RADIOINMUNOANALISIS

INTRODUCION

El radioinmunoensayo (o abreviado RIA del inglés Radioimmunoassay) es un tipo de

inmunoensayo o método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de
los complejos antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad
unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos.
Usa isótopos radioactivos, es in vitro, es decir, se extrae la sangre del paciente y es
analizada para ver sustancias.

Es una técnica que nace en los años 60-70, propiciando un gran avance de la
endocrinología. Es una técnica muy sensible, mide pequeñas cantidades de sangre.

Cualquier sustancia del organismo puede ser considerada un antígeno. Los anticuerpos
que se transforman sirven para medir la cantidad de hormonas que hay en el organismo.
La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la
unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Casi todas las moléculas
pueden ser antigénicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa
molécula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar que una molécula
sea antigénica está basada en que un hapteno combinado con un coadyuvante da
respuesta inmune. Un coadyuvante muy usado es la albúmina de suero bovino o BSA,
por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie aparecerán
anticuerpos contra el hapteno.

HISTORIA
La creación del radioinmunoanálisis supuso para la medicina y en especial para la
endocrinología un extraordinario avance. Significó un fuerte empuje a la investigación
de la diabetes, así como al diagnóstico y tratamiento de problemas hormonales
relacionados con el crecimiento, la función tiroidea y la fertilidad. Se utilizó también
para prevenir el retraso mental en los bebés con la glándula tiroides hipoactiva
inmediatamente después del nacimiento. Todo ello se debe en buena medida a la labor
desarrollada por Rosalyn Sussman Yalow y Solomon Berson.

Rosalyn Yalow desarrolló el radioinmunoensayo para analizar moléculas biológicas.

Consiguió una plaza de profesora ayudante en la Escuela de Ingenieros de la
Universidad de Illinois. Se doctoró en Física Nuclear en 1945.
A finales de la década de 1940, los hospitales de veteranos se transformaron en
modernos centros de investigación y docencia. Yalow empezó a trabajar como
consultora en la unidad de radioisótopos del Hospital de Veteranos del Bronx y al cabo
de dos años tenía ya su propio laboratorio trabajando sobre la función tiroidea. Más
tarde, inició una brillante colaboración con Salomon Berson.

Sus trabajos demostraron que pacientes diabéticos tratados con insulina de origen
animal desarrollaban con el tiempo anticuerpos que la bloqueaban e impedían su
función. No tan sólo demostraron por primera vez que una molécula pequeña podía
provocar una respuesta inmunológica, sino que lo hicieron desarrollando una
metodología revolucionaria : la técnica del radioinmunoensayo.
No fue fácil que su trabajo fuera aceptado. A mediados de la década de 1950 se creía
que únicamente las proteínas de gran tamaño podían estimular una respuesta
inmunitaria. Posteriormente, sus observaciones fueron confirmadas por otros científicos
y sus descubrimientos fueron aceptados incluso por los más dogmáticos.

El radioinmunoensayo sedujo rápidamente a la comunidad científica. Permitió el

análisis de compuestos biológicos que antes eran muy difíciles o imposibles de
determina. Proporcionó toda la información que se conoce actualmente sobre la
regulación de la secreción hormonal y las interacciones hormonales.

Aunque las posibilidades comerciales de la técnica eran enormes, Yalow y Berson

nunca quisieron patentar su método. Para ellos patentar era privar a la gente de los
descubrimientos con el fin de ganar dinero. La sencillez y facilidad de la metodología
permitieron su uso extensivo en países subdesarrollados. Hoy en día, el
radioinmunoensayo todavía se utiliza en los ensayos en los que se requiera una gran
sensibilidad.

¿QUE ES? ¿ PARA QUE SE UTILIZA?

Radioinmunoensayo.(ria).

Es un método sensible y especifico para determinar reacciones Ag – Ac, en el cual un

reactante marcado radiactivamente se utiliza directa o indirectamente para la medición
cuantitativa del reactante no marcado, estableciendo una fijación de Ac específico u otro
sistema receptor. Se han utilizado varios isótopos productores de radiaciones gama y
beta. Una proteína u otro material inmunológico pueden ser marcados sin que se pierda
su capacidad de reaccionar inmunológicamente. El isótopo más utilizado es I 125.
La base del RIA consiste en la inhibición competitiva de la unión de un antígeno
radioactivo (Trazador) a su antígeno específico por parte del antígeno no marcado. El
sistema radioinmunológico descrito puede esquematizarse como una reacción reversible
combinada: Donde Ac representa el anticuerpo especifico: Ag* es el antígeno marcado
(Trazador)Libre: Ag es el antígeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las
muestras desconocidas: Ac – Ag* es l complejo soluble entre el anticuerpo marcado, y
Ac – Ag es el complejo soluble con el antígeno no marcado. El proceso obedece a la ley
de acción de masas y además la distribución del trazador dentro del antígeno total es
indiscriminable por medio del anticuerpo de modo que, cuanto mayor sea la cantidad
del antígeno no marcado, menor será la cantidad de trazador que se une al anticuerpo.
Bajo este principio se puede determinar la concentración del antígeno en muestras
complejas de fluidos biológicos de fluidos biológicos con suficiente sensibilidad y
especificidad si se cumplen los siguientes requisitos:1.el trazador es altamente
radioactivo y por lo tanto puede colocarse en concentraciones infinitesimales, pero
cuantificables.2.el anticuerpo es altamente específico, posee muy alta finalidad y se
halla enmuy baja concentración. Las técnicas de radioinmunoensayo se emplean en la
detención de hormonas, drogas, IgE, vitamina B12, etc.

