INFORME – PRÁCTICA LIBRE – BIOQUÍMICA 2.

PRODUCCION E IDENTIFICACION DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACION.

PRESENTADO POR:
Fausto Andrés Salazar Rodríguez.
Luis Felipe Mera Grandas.
Rubén Darío Romo.

OBJETIVOS:
Determinar la presencia de piruvato durante la fermentacion de la levadura.
Observar la producción de piruvato mediante una prueba colorimétrica cualitativa.

INTRODUCCION:
La práctica de laboratorio se desarrolló en dos etapas. La primera se caracteriza asociarse a la conversión de
la glucosa en piruvato, en la que se procede utilizando una solución de glucosa y una suspensión de levadura
en dos condiciones diferentes, alcalina y acida. Este procedimiento requirió 1 hora de incubación a una
temperatura de 37ºC. Por otra parte, en la segunda etapa se realizó la detección del piruvato, para la cual se
toman los dos tubos de ensayo con las sustancias utilizadas en la primera etapa y se agrega 2,4-
dinitrofenilhidrazina, una sustancia que permite, por medio de la reaccion expresada en el cambio de la
coloración, detectar la cantidad de piruvato.

Al realizarse la mezcla de las soluciones de glucosa y levadura e medios ligeramente alcalino y acido en los
tubos A y B respectivamente se observó que las soluciones seguían presentando una coloración transparente.
Posteriormente, los tubos fueron incubados durante una hora a 37ºC, con el propósito de proporcionarles un
medio adecuado en el cual se puedan efectuar las reacciones referentes al proceso de glucolisis.
Posteriormente, se realizó la centrifugación del cada tubo y se aisló el sobrenadante, con el cual se realizó la
identificación del piruvato.

El procedimiento llevado a cabo en esta práctica de laboratorio se denomina fermentación. Este

procedimiento se efectúa a partir de la glucolisis que consiste en una serie de reacciones en las cuales se ven
involucrados varios intermedios de reacción. En términos generales, la reacción de la degradación completa
de una molécula de glucosa produce dos moléculas de piruvato, dos moléculas de ATP y dos moléculas de
NADH. Este último es un cofactor muy importante, el cual se encuentra en cantidades catalíticas, y es
necesario someter a un proceso de reoxidación con el propósito de que no se suspenda el proceso. Ademas,
esta sustancia es ampliamente utilizada en la cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria para la
obtención de ATP, lo cual conlleva a la producción de NAD+.

El proceso metabólico de la glucolisis proporciona una cantidad de piruvato, el cual puede tomar dos rutas
metabólicas anaerobias, lo anterior es dependiente del tipo de estructuras celulares que intervengan en el
proceso. En esta caso, durante el desarrollo de esta práctica se emplearon soluciones de levadura en medios
alcalino y acido, respectivamente, a las cuales a causa de la diferencia en el pH del medio, producen
diferencias en la cantidad de productos obtenidos. En este caso se presenta un proceso de fermentación, en
el cual se caracteriza por ser una reaccion de obtención de energía en ausencia de oxígeno en el que el
reactivo inicial es la glucosa y se obtienen como productos una cantidad de piruvato y otra cantidad de etanol
que se deriva de la reaccion del ácido pirúvico reducido a acetaldehído y que finalmente este conlleva a la
producción del alcohol.

La fermentacion alcoholica se caracteriza debido a que el ácido pirúvico formado por medio de la glucolisis
se convierte de manera anaerobia en etanol. En este proceso se libera dióxido de carbono y se oxida el
NADH a través de la reducción del acetaldehído. Por otra parte, la fermentacion láctica es un proceso, al cual
recurren células como las musculares, las cuales presentan deficiencia en la obtención de oxígeno. Otros
tipos de células como los glóbulos rojos, también recurren a la obtención de energía por este medio ya que
no poseen mitocondrias que realicen el proceso de respiración y la obtención de oxígeno. En esta reaccion el
NADH se oxida y el ácido pirúvico se reduce transformándose en ácido láctico.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Tubos de ensayo (4).
Tubos de centrifuga (2).
Beaker de 400 mL.
Pipetas de 5 mL (3).
Balanza.
Plancha de Calentamiento.
Pinzas para tubo de ensayo (2).
Termómetro.
Espátula.

Solución de glucosa 10%.

Enzima levadura.
Fosfato de sodio bibásico 0,5M (Medio alcalino).
Fosfato de potasio monobásico 0,5M (Medio ácido).
Ácido trifluoroacético 10%.
2,4–dinitrofenilhidrazina saturada en HCl 2,0M.
NaOH 10%.

