperatura, el coeficiente de
solubilidad del oxígeno es 0,034
f) Junto a los dos sistemas manométricos experimentales también se incubo el
termobarómetro (TB), que contenía agua destilada en el mismo volumen que
cada uno de los sistemas experimentales
g) Luego de 10 minutos de equilibrio, se procedió a hacer las lecturas (tiempo cero)
en los sistemas experimentales y en el termobarómetro.
h) Luego se inclino el frasco para permitir que el ferrocianato pase la nave principal
del frasco de Warburg y se ilumino la preparación para dar inicio a la reacción

94
 i) Las lecturas se hicieron en los tiempos que se indican en la Tabla que se presenta
a continuación, donde también están los valores encontrados.

TIEMPO TB FRASCO 1 FRASCO 2

0’ 100 110 105

3’ 100 117 118

6’ 101 124 130

9’ 100 129 142

15’ 101 143 163

21’ 101 152 175

24’ 102 157 178

Determinación de Fosfato.

a) Un duplicado del frasco 1 y otro del frasco 2 fueron medidos e incubados en las
mismas condiciones que los anteriores ; con el objeto de hacer la estimativa del
fosfato consumido en los diferentes momentos de lectura.
b) Se agitaron en el mismo baño que los anteriores y en los momentos en que se hacia
la lectura en ellos, en estos últimos se retiraron alícuotas para hacer la
determinación de fosfato por un método colorimétrico.
c) Para la determinación se detuvo la reacción con ácido tricloroacético al 5%, se
filtro la preparación y en el filtrado libre de proteínas se añadió molibdato de
amonio y posteriormente reactivo reductor. La intensidad de la coloración (azul)
obtenida, fue estimado en un fotocolorímetro.
d) La cantidad de fosfato inorgánico ( en micromoles ), presente en cada tiempo y en
cada uno de los frascos, fue la siguiente.

TIEMPO FRASCO 1 FRASCO 2

0’ 10.1 9.90

3’ 10.0 8.80

6’ 9.8 7.50

95
 9’ 10.1 6.25

15’ 9,5 4.88

21’ 10.0 3.00

24’ 9.9 2.80

Resultados :

1. Utilizando las lecturas manométricas y siguiendo las indicaciones del instructor,

llene la tabla que se presenta en la página siguiente.

2. Para efecto de cálculo de KO2, tenga en cuenta que los volúmenes del frasco y del
manómetro hasta el punto de inicio del líquido manométrico, fueron
respectivamente 16,8 ml y 16,5 ml para los sistemas 1 y 2.

TERMOBARO - FRASCO 1 FRASCO 2

Tiemp METRO KO2 = KO2 =
(min.) L.B. C L.B. C L.N. L.B. C L.N.
0’
3’
6’
9’
15’
21’
24’
3. En el espacio, Calcular los microlitros de oxígeno liberados por hora en el sistema
1 y en el sistema 2

Sistema 1 ______________ Sistema 2 _________________

4. Haga los cálculos correspondientes y complete la siguiente tabla :

TIEMPO Microátomos de oxígeno Micromoles de fosfato consumidos

(minutos) desprendidos
- ADP + ADP - ADP + ADP
0’

96
 3’
6’
9’
15’
21’
24’

5. Utilizando los datos obtenidos en el sistema 2 ( + ADP ), haga los cálculos y

complete la siguiente tabla.

Tiempo 3 6 9 15 21 24
( Minutos )
RELACION
P/O

6. Utilizando papel milimetrado haga un gráfico que relacione producción de

oxígeno y consumo de fosfato ( eje vertical ) versus tiempo ( eje horizontal ).

Use la misma escala para la producción de oxígeno (microátomos) y para el

consumo de fosfato (micromoles). Tome en cuenta los datos de ambos sistemas.

INTERROGANTES.

1. Para que se añade el K3Fe (CN )6 ?

97
 ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

2. Qué destino tiene el fosfato consumido en el sistema 2 ?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
3. Esta ocurriendo la fase en la oscuridad en los experimentos presentados?. Fundamente
su respuesta.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

4. Que explicación le merece el que haya una importante producción de oxígeno en el

sistema 1 ?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

5. Con los datos presentados puede señalar cuantos sitios de fosforilación existen en la
cadena de transporte fotosintético de electrones ?. Fundamente su respuesta.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

6. Haga un esquema de la cadena fotosintética transportadora de electrones e indique los

lugares de síntesis de ATP.

