Informe #3 Taller de Proyecto "Biotecnologa"

Diseo de microorganismos luminosos mediante

herramientas de biologa sinttica

Integrantes:

Sebastin Correa
Daniela Lasso
Josu Simanca
Catalina Vicencio

Grupo nmero:

Ayudante:

Jean Franco Castro

Docentes:

Juan A. Asenjo
Barbara Andrews
Junio, ao 2015

Resumen
Uno de los grandes problemas a nivel mundial, es la contaminacin del agua potable con metales
pesados. Uno de los ms peligrosos en pequeas cantidades es el Plomo.
Se plantea como solucin la creacin de un kit prctico que detecte la presencia y cantidad de este
metal en alguna muestra de agua que se desee analizar, para as determinar su riesgo de consumo y
prevenir futuros incidentes; la funcionalidad del kit se basa en la presencia de un biosensor
bacteriano que emite seales lumnicas en presencia del Plomo.
La distribucin y venta de este kit, ser principalmente a las empresas que otorgan el agua a las
comunidades y/o alguna institucin o empresa de ventas que desee ofrecer el producto.
Finalmente se concluye con que el proyecto posee mltiples beneficios por sobre los mtodos
actuales en la deteccin del plomo, y que concede tanto a productores como a compradores (y al la
sociedad en general), provechos en mbitos econmicos, prcticos y para beneficio de la salud.

Introduccin
Ante la problemtica de los niveles de plomo en el agua, metal muy txico en pequeas cantidades,
se ha propuesto la produccin de un kit que permita detectar los niveles de este nocivo metal. Las
acciones txicas del plomo se atribuyen a su afinidad por los sitios de accin molecular del calcio,
como la adhesin que tiene a los huesos. Podemos encontrar este metal en el agua potable, muchas
veces debido a las tuberas que se utilizan para la llegada del agua a nuestras casas.
La epidemiologa de los casos de intoxicacin por niveles de plomo (recordar que los de intoxicacin
por niveles en el agua potable es solo una de las fuentes que conlleva a una acumulacin de plomo en
el cuerpo y posterior intoxicacin) muestra numerosos casos al ao, principalmente afectando a los
nios. Se estima que a causa de la exposicin al plomo, hay 600.000 nuevos casos de discapacidad
intelectual en los nios, esto debido a que el plomo puede afectar gran parte del sistema nervioso, y
los menores son ms vulnerables a estos daos. Se estima que alrededor de 143.000 personas mueren
al ao debido a la exposicin al plomo, registrndose las tasas de mortalidad ms altas en las regiones
en desarrollo. La mitad de los casos de mortalidad se atribuyen a Asia Sudoriental, en tanto las
regiones del Pacfico Occidental y Mediterrnea Oriental poseen una quinta parte de los casos, segn
datos de la OMS. i
No existe un nivel de exposicin al plomo que pueda considerarse seguro, pero la intoxicacin por
este metal es totalmente prevenible, lo cual se intentar con nuestro kit, prevenir que la comulacin
de plomo en el cuerpo sea mayor. Se ha confirmado que cuanto mayor es el nivel de exposicin a este
metal, mayor es la diversidad, gravedad de los sntomas y efectos secundarios asociados al plomo.
Incluso concentraciones en la sangre que no superan 5 ug/dl (nivel hasta hace poco considerado
seguro) puede entraar una disminucin de la inteligencia del nio, as como problemas de
comportamiento y dificultades de aprendizaje.
La creacin de un biosensor que permita analizar los niveles de agua es imprescindible para este kit.
Se necesitan dos componentes para este biosensor, uno que identifique la presencia de plomo y otro
que de la seal de la presencia. Para la emisin de la seal se extraer el gen de la bacteria Vibrio
fischery, especficamente los operones lux, que sintetizarn componentes necesarios para una
emisin de luz en presencia del metal. Como el mecanismo de expresin de los operones lux es a
travs del mecanismo de Quorum Sensing (a mayor cantidad de plomo, mayor es la seal emitida),
nos permitir medir los niveles del metal ii. Para poder identificar la presencia del plomo se extraer
de la bacteria Ralstonia metallidurans los operones pbr (ubicados en el plsmido pMOL30 de la
bacteria), que se encargan de la produccin de sustancias capaces de autorregular la expresin de sus
genes y hacerla resistente a concentraciones elevadas de plomo.
Se utilizar la bacteria Escherichia coli DH5, la cual ya posee un plsmido con la resistencia a un
antibitico (vector pBR322). Para insertar en el plsmido deseado, se romper el enlace fosfodister
que mantiene unidas las bases nitrogenadas, utilizando la enzima de restriccin Bam HI, reconocer
el lugar del gen de la tetraciclina, donde se comenzar la insercin de los operones. Primero el gen de
reconocimiento pbr y luego el de la seal lux. Utilizando la tcnica de PCR, se pretende obtener
numerosas copias del vector de inters. La ligacin se realiza por la ligasa ADN T4 y ATP.
Para la insercin del plsmido en las bacterias se utilizar el mtodo de transformacin mediada por
Ca2+ . Para cultivar las bacterias genticamente modificadas se aislarn en agar, donde solamente las