METODOLOGIA:
En dos tubos de ensayo A y B añada respectivamente 5,0mL de solución de glucosa al 10%. Al tubo A
agregue 5,0mL de suspensión de levadura al 10% P/V en solución de fosfato de sodio bibásico 0,5M. Por
otra parte, al tubo B agregue 5,0 mL de suspensión de levadura al 10% P/V en solución de fosfato de potasio
monobásico 0,5M. Coloque en baño maría a 37ºC durante 1 hora, luego agregue a cada uno de los tubos 1,0
mL de ácido trifluoroacético al 10% P/V, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500
rpm. Reserve el sobrenadante de cada uno de los tubos por separado. A 2,0mL del sobrenadante de cada uno
de los tubos agregue 1,0mL de solución saturada de 2,4–dinitrofenilhidrazina saturada en HCl 2,0M. Mezcle
vigorosamente y agregue 1,0mL de NaOH al 10%. La formación de un color anaranjado indica la presencia
de piruvato.

RESULTADOS Y DISCUSION:
Una vez desarrollado el procedimiento llevado a cabo en el laboratorio se observa que la mayor cantidad de
piruvato se encuentra en el A, es decir en el que se lleva cabo el procedimiento en medio alcalino. Este
resultado es coherente con lo reportado en la literatura. De acuerdo a lo anterior, el hecho de que en el tubo A
con un medio alcalino se encuentre una mayor cantidad de piruvato se debe a que bajo estas condiciones la
enzima piruvato descarboxilasa, la cual bajo condiciones óptimas esta enzima homotetramérica cataliza en el
citoplasma la descarboxilación del ácido pirúvico a acetaldehído y dióxido de carbono.

Por lo tanto, debido a que esta enzima se encuentra inactiva en medio ligeramente alcalino, la cantidad de
piruvato en el medio se ve incrementada en comparación a la cantidad del tubo B, donde se el procedimiento
se llevó a cabo en medio acido. Lo anterior, se observó experimentalmente considerando la turbidez de la
solución al momento de realizar la identificación cualitativa del piruvato. De esta manera, de acuerdo al
procedimiento en el tubo A se observó una mayor turbidez de la solución en comparación con el tubo B, lo
cual indica que en el tubo A presenta un mayor contenido de piruvato en comparación con el tubo B.

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, una vez completado el proceso de centrifugación, se tomaron los
extractos de cada uno de los tubos y seguidamente se agregó 1,0mL de 2,4–dinitrofenilhidrazina y se mezcló
vigorosamente. Posteriormente, se añadió a cada tubo 1,0 mL de hidróxido de sodio y se observó la
formación de una coloración naranja en cada uno de los tubos seguida de una turbidez y una precipitación, la
cual se dio después de 15 minutos de reposo. De esta manera, en el tubo A, en el cual se encontraba la
levadura en medio alcalino, se precipitó una mayor cantidad de piruvato, la cual se evidencio por medio de
una coloración anaranjada y turbidez intensas. Por otra parte, en el tubo B, en el cual se encontraba la
levadura en medio acido, se precipitó una menor cantidad de piruvato, la cual se evidencio por medio de una
coloración anaranjada y turbidez mucho menor intensa en comparación a lo observado en el tubo A.
 Ademas, cabe mencionar que en procedimiento desarrollado en el laboratorio está claro que la identificación
de la acumulación de piruvato se realiza por medio de una prueba colorimétrica cualitativa. Por otra parte, las
observaciones realizadas anteriormente, se justifican teniendo en cuenta que la demostración de la existencia
de intermedios metabólicos de vital importancia como el piruvato, los cuales se encuentran presentes en
bajas concentraciones, se realiza por medio del bloqueo y evitando que estos metabolitos de interés
metabólico sean transformados en otros compuestos.

Este procedimiento, en términos generales se realiza por medio del bloqueo de la enzima que cataliza la
conversión del compuesto de interés por medio de inhibidores o modificando las condiciones fisiológicas del
medio de reacción, tales como el pH y la temperatura, de tal manera que se produzca una disminución en la
velocidad con la cual actúa la enzima y por lo tanto provocando una disminución en su actividad enzimática.
Otra alternativa, viene dada por medio del empleo de algún agente o especie química, el cual que atrape al
intermedio de interés y lo transforme en un compuesto que no pueda metabolizarse. De esta manera, se tiene
que la enzima piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, como en el caso de la
levadura que se encontraba en el tubo A, por lo tanto el piruvato producto de la glucolisis se acumula y su
presencia se demuestra por la reaccion con la 2,4–dinitrofenilhidrazina.

CONCLUSIONES:
Se realizó la obtención y la identificación colorimétrica cualitativa para el piruvato, producto de la glucolisis.
La determinación de la presencia de piruvato se realizó por medio de la prueba con la 2,4–
dinitrofenilhidrazina a través de una tonalidad anaranjada seguida de una turbidez de la solución. El
procedimiento desarrollado en el laboratorio se fundamenta en el hecho de que la piruvato descarboxilasa no
es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula, lo cual conlleva a que
su presencia se puede demostrar colorimétricamente, lo anterior se debe a que normalmente el piruvato se
encuentra en muy bajas concentraciones, por lo cual se recomienda recurrir a este tipo de técnicas para
comprobar su presencia.

