UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SEGUNDA ESPECIALIDAD EN LABORATORIO CLINICO Y
BIOLÓGICOS

INFORME

TEMA: RADIOINMUNOENSAYO

DOCENTE
Dr. Edgar Romero Espinoza

ALUMNAS

Mblga. Rubi Jackeline Espinola Aguirre

Mblga. Emma Natividad Javes

TRUJILLO – PERU
2015

1
 ÍNDICE

I. Introducción…………………………………………………………………………
.3
II. Antecedentes………………………………………………………………………...
4
III. Concepto y
Definición……………………………………………………………….6
IV. Elemento del
RIA…………………………………………………………………...7
V. Clasificación………………………………………………………………………..1
1
VI. Separación de fases ligadas y no ligadas………..…………………………………
17
VII. Contaje de la Radiactividad………………………………………………………20
VIII. Calculo y interpretación del RIA………………………………………………...21
IX. Características del
RIA…………………………………………………………….23
X. Ventajas…………………………………………………………………………….2
3
XI. Desventajas…………………………………………………………………………
24
XII. Aplicaciones………………………………………………………………………26
XIII. Tipo de Cuadro clínicos………………………………………………………….30
XIV. Reacciones adversas……………………………………………………………...31
XV. Bibliografía…………………………………………………………………….…32
XVI. Anexos …………………………………………………………………………..35

2
 INTRODUCCIÓN

Los Inmunoensayos son pruebas que usa complejos de anticuerpo y antígeno como
medio para generar un resultado perceptible. Un complejo anticuerpo-antígeno también es
conocido como inmunocomplejo.
“Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica que hace que el cuerpo genere
anticuerpos, y “ensayo” se refiere a una prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba
que utiliza inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los antígenos.
Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de laboratorio, como
las pruebas colorimétricas, ya que usan complejos anticuerpo-antígeno para generar una
señal que pueda medirse. En oposición, la mayoría de las pruebas de rutina de química
clínica utilizan reacciones químicas entre el reactivo (solución de sustancias químicas u
otros agentes) y la muestra del paciente para generar un resultado de la prueba.
Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son los que
se basan en la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo.
La propiedad que tienen las inmunoglobulinas de unirse a un antígeno, la
especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por fenómenos de
precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con
radiosótopos o con enzimas) hacen que éstos métodos se utilicen de forma muy amplia.
Aunque el principio es idéntico en todas las técnicas (unión antígeno-anticuerpo)
hoy en día se emplean diversos métodos, basados cada uno de ellos en un procedimiento
distinto para visualizar la unión: uno de ellos es el radioinmunoensayo.
Hasta la introducción del radioinmunoensayo por Yallow al principio de los años
sesenta, la valoración de hormonas sexuales sólo se hacía en orina. Se valoraba la hCG por
3
métodos biológicos y los estrógenos totales y el pregnandiol por métodos químicos. Ello
reducía mucho las posibilidades. Hoy en día esta técnica ha quedado obsoleta y
reemplazada por la técnica enzimainmunoensayo (ELISA). Pero en algunos otros países el
radioinmunoensayo todavía la utilizan para detección y diagnóstico de algunas
enfermedades.

I. ANTECEDENTES

Esta técnica fue desarrollada por Rosalyn Yalow

y Solomon Aarón Berson en 1950; para determinar la
concentración de insulina en el plasma sanguíneo1.
Trabajaron en el Hospital afiliado a la Sinai School of
Medicine Mount Bronx Veterans Administration2.

Posteriormente, en 1968; Miles y Hales

establecieron detección de anticuerpos mediante el
análisis isotópico etiquetados radiación antígenos y
radioinmunoensayo para la diferencia, por lo que se
llama técnica de ensayo inmuno (ensayo inmuno, IRMA)3.

En 1977, el Dr. Yalow recibió el Premio Nobel de Medicina en

reconocimiento a su aportación al estudio de las hormonas peptídicas y por haber
desarrollado junto con Solomon Berson la técnica de radioinmunoensayo (RIA). Lo
habría podido ganar antes, pero la muerte de Berson, en 1927, hizo que no
prosperara la propuesta4. Determinaron también la concentración de insulina, en
plasma sanguíneo: medición precisa de pequeñas cantidades de una hormona, tales
revolucionó el campo de la endocrinología. Al permitir la medición precisa de los
niveles sanguíneos de hormonas el mecanismo de enfermedades de deficiencia de la
hormona podría ser identificado, y mejor tratado. Yalow y Berson se negó a patentar
el ensayo, porque pensaban que debería ser de libre acceso al campo de la
medicina2. Para ellos patentar era privar a la gente de los descubrimientos con el fin
de ganar dinero. La sencillez y facilidad de la metodología permitieron su uso
4
extensivo en países desarrollados4. Para el comité Nobel, Berson era el cerebro y
Yalow las manos, pero es evidente que estaba equivocado 2.