bacterias con el plsmido que contiene el gen que expresa la resistencia a ese antibitico sobrevivirn
y proliferarn.
Este kit requiere de un luxmetro, para que pueda entregar los datos numricos de los niveles de
plomo de una muestra de agua. Contar con placas de petri portadores de un cultivo de E.coli
modificadas que contengan el plsmido creado y expresen la bioluminiscencia en presencia de plomo.
Adems contar con pipetas que servirn para obtener muestras de agua que deseen ser analizadas.
Por ltimo, este kit incorpora un manual del usuario indicando paso por paso el uso del kit.

Deteccin de Plomo en la Actualidad y

Beneficios del Proyecto
La determinacin de las concentraciones de plomo en agua con mtodos actuales suele ser difcil y
costosa debido a sus bajas concentraciones en las que se encuentra, por lo que requiere un trabajo
muy minucioso y con maquinaria capacitada para tal accin. Unos de los mtodos actuales que se
utilizan son la espectrometra de la emisin atmica asociada al plasma acoplado inductivamente y
la espectrofotometra en fase slida, esta ltima sin requerir demasiada maquinaria y mejor
sensibilidad a volmenes grandesiii.
Un mtodo que est al alcance de las personas que se sienten en riesgo de consumir agua
contaminada es el anlisis de esta, enviando muestras desde sus hogares a ciertas empresas que se
encargan del anlisis y reenvo de resultados al pasar unos das. El costo promedio de este servicio
vara entre los 80 y 120 dlares aproximadamente.
Se pretende que el producto sea vendido a las empresas que proporcionan el abastecimiento de
agua potable en los hogares o bien a alguna institucin pblica y/o privada que desee contar con
este equipamiento. En primer lugar el kit constar de lo necesario para hacer un solo anlisis y ser
desechable, por lo que cabe recalcar que el luxmetro que se necesita para extraer los datos de la
muestra se vender por separado, as se disminuirn costos del kit y no se desecha el luxmetro
usado una nica vez (no son desechables).
Lo que favorece a este proyecto es que el anlisis no se lleva a un laboratorio, si no que se puede
hacer desde el mismo lugar de donde se extrae la muestra. Es de fcil utilizacin y est destinado a
la manipulacin de cualquier adulto, con los respectivos cuidados que requiere.

Financiamiento y Capital inicial

Este proyecto requiere de un fondo inicial considerable y no tan sencillo de conseguir, sin embargo
con la originalidad, relevancia y beneficios que puede traer este proyecto; se cree que son
suficientes para obtener el capital inicial.
Existen distintas formas de financiar proyectos innovadores emergentes que busquen un fin
beneficioso para la sociedad. De parte de Corfo por ejemplo, existen fondos destinados a
microempresarios emergentes, proyectos emprendedores, innovadores sociales, etc iv. A estos
fondos se puede llegar de manera sencilla postulando con el proyecto a travs de la pgina web de
Corfo.
Otras maneras de comenzar el proyecto, son por ejemplo solicitar un crdito de apoyo emprendedor
al gobierno, obtener un subsidio de alguna empresa contratista que quiera especializarse en la venta

del producto, entre otras maneras que son capaces de cubrir el capital que se requiere para
comenzar el proyecto.
Cabe resaltar que una vez obtenida la maquinaria no es necesario seguir comprando ms, pues la
produccin es factible y puede continuar con estos recursos. Solo es necesario ir reponiendo la
despensa de las materias primas utilizadas en la elaboracin del kit (bacterias, enzimas, soluciones,
etc).