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es la función de la 2,4–dinitrofenilhidrazina en el proceso de identificación del piruvato?

SOLUCION:
Los metabolitos de piruvato y acetaldehído se encuentran presentes normalmente en muy bajas
concentraciones, por tanto para demostrar su existencia como intermediario en el camino metabólico, es
necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este proceso se usa mucho cuando se
investigan caminos metabólicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto
que se está investigando mediante inhibidores. La pirúvico – descarboxilasa no es activa en soluciones
ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por medio de
una reacción colorimétrica con 2,4–dinitrofenilhidrazina.

2. ¿Qué función desempeña el NAD+ en la producción de piruvato?

SOLUCION:
La enzima Glicerol–3–fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8) cataliza la reacción de oxidación del glicerol–3–
fosfato a dihidroxiacetona fosfato utilizando NAD+ como aceptor de electrones. Esta enzima también
cataliza las reacciones de oxidación y reducción. Durante la glucólisis se genera NADH en el citosol en la
oxidación del gliceraldehído–3–fosfato y se debe regenerar más NAD+ para que la glicólisis continúe. El
NADH no puede pasar a la mitocondria para ser oxidado por la cadena respiratoria ya que la membrana
interior mitocondrial es impermeable al NADH y NAD+. La solución es que los electrones del NADH, en
vez del propio NADH, sean transportados a través de esta membrana. Una de las maneras de introducir
electrones del NADH en la cadena respiratoria es la lanzadera del glicerol–3–fosfato. El primer paso es
transferir un par de electrones desde el NADH a la dihidroxiacetona fosfato, un intermedio glicolítico, para
formar glicerol–3–fosfato. Esta reacción es catalizada por la glicerol–3–fosfato deshidrogenasa en el citosol.
El glicerol–3–fosfato es reoxidado a dihidroxiacetona fosfato en la superficie exterior de la membrana
interior mitocondrial por una isoenzima de la glicerol–3–fosfato deshidrogenasa unida a la membrana. Un
 par de electrones se transfiere desde el glicerol–3–fosfato al grupo prostético FAD de la enzima para
producir FADH2. Esta reacción regenera la dihidroxiacetona fosfato.

3. ¿Qué es metabolismo, catabolismo y anabolismo?

SOLUCION:
Metabolismo: Es el conjunto de reacciones bioquímicas y procesos fisicoquímicos que ocurren en una célula
y en el organismo y permiten las diversas actividades de las células: Crecer, Reproducirse, Mantener sus
estructuras y responder a estímulos, entre otras actividades.
Catabolismo: Es la parte del proceso metabólico que consiste en la transformación de biomoléculas
complejas en moléculas sencillas y en el almacenamiento adecuado de la energía química desprendida en
forma de enlaces de alta energía en moléculas de adenosín trifosfato.
Anabolismo: Es una de las dos partes en que suele dividirse el metabolismo, encargada de la síntesis de
moléculas orgánicas (biomoléculas) más complejas a partir de otras más sencillas, orgánicas o inorgánicas,
con requerimiento de energía (Reacciones endergónicas) y de poder reductor, al contrario que el
catabolismo.

4. ¿Cuál es el fundamento para la identificación de intermedios metabólicos como el piruvato y el

acetaldehído?

SOLUCION:
Los intermediarios metabólicos son metabolitos como el piruvato y acetaldehído se encuentran presentes
normalmente en muy baja concentración. Por lo tanto, para demostrar su existencia como intermediarios en
el camino metabólico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este procedimiento
se usa mucho para estudiar caminos metabólicos y se puede realizar por las siguientes estrategias.

Bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se está investigando mediante
inhibidores. También se puede cambiando las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una
velocidad muy por debajo de su actividad máxima. Usando un agente que atrape al intermedio y que forme
un compuesto que no pueda metabolizarse. En el caso de la práctica llevada a cabo, la piruvato
descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su
presencia puede demostrarse por la reacción con la 2,4–dinitrofenilhidrazina.

BIBLIOGRAFIA:
Lehninger. Principios de Bioquímica. 4ª Ed. Nelson D. y Cox, M. Editorial Omega (2005) 1 vol.
Bioquímica. 3ª Ed. McKee y McKee. McGraw-Hill Interamericana (2003). 1 vol.
Bioquímica. 3ª Ed. Mathews, van Holde y Ahrem. Pearson Education (2002) 1 vol.
Bioquímica. 5ª Ed. Stryer, Berg y Tymoczko. Ed. Reverté (2002). 1 vol.
Bioquímica. 4ª Ed. Devlin. T. Ed. Reverté. (2004). 1 vol.