98
 PRACTICA Nº 13

DIGESTION

RELACION DE EXPERIMENTOS.

1. Hidrólisis enzimática del almidón. Acción de la amilasa salival.

2. Digestión de triglicéridos de la leche.
3. Digestión de la ovoalbúmina. Acción de la pepsina y tripsina.

OBJETIVOS.

1. Conocer la manera cómo actúa la amilasa salival sobre el almidón

2. Reconocer el requerimiento de sales biliares para una acción eficiente de la
lipasa pancreática sobre los triglicéridos.
3. Evaluar la necesidad de condiciones óptimas de pH para la buena actividad
de pepsina y tripsina para la degradación de proteínas.

INTRODUCCION.

99
 La digestión y absorción, son las etapas previas que deben experimentar los
carbohidratos, lípidos y proteínas, que son los principales componentes de la dieta del
hombre, para ser incorporados al organismo.

De las sustancias que componen los alimentos, sólo, el agua, las sales inorgánicas,
las vitaminas, algunos lípidos y monosacáridos pueden ser utilizados directamente
por el organismo. La mayoría de los componentes que se ingieren en la dieta deben
ser sometidos a un proceso de degradación que se conoce con el nombre de digestión.
Durante este proceso las moléculas complejas presentes en los alimentos son
descompuestas en sustancias más simples, que el organismo puede incorporar y
utilizar. Esta degradación se cumple mediante reacciones de hidrólisis, catalizadas
por enzimas presentes en los jugos digestivos.

Cuando se obtienen por la digestión, moléculas sencillas, éstas ingresan a la

circulación sanguínea mediante un proceso de absorción a nivel de la mucosa
intestinal. Este proceso no es simplemente una difusión de sustancias de bajo peso
molecular a través de las membranas celulares permeables, sino que éste es el
resultado de un proceso selectivo.
Hidrólisis enzimática del almidón.

El almidón es un hidrato de carbono ampliamente distribuido en las plantas ,

donde se encuentra constituyendo gránulos envueltos en una fina membrana de
celulosa. Estos gránulos no son solubles en el agua, pero al romperse la pared de
celulosa por trituración o por calentamiento, se libera el almidón soluble. Si la
solución en caliente es muy concentrada, al enfriarse se transforma en un gel. El
almidón es en realidad una mezcla de dos polisacáridos: Amilosa y amilopectina. La
amilosa es un polímero lineal formado por moléculas de glucosa unidas por enlaces
glicosídicos alfa 1 – 4 . La amilopectina es un polímero ramificado constituido por
moléculas de glucosa, que se unen por enlaces alfa 1 – 4 y alfa 1 – 6. La hidrólisis de
los enlaces glicosídicos del almidón es catalizada por ácidos, así como por enzimas,
dentro de estas últimas, podemos mencionar a la amilasa salival.

La amilasa salival, es una endoamilasa que hidroliza los enlaces  1 – 4 , presentes

en el interior de la molécula del almidón, obteniéndose como productos
fundamentalmente maltosa. Se producen además escasos residuos de maltotriosa,
glucosa y unas estructuras ramificadas llamadas dextrinas límite, que presentan
100
enlaces  1 – 6, los cuales no son hidrolizados por la amilasa salival. En la
degradación del almidón por la amilasa salival se obtienen los siguientes
intermediarios:

Almidón

Almidón soluble

Dextrinas superiores + Maltosa + Maltotriosa

Eritrodextrinas + Maltosa + Maltotriosa

Acrodextrinas + Maltosa + Maltotriosa

Maltosa + Glucosa en pequeña cantidad

El control de la degradación del almidón se realiza mediante las reacciones del

yodo y del Benedict cualitativo; la primera es positiva para los polisacáridos,
mientras que la segunda identifica al azúcar reductor que se forma.
Obtención de la amilasa salival:
a) Enjuagarse la boca con agua de caño.
b) Mantener en la boca unos 20 ml de agua destilada tibia durante 2 minutos
y vaciarla luego en un beaker.
c) Filtrar esta solución por una gasa y mantenerla en hielo hasta el momento
de usar.

