Fermentación.

Todos sabemos algo sobre la fermentación.

Es un proceso utilizado innumerables veces al día para hacer una variedad de productos
lácteos,
productos horneados y bebidas. A veces pensamos que es dejar alimentos
se pongan malos, pero de forma controlada. Con un poco de ayuda, la leche se convierte
en yogurt
el pan se eleva y los granos se descomponen, creando bebidas alcohólicas
y combustibles alternativos.
Pero mirar estos ejemplos solo nos da una pista de lo que realmente está sucediendo y
cómo podemos usar el poder de la fermentación para crear de manera económica una
amplia gama de productos biológicos
Entonces, ¿qué es la fermentación?
Una célula puede considerarse una micro fábrica. Estas células pueden ser bacterias,
hongos o células específicas
de mamíferos, plantas o insectos. En Biotecnología, estas células se usan para fabricar
un producto en un proceso llamado fermentación
Para yogurt, suero de leche y queso, usamos bacterias.
Para hacer panes y bebidas alcohólicas usamos levadura, ¡un hongo!
Y la producción de algunas vacunas requiere el crecimiento de células de mamíferos
infectadas
con un virus específico.
El producto que las células fabrican es generalmente un químico que las células
contienen naturalmente
o una sustancia que las células han sido genéticamente alteradas para crear,
o incluso un producto de desecho metabólico del crecimiento del organismo, como uno de
nuestros ejemplos, ¡el alcohol!
Hay demasiados productos cotidianos creados por fermentación a escala comercial para
igualar la lista,
pero algunos más comunes incluyen: aminoácidos, productos biofarmacéuticos, tintes,
enzimas, productos alimenticios,
lípidos, esteroides y vitaminas.
La fermentación es un proceso razonablemente simple. Una celda se selecciona en
función de su capacidad para
producir el producto deseado Un stock de semillas de células se pone en pequeña
cantidad de medios. Los medios proporcionan los productos nutricionales que la célula
necesita para crecer.
Cuando la población de células ha crecido y ha consumido la mayoría de los nutrientes,
se mueve
a un recipiente más grande con más medios de crecimiento, y el proceso se repite
Esta "ampliación" se completa cuando la cantidad de células es grande y lo
suficientemente saludable para transferir
en un recipiente de producción, a menudo denominado biorreactor o fermentador.
Con una gran cantidad de medios frescos ahora disponibles y en condiciones
estrictamente controladas, la
células crecen y fabrican productos. Cuando la fermentación está completa, el producto
es cosechado.
La fermentación se conoce como un proceso de biotecnología "río arriba". Se produce al
principio del
flujo de producción, antes de la recuperación, purificación, formulación, llenado y
envasado.
Para comprender mejor el proceso de fermentación, primero debemos averiguar un poco
sobre
las células que usamos y qué pueden requerir para reproducirse y mantenerse
saludables.
Diferentes células tienen diferentes necesidades. Algunos son aeróbicos, necesitan
oxígeno, mientras que otros
son anaeróbicos y no requieren oxígeno.
Todas las células requieren nutrición. Un medio formulado adecuadamente contiene los
nutrientes necesarios
para permitir que las células crezcan y produzcan. El fermentador mezcla las células de
manera uniforme en todo
el medio para suspender las células y suministrar el oxígeno necesario para el
crecimiento.
La fermentación eficaz y eficiente requiere una supervisión y un control rigurosos del
medio ambiente
dentro del biorreactor. Los factores clave incluyen temperatura, presión,
el pH, que es una medida de qué tan ácidos o alcalinos son los medios, el oxígeno,
generalmente medido como
oxígeno disuelto en los medios y los niveles de nutrientes.
Aunque el entorno y los medios se adaptan a las necesidades de células específicas, el
ciclo de vida de casi todos los lotes sigue un patrón predecible.
El patrón de crecimiento tiene cuatro fases: Lag, Exponencial o Log, Estacionario y
Muerte.