Estudios previos
La conformacin de la empresa dedicada a la produccin del kit para detectar niveles de plomo en
agua requiere de estudios iniciales para poder confirmar ciertos datos a la hora de emprender el
rumbo. Primeramente se iniciara con un estudio que pretendera despejar dudas en el
funcionamiento del biosensor, por ejemplo: saber el rango de concentracin de plomo en el que
puede actuar la bacteria genticamente modificada; a su vez saber cuanta luz(medido en lux)v emite
segn los niveles de plomo a los que se ha expuesto; a cuantas concentraciones de plomo resiste la
nueva bacteria; cual es la vida til de los microorganismos y en qu condiciones se conservan mejor.
Son datos que son necesarios a la hora de configurar el kit. El luxmetro necesario para la
determinacin de la intensidad lumnica debe ser comprado segn el rango de intensidad en el cual
acta el biosensor.
Otro estudio necesario para el emprendimiento de la empresa es un estudio de mercado que nos
pueda presentar la situacin en la sociedad que estara dispuesta a adquirir el producto que se desea
producir. Con este estudio, se puede saber alrededor de la cantidad a producir, cuales sern los
plazos para obtenerlos y en qu sitios, instituciones y/o empresas es conveniente ofrecer el
producto.

Costos
Para la instalacin de la empresa tendremos que tener en cuenta varios costos irrecuperables como
la maquinaria necesaria para la produccin. Se requiere de un termociclador, que se utilizar para el
proceso de PCR. Un shaker, para el cultivo. Cmaras de electroforesis, para la separacin de
protenas y cidos nucleicos. Adems para la correcta proliferacin de las bacterias por un periodo
prolongado de tiempo, se piensa aplicar el mtodo de la liofilizacin a las clulas ya listas vi, por lo
que se requiere de un liofilizador para bacterias. Finalmente un set de micropipetasvii.
Tabla1.- Costos de maquinaria necesaria en un laboratorio.*
Producto
Mecheros (c/u)
Termociclador
Shaker
Cmaras de electroforesis
Tubos Eppendorf 1,5 ml (c/u)
Micropipetas
Liofilizador
TOTAL

Valor CLP (aprox)

90 mil ms iva
2,5 millones ms iva
2,5 millones ms iva
1,25 millones ms iva
11mil iva incluido
400 mil ms iva
1,75 millones ms iva
$8.501.000

*Fuente: Elaboracin Propia

Tambin hay que considerar los costos variables en los que se incurrir en forma peridica, como el
arriendo de un local para la instalacin de la maquinaria y el equipo de trabajar. Asimismo tener en
cuenta las materias primas a utilizar en el proceso, como las enzimas de restriccin, las bacterias y el
medio de cultivo LB para estas.

Tabla2.- Materias primas para creacin y mantencin de cultivo E. coliviii

Producto
Local de trabajo (arriendo)
Enzimas de Restricin (BamHI)
Bacterias (Escherichia Coli)
Medio de Cultivo LB Agar
Ampicilina
Peptona de Caseina
Agar Bacteriolgico
Extracto de Levadura
ClNa

Valor CLP (aprox)

**
$52.000 (2.500 unidades)
$140.000-180.000(5ml)
$195.000 (1Kg)
$1.500 (250 mg)
$50.000 (1 Kg)
$78.000 (1 Kg)
$6.500 (1 Kg)
$1000 (1 Kg)

*Fuente: Elaboracin Propia

**El costo del arriendo del local depende de la preferencia y comodidad que desee el empresario. Sin embargo cabe aclarar que no es
necesario un espacio mayor a 15 mts.