Preparación de la solución de digestión.

a) Colocar 25 ml. de una solución de almidón soluble al 1 % en un

Erlenmeyer pequeño y añadir 3 ml de la solución de amilasa salival.
b) Tomar inmediatamente una alícuota con la cual se deberá realizar la
reacción de yodo y benedict, representando esta muestra, el tiempo cero.
c) El resto de la solución de digestión, se le incuba a 37 ºC por 30 minutos,
tomando alícuotas cada 30 segundos para la reacción de Yodo y cada 5
minutos para la reacción de Benedict.

101
 Reacción de Yodo.

 Rotular 10 tubos y medir en cada uno de ellos:

 HCl 0.05 N 2.50 ml.
 Solución de Yodo 0.25 ml.
 Solución de digestión 0.25 ml.
 Dejar en reposo, observar e interpretar los resultados:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Observ
Color

Reacción de Benedict.
 Rotular 6 tubos y medir en cada uno de ellos:
 Reactivo de Benedict 2.50 ml.
 Solución de Digestión 0.25 ml.
 Colocarlos en baño hirviente por 5 minutos.
 Observar los resultados e interpretar.

Tubo 1 2 3 4 5 6

Digestión de los Triglicéridos de la leche.

Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en el agua, lo cual constituye un

problema para la digestión, ya que los sustratos no son fácilmente accesibles a las
enzimas digestivas de la fase acuosa. Además, si los lípidos ingeridos se hidrolizan en
constituyentes más simples, estos tienden a agregarse en complejos mayores, lo cual
dificulta su absorción. Estos problemas se pueden superar mediante el aumento del
área lipídica y por solubilización de los productos de hidrólisis con detergentes.

La digestión de las grasas, en el organismo ocurre por acción de las lipasas, las
cuales requieren de un agente solubilizante, las sales biliares y de una proteína la
colipasa que permite la interreacción de la lipasa con los triglicéridos que se
encuentran en la parte interna de la micela.

Fundamento.

102
 La digestión de los Triglicéridos da como resultado:  - monoglicéridos,
diglicéridos y ácidos grasos, éstos últimos pueden ser determinados por titulación con
hidróxido de sodio.

Procedimiento.

a) Colocar en 2 Beakers 10 ml de leche y 1 ml de extracto de lipasa (solución de

pancreatina), en cada uno de ellos.
b) A uno de ellos se le añade 1 ml de agua y al otro 1 ml de bilis. Mezclar
rápidamente.
c) De cada beaker se toma 2 ml. y se colocan en 2 beakers respectivamente y se
añaden dos gotas de fenoltaleina y se titula con NaOH 0.01 N hasta la aparición
de una coloración rosada débil.
d) Anotar los ml. gastados y hacer los cálculos.
e) La mezcla que quedó después de retirar los 2 ml. se incuba en baño maría a 37
ºC por una hora.
f) Transcurrido el tiempo de incubación, tomar nuevamente 2 ml. de cada beaker
de incubación y titularlos del modo antes descrito.
Determinar el Nº de mEq de ácidos grasos provenientes de la digestión de 100 ml.
de leche pura.

ml. de NaOH 0.01 N gastados meq. de Ac. grasos / 100 ml

de leche pura
Leche + agua Leche + bilis Leche + agua Leche + bilis
Muestra Basal
Muestra Incubada

Digestión de la ovoalbúmina.

Pepsina y tripsina son enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos, que se

encuentran en el interior de la molécula de proteína. Pepsina hidroliza enlaces
peptídicos en los cuales participan los aminoácidos aromáticos y leucina y que
aportan el grupo amino para formar el enlace peptídico. Tripsina hidroliza los
enlaces peptídicos en los cuales el grupo carboxilo es aportado por la arginina o lisina.

El sustrato utilizado para estudiar estas dos enzimas es la ovoalbúmina, proteína

globular presente en la clara del huevo.

103
Parte experimental.

a) Tomar 4 tubos de ensayo y medir en cada uno de ellos 5 ml de albúmina de

huevo.
b) Incubar en baño de agua a 37 ºC durante 5 minutos.
c) Después de este periodo de incubación añadir los siguientes reactivos, como se
indica a continuación:

Tubo Nº 1 2 3 4
Tripsina 0.5 ml. 0.5 ml. ------- -------
Pepsina ------- ------- 0.5 ml. 0.5 ml.
Buffer fosfato pH 8.6 ------- 3.0 ml. 3.0 ml. -------

HCl 0.1 N 4.5 ml. ------- ------- 4.5 ml.