Estos métodos son muy sensibles y específicos, detectan cantidades muy pequeñas del
orden de los picógramos. 10-12 g.
DESVENTAJAS:

La vida media del isótopo es muy corta, por ejemplo el I 125.

Tiene 57 días de vida media.
Costosa y peligrosa
Requiere un equipo especial que es el contador gama para medir la radiación.
Este método requiere siempre la elaboración de una curva estándar para la lectura.

COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA DE ELISA vs RIA (ensayos en vacas)

Introducción
La medición de progesterona plasmática (P4) tiene una aplicación práctica como
método para mejorar la eficiencia reproductiva en la producción animal. Por ejemplo, la
P4 sirve para el diagnóstico de preñez en diferentes especies, confirmar el celo en
vacas, novillas y búfalas, así como monitorear la fertilidad en el ganado (Roa, 1996).
El método más usado ha sido el radioinmunoensayo (RIA). Sin embargo, el RIA tiene
varias limitaciones sobre todo las relacionadas al uso de isótopos radioactivos (Van de
Wiel, 1986). De allí que actualmente se intenta sustituir el uso de radioisótopos con
otros reactivos como son las enzimas (Morrel, 1993).
Asimismo, el principal problema del enzimoinmunoanálisis (ELISA) posiblemente sea
la interferencia de otras hormonas durante el ensayo cuando se desea determinar una
hormona específica, es el llamado “efecto matrix” (Van de Wiel, 1986).
Este efecto puede ser disminuido purificando la hormona de la muestra o aumentando la
sensibilidad reduciendo el volumen de la muestra disminuyendo así este efecto. Con la
finalidad de evaluar el uso de los dos sistemas en nuestro medio, se diseñó un ensayo
donde se procesaron muestras pareadas para ambas técnicas.
Materiales y métodos
Muestreo sanguíneo. El estudio incluyó un total de 56 muestras de plasma sanguíneo de
novillas mestizas Bos índicus x Bos taurus. Se colectaron 8 mL de sangre de los vasos
coccígeos el día del celo (día 0), el día 7,21, 28, 35, 42 y 49 post celo en tubos
vacutainer con EDTA potásica. Inmediatamente se centrifugaron para evitar su
metabolización (Vahdat et al., 1979; Pulido et al., 1991) por 15 minutos a 3000 rpm,
trasegándose el plasma obtenido a viales plásticos identificados para su congelación a -
20 °C, hasta su procesamiento en el laboratorio por la técnica de RIA (Díaz, 1991) y por
la técnica de ELISA (Munro & Stabenfeldt, 1984). Se uniformizaron todos los factores
que pudieron influir en el muestreo, haciéndolo a una misma hora en la mañana (6:30
am) los días del muestreo, manteniendo el mismo patrón de recolección, centrifugación,
congelación y almacenamiento.
Técnica de enzimoinmunoanálisis (ELISA). La cuantificación hormonal se realizó
utilizando kits de ELISA (Munro & Stabenfeldt, 1984, Kubiak, 1986). Se usó un lector
de placas de ELISA Multiskan Plus 1.4, ajustando el espectrofotómetro para leer
absorbancia a 405 nm. Como control de calidad de los Kits se realizaron las pruebas de
validación, para especificidad la prueba de paralelismo y para precisión, el cálculo del
coeficiente 413 Arch. Latinoam. Prod. Anim. 5(Supl. 1): 412-414 (1997) de variación
(CV) intra e interensayo (Silvan et al., 1992; Manzo, 1987). La evaluación realizada al
Kit utilizado señaló que tiene paralelismo. El CV intraensayo calculado fue de 5.77 % y
el CV interensayo fue de 6.50 % valores que están dentro de los rangos óptimos de CV
para ambas pruebas .
Técnica de radioinmunoensayo (RIA). El método de RIA usado fue el descrito por
Manzo (1987). El ensayo y el antisuero usado fue producido en ovejas contra Ñ 4
pregnen-3.20 dione-6 BSA, validado y elaborado por la AIEA y por Manzo (1987).
Análisis estadístico. Los datos fueron analizados por correlación para determinar el
grado de asociación existente entre las diferentes concentraciones de P4 en los
diferentes días de muestreo. El análisis de regresión lineal para verificar el grado de
predicción de las concentraciones de P4 de cada día del ciclo estral en los
diferentes días del muestreo. La prueba de t pareado para verificar significancia entre las
2 técnicas. El análisis de varianza para determinar si existía diferencias significativas de
concentraciones P4 entre las dos técnicas para los diferentes días del muestreo y la
prueba de comparación de medias de Tukey. Los análisis estadísticos fueron realizados
siguiendo los procedimientos descritos por Steel y Torrie (1988).
Resultados y discusión
La confiabilidad de los ensayos usando ambos sistemas fue el siguiente: Sensibilidad
del ensayo, para el caso del RIA fue de 0.175 ng/mL, para el caso del ELISA fue de
0.03 ng/mL. Precisión del ensayo, basado en dos muestras de plasma para cada sistema
(RIA y ELISA), se obtuvieron un coeficiente de variación intra e interensayo de 5.77 %,
6.50 % respectivamente para ELISA y 5.85 %, 8.580 % para RIA.
Los resultados de correlación de ELISA con respecto al RIA fueron significativos (r =
0.933, P < .05) obteniéndose la siguiente ecuación de regresión lineal ELISA = 2.7001
+ 1.2431 RIA.
En general, se observaron los cambios típicos de las concentraciones de P4 de acuerdo
al estado fisiológico del ciclo estral de la hembra el día del muestreo tanto para el
sistema RIA como el ELISA. Estos resultados nos indicaron una alta similitud entre
ambas técnicas, donde si se considera el protocolo de ambos sistemas podemos
decir que el ELISA combina las ventajas de la técnica de inmunoflorescencia y del
radioinmunoensayo por el uso de antígenos y anticuerpos y elimina muchas de las
desventajas de ambos métodos. Los reactivos enzimáticos marcados son menos costosos
de preparar y son altamente estables, lo que proporciona un mayor tiempo de depósito.
Los equipos necesarios para el ELISA son menos costosos y los resultados son
obtenidos con relativa rapidez. El ELISA en este ensayo, tiene una sensibilidad muy
cercana a la del RIA y sus resultados pueden ser determinados visualmente o también
con un equipo simple a diferencia del RIA que utiliza radioisótopos.
Todos los principios básicos empleados en el procedimiento de ELISA son los mismos
usados para el RIA cuantitativo, con la diferencia de que la medición de la actividad de
la enzima en ELISA es por fotocolorimetría, mientras que en RIA es por contaje de
radioactividad.
Asimismo, como el ELISA tiene en el mercado kits comerciales, sus costos son más
bajos en comparación al RIA, ya que posee los requerimientos necesarios (alta
precisión, repetibilidad y sensibilidad) para ser una buena herramienta para medir
esteroides en comparación con los métodos empleados tradicionalmente, ya que
presenta una alta correlación con el RIA (r = 0.933).
Conclusiones y recomendaciones
se recomienda el uso de la técnica de ELISA como otro sistema de determinación
hormonal en ya que es un método rápido y simple que sirve como herramienta para
diagnóstico y tratamiento problemas reproductivos en bovinos a nivel de finca.
 Estudio de autoanticuerpos en el inicio de la diabetes autoinmune en
nuestro medio mediante ELISA
Introducción
Los auto-anticuerpos son marcadores útiles en el inicio de la diabetes mellitus autoinmune,
como apoyo diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue conocer la prevalencia de
autoanticuerpos en el inicio de diabetes en nuestro medio, medidos mediante ELISA y valorar
su papel diagnóstico en diabetes autoinmune.