Inicialmente se requerir hacer el plsmido de inters que se querr insertar en el cultivo. Este
consta del plsmido inicial del cual se comenzar el trabajo, es decir de los operones de inters para
la seal y la deteccin. Los operones se extraern de las sepas de bacterias en las que han sido
localizados.
Tabla3.- Precios sepas y plsmidos especficos a utilizar en el proceso de la creacin del
microorganismo.
Producto
Plmido pBR322 (Escherichia Coli DH5 )
Sepa Ralstonia Metallidurans (operones pbr)
Sepa Vibrio Fischery (operones lux)

Valor CPL (aprox)

63 mil (50 g)
300 mil
300 mil

*Fuente: Elaboracin Propia

El producto que se le entregar al comprador es un kit que contiene una placa de petri con la
bacteria genticamente modificada, una pipeta para extraer la muestra de agua, guantes para la
correcta manipulacin de las sustancias, un contenedor oscuro en donde se introduzca la placas de
petri con la muestra y las bacterias en ella para ser analizada correctamente por el luxmetro sin
que se vea influenciado por otras fuentes de luz; y dentro un manual que especifica cada paso a
seguir.
Tabla4.- Elementos que componen el kit a entregar.
Producto
Luxometro (*)
Guantes
Petri desechable
Pipeta desechable

Valor CPL (aprox)

$20.000(**)
$2.990 (50 pares)ix
$233- $333 (por unidad)
$10.193(100 unidades)+envo

Empaque
Contenedor oscuro(de PVC)

$700(por kit)
$1000(cada uno)
Fuente: Elaboracin Propia

(*) El luxmetro ser vendido aparte del kit para no aumentar el valor del producto, pues se pretende que el luxmetro sea reutilizable.
(**) Los precios varan entre los 14 mil y los 30 mil pesos

Preparacin del Cultivo

Para la preparacin del cultivo bacteriano se requiere una cantidad especfica e indispensable de
sustratos, a continuacin se presenta una tabla que los detalla.
Tabla5.- Componentes necesarios para la produccin de bacterias para un Kit x.
Componente
80 g de clula competente Escherichia Coli
1-2 g de plsmido que se desea insertar
10g de Peptona de Caseina
5g ClNa
5g Extracto de Levadura
30 g de agar
100 mg de ampicilina
TOTAL

Precio
$2560
$1260
$500
$5
$33
$2340
$600
$7298

*Fuente: http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-yresultados (26/07/2015)

Preparacin del Kit

Para la preparacin de un kit se requiere una cantidad especfica de elementos, a continuacin se
presenta una tabla que los detalla.
Tabla6.- Productos necesarios para la produccin del kit:
Producto
3 Par de Guantes
3 Capsulas de Petri

Precio
$180
$999

1 Pipeta

$102

Bacterias Generadas
1 Contenedor oscuro

$7298xi
$1000

Empaque

$700

1 Instructivo

$25

TOTAL

$10304
*Fuente: Elaboracin Propia

Precauciones
Es necesario resaltar la importancia de un estudio de los riesgos que puedan traer los
microorganismos y que tan inofensivos son en distintas circunstancias. Se debe tener en
consideracin que son bacterias alteradas genticamente, por ende que su exposicin y liberacin
puede traer fuertes repercusiones ambientales.
Las bacterias, una vez finalizada su funcin deben ser depositadas en cloro para asegurar que no se
efecte una contaminacin al ambiente ni que existan percances con los residuos. Y las cpsulas que
no se ocupen en el momento debern estar conservadas a la temperatura indicada en el producto.
Es importante destacar este tema, pues es necesario obtener el certificado de la Autoridad Sanitaria,
el cual se obtiene en el Departamento de Obras Municipales, y adems pedir la Calificacin Tcnica a
la SEREMI de Saludxii (en caso que el producto sea de venta en el propio pas).
Se sugiere que tanto en el envoltorio y empaque del kit, como dentro las instrucciones se aclaren las
contraindicaciones del producto. Adems tiene que destacar con claridad un telfono de
emergencias que traten los casos referentes a estas bacterias.
Todos las advertencias (obtenidas de los estudios previos) y sus respectivas instrucciones de uso,
sern mencionadas en el instructivo.