Cuando una célula se presenta por primera vez a medios nuevos, debe adaptarse a su
nuevo entorno.
Esto crea una pausa o retraso en la línea de tiempo de crecimiento. Después de que el
organismo se adapta,
despega! Las células comienzan a dividirse a una velocidad constante: un exponencial o
logarítmico (o "Log")
incrementar; doblando, luego doblando de nuevo, y así sucesivamente
A medida que se consumen los nutrientes en los medios, se acumulan productos tóxicos
de desecho metabólico, las células
comienzan a morir y el crecimiento se ralentiza. Cuando llega al punto en el que tantas
células mueren como se están dividiendo, el lote ingresa a la fase estacionaria.
Este es el punto en el que los nutrientes clave se consumen por completo, la fermentación
se detiene y el caldo fermentado se cosecha. Si se permitió que la fermentación
continuara,
las células entrarían en la fase de Muerte. Más células mueren que se dividen, y - similar
a
la fase exponencial - la tasa de mortalidad aumenta logarítmicamente.
Ahora que tenemos una comprensión básica de cómo funciona la fermentación, veamos
un
proceso real y veamos cómo funciona todo.
Para nuestro proceso de muestra veremos la producción de Proteína Fluorescente Verde,
o
GFP. GFP se usa ampliamente como un marcador biológico.
Es un tinte fluorescente que es muy bien tolerado por la mayoría de las células y no
interfiere con la
función celular normal
En el proceso de fermentación de GFP, necesitaremos agregar un antibiótico para
proteger la pureza
del lote, y luego, al final del proceso, un inductor bioquímico para "activar" el gen de GFP.
Nuestros materiales para este proceso incluirán:
Una reserva de semillas de bacterias, en este caso E. coli, que se ha mejorado
genéticamente mejorada para producir
GFP... los ingredientes básicos para un medio compatible
que incluye nutrientes, estabilizantes, un antibiótico y un agente antiespumante ...
e IPTG que es el inductor bioquímico que "activa" el gen GFP.
El equipo que vamos a utilizar incluye un biorreactor de 300 litros,
un espectrofotómetro UV / Vis para controlar la densidad óptica, que es una medida de
la concentración de células en el biorreactor, un analizador de glucosa, para medir la
glucosa,
un nutriente clave, un medidor de pH fuera de línea para ayudar a rastrear el equilibrio
ácido / base
y ajustar las mediciones en línea, si es necesario ...
y un tanque de caldo para nuestro producto final.
El biorreactor está equipado con una camisa de agua alrededor del recipiente para regular
la temperatura,
y sensores integrados para monitorear factores ambientales clave, incluyendo oxígeno
disuelto, pH,
la temperatura interna, la temperatura de la camisa de agua y la presión del recipiente.
El reactor también tiene un agitador, puertos dedicados para agregar material de siembra
e ingredientes de medios,
puertos separados para el suplemento ácido y base, filtros de aire para suministro y
escape, y válvulas
para extraer muestras y para cosechar. La mayoría de las funciones de fermentación y
monitoreo
se pueden administrar desde el controlador de proceso dedicado del biorreactor.
Antes de que el proceso de fermentación pueda comenzar, el área debe estar preparada.
La preparación incluye la eliminación de equipos y materiales que no se usarán en el
proceso ...
Limpiar y desinfectar el área y el equipo ... y esterilizar el equipo según lo requieren los
SOP: Procedimientos operativos estándar. La esterilización se usa para eliminar los
microorganismos
no deseados que pueden crecer de forma natural en los medios de fermentación y los
equipos de proceso.
Además, todos los materiales requeridos y la documentación deben ser reunidos y
preparados
y todo el software de Control de procesos debe cargarse y verificarse.
El proceso por lotes de fermentación se guiará y documentará con BPR - Resgistro del
proceso por lotes
El Registro de lotes lleva al operador a través del
proceso, paso a paso, con cada paso que requiere un inicio de sesión y verificación por
separado.