Material y métodos
Muestra de 111 pacientes con diabetes de inicio: 61 tipo 1 (incluye 12 diabetes autoinmune
latente del adulto [LADA]) y 50 tipo 2. Grupo control 64 no diabéticos. Se analizaron
antidescarboxilasa del ácido glutámico GADA, anti-tirosina fosfatasa de membrana IA-2 y anti-
insulina IAA, mediante enzimoinmunoanálisis ELISA en microplaca. Se realizó estudio
observacional descriptivo para valoración de pruebas diagnósticas. Programa estadístico PASW
Statistics versión 18.

Resultados
GADA(+): 78,7% DM1; 83,3% LADA; 2,0% DM2; 1,6% control. IA-2(+): 52,2% DM1; 45,5%
LADA; 16,4% DM2; 12,5% control. IAA(+): 10,3% DM1; 18% LADA; 6,0% DM2; 1,7%
control. GADA e IA-2 diferenciaron significativamente (p<0,0001) a los pacientes con diabetes
autoinmune. No así IAA. Área bajo curva receiver operating characteristics (ROC):
GADA=0,90 (p<0,0001); IA-2=0,74 (p<0,0001); IAA=0,57 (p=0,126). Criterio límite
GADA(+) > 5,5 U/mL (sensibilidad 79%, especificidad 98%) e IA-2(+) > 6,0 U/mL
(sensibilidad 54%, especificidad 84%). Análisis de factores riesgo asociados: Odds ratio
GADA=51,44 e IA-2=4,64.

Conclusiones
En nuestro estudio, la prevalencia de GADA en el inicio de diabetes es alta y su determinación
eficaz en el diagnóstico de diabetes autoinmune. IA-2 incrementó 4,6 veces la probabilidad
diagnóstica. IAA medidos mediante nuestro test ELISA no han mostrado valor como
marcadores en la diabetes autoinmune, aunque esto no descarta su utilidad en otras patologías.