Discusin y Conclusiones
El tratamiento y anlisis de aguas en la actualidad es un proceso fundamental y de gran importancia
para la obtencin y un correcto control de la salubridad del agua potable que llega a los hogares de
las personas. Sin embargo el anlisis de metales pesados, como lo es el plomo, el cual en muy bajas
concentraciones ya se cataloga como peligroso, es un proceso de mayor complejidad, donde se
requiere una maquinaria capacitada y en varias ocasiones costosa. Para los hogares que deseen este
anlisis existe una opcin(aclarar que no est presente en todos los sectores) que consta en enviar
una muestra un laboratorio de anlisis y luego de unos das recibir de vuelta los resultados de este.
El costo de este servicio, suele encontrarse entre los 80 y los 120 dlares ($52000 y $78000 pesos
chilenos respectivamente).
El proyecto presente ofrece una alternativa eficiente y prctica para el anlisis del agua en la
identificacin del plomo. Gracias a la especificidad de las bacterias y su emisin proporcional de luz
respecto a las concentraciones de plomo en el agua, es posible identificar las cantidades del metal
incluso en bajas concentraciones. Adems, el kit permitir una manipulacin sencilla para todo
adulto, y de fcil comprensin al momento del anlisis de datos. La rpida accin de las bacterias
ofrecer al usuario obtener en el instante los resultados del estudio sin tener que esperar mucho

tiempo para poder adoptar las medidas necesarias en caso que el agua no se encuentre en
condiciones bebestibles.
Los costos del anlisis para el cliente se vern reducidos drsticamente, pues con el kit a un precio
de $40 dlares ($26.000 CLP aprox.) y un luxmetro que solo es necesario comprarlo una vez en el
caso que se deseen hacer ms estudios, se alcanza una mejor opcin para el comprador ms
econmica. Cabe mencionar que el kit permitir realizar tres anlisis, los cuales beneficiarn de una
manera importante a los usuarios.
El costo de produccin de cada kit es de $10.304 CLP, lo cual lleva al productor de este bien obtener
sobre un 100% de ganancia a la hora venderlo. Pudiendo recuperar (dependiendo del xito de
venta), el capital inicial en el caso que se desee recuperar y no haya sido un beneficio otorgado por
el estado o alguna otra institucin.
El proyecto puede mejorar y ser mejor aprovechado si se realizan ms estudios, tanto para la
compra y venta del producto, como tambin del diseo y cultivo de las bacterias; lo que puede llevar
al productor de este proyecto de innovacin a maximizar an ms sus beneficios. Tambin
favorecer de una manera ms eficiente y accesible , prctica y cmoda, a la sociedad en busca de
una mejor calidad de vida. Por todo lo anterior se considera este proyecto como una alternativa
factible para implementar.

Bibliografa
i

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs379/es/ (01/07/2015)
Mara Jos Gallardo Nelson, 2009, Tsis: BSQUEDA DEL REGULN QUORUM SENSING DE
Acidithiobacillus ferrooxidans MEDIANTE ESTUDIOS PROTEMICOS Y DETERMINACIN DEL
EFECTO DEL FE2+ SOBRE LAS AHLs PRODUCIDAS POR LA BACTERIA
iii http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/com2005/8-Exactas/E-021.pdf (05-07-2015)
iv http://www.corfo.cl/programas-y-concursos/programas/fondo-etapas-tempranas-tecnologicas(12:34 25-072015)
v http://www.scheitler.com.ar/productos/luxometros/LX-9626.aspx (22:05 23-07-15)
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http://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-elm%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-control (20:09 17-07-15)

vii http://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-deelectrocompetentes?language=Spanish
viii http://servetlab.com/archivos/Precios2013.pdf ( 21:35 18-07-15)
vi

ix

http://www.arirangplasticos.cl/index.php?productID=7127

http://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.p
df
xi http://labotienda.com/es/catalogo/plastico_material-desechable_pipetas.aspx
xii

SAG: Instructivo tcnico para Recuento de Escherichia coli Mediante Mtodo Tradicional de Cultivo: AOAC
Official Method 966.24. Cdigo: IT-LAB-17-v02