Este registro también incluye espacios para documentar
tiempos clave, actividades y lecturas de instrumentos.
El proceso de fermentación de GFP realmente comienza con la expansión de nuestro
stock de semillas de bacterias.
Después de quitar el E-coli especialmente modificado del congelador y descongelarlo.
Se usa para inocular una pequeña cantidad de medio fresco en un matraz vibratorio.
Después de que la cantidad de células ha alcanzado la cantidad objetivo, las células
prósperas están listas
para la fermentación. Mientras tanto, en el área de fermentación, los operadores
comienzan con una verificación completa de todos los equipos críticos.
Se verifican las válvulas, los tapones y las líneas, se ajustan las mangueras.
as sondas son verificadas y calibradas y 10 kilogramos de HPW - Agua de alta pureza
- se agrega al recipiente.
El biorreactor se lleva a presión de proceso normal y se mantiene allí para verificar
si hay fugas. La presión se controla durante un periodo de 30 minutos.
Si se detecta una fuga, el problema se corrige
y la prueba se ejecuta nuevamente. Una vez que el reactor pasa la prueba, estamos listos
para mezclar los medios en el recipiente. El agitador está encendido, y los ingredientes
se agregan: Extracto de levadura,
Caldo de soja tríptico, Cloruro de amonio,
Bifosfato de sodio, Fosfato de monopotasio
y un compuesto Antiespumante.
Una vez que todos los ingredientes iniciales están en su lugar, se agregan otros 10
kilogramos de agua de alta pureza
y todos los puertos y válvulas se cierran; todas las válvulas de condensado se abren
y el biorreactor comienza un ciclo SIP - Esterilizar en el lugar.
El objetivo para la esterilización es 121 grados Celsius durante 30 minutos.
Tan pronto como la temperatura sube a la temperatura deseada, las válvulas de
condensación están cerradas,
y el ciclo SIP se completa automáticamente.
Tanto el recipiente como los medios son ahora estériles,
y estamos listos para agregar los ingredientes finales a nuestros medios.
La manguera de glucosa está conectada al recipiente, la conexión se cuece al vapor para
esterilizarla
y la solución de glucosa-antibiótico esterilizada por separado se bombea al recipiente.
Luego se toma una lectura manual del pH del medio y el biorreactor se configura para su
ciclo de fermentación.
Después de que la manguera de inoculación está conectada
al reactor y se cuece al vapor durante 20 minutos
el material de siembra expandido se bombea al reactor que contiene los medios.
La fermentación ahora comienza. El operador toma lecturas de cero horas y comienza a
monitorear regularmente la temperatura del lote, RPM del agitador, niveles de oxígeno
disuelto, pH, presión del recipiente,
la densidad óptica, el índice de flujo de aire y las concentraciones de glucosa.
Las densidades ópticas y las concentraciones de glucosa son de particular interés, por lo
que se grafican
y documentan. Cuando se alcanzan los niveles objetivo de glucosa y densidad óptica
es hora de agregar IPTG al vaso para activar
la expresión de la proteína verde fluorescente en las células.
Después de dejar suficiente tiempo para que las células produzcan proteína fluorescente
verde por lo general
5 horas más tarde, se toman las lecturas finales y se toma una muestra para verificar el
porcentaje
de sólidos celulares.
El producto ahora se conoce como "caldo". El caldo, que contiene los mediosy las celulas
gastadas,
se completa cuando el nutriente clave, la glucosa, se consume en su mayoría, y el lote
ha alcanzado la concentración deseada.
El lote se enfría y se bombea a un tanque de caldo,
y se etiqueta con el número de lote, el volumen, la hora y la fecha.
¡El proceso de fermentación está completo!
El caldo cosechado ahora se moverá aguas abajo al proceso de recuperación donde las
células
se romperán para liberar la proteína verde fluorescente
y la proteína se separará de los otros componentes del caldo.