Agua destilada ------- 1.5 ml. 1.5 ml. -------

d) Mezclar bien; continuar la incubación a 37 ºC

e) Observar cada 10 minutos la turbidez o aclaramiento de cada tubo. Incubar
por 20 minutos.

Tubos 1 2 3 4
10 min.

20 min.
30 min.

INTERROGANTES.

1. Explique por qué los diferentes tubos toman esas coloraciones, tanto en el
experimento del lugol como en el de Benedict.
______________________________________________________________________
________________________________________________________________
______________________________________________________________________
____________________________________________________________
_______________________________________________________________

104
2. Qué color dan con el yodo, las estructuras del almidón? Qué ocurriría, si se
calienta la muestra coloreada en baño maría hirviente?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________
___________________________________________________________________

3. Qué enzimas se encargan de romper los enlaces  1 – 6 ?

______________________________________________________________________
____________________________________________________________

4. Donde se completa la digestión de los oligómeros residuales, luego de la acción de

las  amilasas? Qué enzimas participan?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
__________________________________________________________
___________________________________________________________________
5. Qué es un azúcar reductor?
______________________________________________________________________
____________________________________________________________
___________________________________________________________________
6. En que consiste la intolerancia a la lactosa? Por qué se presentan sus síntomas?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

7. Cuál es el rol de las sales biliares en la digestión de los triglicéridos?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
__________________________________________________________

8. Cómo explica los resultados del experimento de digestión de los triglicéridos de la

leche?

105
 ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________

9. Cómo explica los resultados del experimento de digestión de la ovoalbúmina?

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________________________________________________

10. Además de pepsina y tripsina, qué otras enzimas participan en la digestión de las
proteínas? Cuáles son sus sustratos?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________

Apellidos y Nombres: ___________________________________________

Fecha: ________________________ Firma: ________________________

106
 BIBLIOGRAFIA

1. Campbell M.K. Bioquímica 3° Ed. Universitaria Sao Paulo-Brasil 2001

2. Fitzpatrick D. Biochemistry. Lab Manual. Universidad de Manitoba. 1991
3. Guía de Prácticas de Bioquímica. Universidad Nacional de Trujillo. 1965
4. Gutierrez Correa, J. Guía de Practicas de Bioquímica UNSA. 1969

107
5. Manual de Laboratorio de Bioquímica Médica. Escuela Superior de Medicina-IPN.
México DF. 2013.
6. Nelson D y Cox M. Principles in Biochemistry of Lehninger. IV Ed. Amazon 2004
7. Noriega P., Paz., Bernal O., Zegarra F., Muriel O. y Paz I. Practicas del Curso de
Bioquímica Médica I. UCSM, 2005
8. Paz., Noriega P., Bernal O., Zegarra F., Muriel O. Practicas del Curso de
Bioquímica Médica II. UCSM, 2005
9. Paz B., Zegarra F., Juárez R., Cárdenas L. y Paz I. Guía de Prácticas para
Agronomía UNSA. 2000.
10. Prácticas de Laboratorio. Curso de Bioquímica. Universidad de Chile. 1976

108
 INDICE

Pág.

PRESENTACION 1

PRACTICA Nº 1: El Trabajo de Laboratorio-Bioseguridad 3

Material de Laboratorio Utilización y Manejo

109
PRACTICA Nº 2: Soluciones (Cálculos y Preparación) 15

PRACTICA Nº 3: pH y Amortiguadores 25

PRACTICA Nº 4: Taller- Laboratorio de Bioquímica Clínica 37

Formas de Expresar Los Constituyentes Químicos Del Organismo Humano

PRACTICA Nº 5: Espectrofotometría 45

PRACTICA N° 6: Química de Carbohidratos 55

PRACTICA Nº 7: Química de Lípidos 63

PRACTICA Nº 8: Proteínas I 71

PRACTICA Nº 9: Proteínas II 79

PRACTICA Nº 10: Extracción de ADN e Identificación de sus Componentes 89

PRACTICA Nº 11: Enzimas I 99

PRACTICA Nº 12: Enzimas II (Cinética Enzimática) 107

PRACTICA Nº 13: Vitaminas 115

BIBLIOGRAFIA 121

110