Con esta técnica, la separación del antígeno unido del no unido es crucial.
Inicialmente, el método de
separación empleado fue

el uso de un segundo "anti-anticuerpo" dirigido contra el primero para la

precipitación y centrifugación. El uso de la suspensión de carbón para la
precipitación se amplió, pero reemplazado más tarde por los Dres. Werner y
Acebedo en la Universidad de Columbia por RIA de T3 y T4. Un ARI ultramicro de
TSH humana fue publicada en BBRC por los Dres. Acebedo, Hayek et al 2.

De acuerdo con Li, A y colaboradores llegó a la conclusión, a partir de la

tecnología RIA creado hasta ahora, de acuerdo con grandes avances en la tecnología
puede ser dividido en cinco generaciones3.

● La primera generación (1959-1964) tecnologías RIA y el método de ensayo

de la proteína de unión competitiva (CPBA) fue pionero.
● La segunda generación (1965 a 1970) que muchos estudiosos han hecho
mucho por la tecnología RIA estudio experimental, la tecnología RIA CPBA
y avanzó a nivel de práctica clínica. En 1968 estableció el uso de anticuerpos
marcado con un radionucleido detectar antígenos análisis radiológico
(IRMA).

5
 ● Tercera generación (1971-1980) la tecnología RIA es ampliamente utilizado
para la detección de compuestos de moléculas pequeñas.
● La cuarta generación (1981 a 1995) del ratón anticuerpos anti-eritrocitos
ovinos monoclonales (AcMo). La aparición del nuevo anticuerpo RIA,
técnicas de radioinmunoensayo tal sensibilidad, especificidad mejorada.
● Quinta generación de tecnologías RIA, está siendo desarrollado y utilizado
actualmente, que se basa en las partículas magnéticas combinadas con RIA o
IRMA caracterizado. Diámetro de partícula magnética es pequeña, incluso
con los grupos activos de superficie y otras características, de modo que el
paquete es homogeneidad, reactividad, etc. debe ser superior a los métodos
clásicos de análisis3.

Hoy en día, el radioinmunoensayo todavía se utiliza en los ensayos en los que

se requiera una gran sensibilidad4, siendo utilizada para detectar y
cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeñas y mezcladas
con muchas otras. Es por tanto una técnica muy sensible y muy específica.
Utilizando anticuerpos de gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de
antígeno. (1 pg = 10-12 g) 1.

II. CONCEPTO Y DEFINICIÓN

El radioinmunoensayo, o RIA (Radio Inmuno Assay), utiliza isótopos

radiactivos en vez de enzimas como conjugados de los anticuerpos 5, entre ellos
encontramos como radiación beta: Tritio, C14 y Radiación gamma I125, I131. Siendo el
yodo-125 (I125) el más utilizado como sistema de detección, ya que las proteínas se
pueden yodar con facilidad sin alterar su especificidad5.

Es una técnica competitiva en la que la molécula antigénica 6 (reacción

antígeno – anticuerpo), uno marcado con un isótopo radiactivo y otro sin marcar que
se quiere determinar7, compiten por unirse a un anticuerpo específico con un
trazador radiactivo6.

6
 RIA, tiene una alta sensibilidad y especificidad, requiere cantidades pequeñas
de muestras para análisis y no es contaminante, ya que la prueba se hace en tubos de
ensayo y no se administra material radiactivo a los animales6.

III. ELEMENTOS DEL RIA

Los elementos principales que intervienen en el RIA son, por tanto, la

sustancia a medir, el antígeno “frío”, el trazador radiactivo (antígeno marcado), el
anticuerpo, y el medio de separación de la fracción unida de la fracción libre, que
se aplique para separar los dos términos de la ecuación, los complejos antígeno-
anticuerpo formados y las formas disociadas6.

III.1. Sustancia a medir

Además de las hormonas, es posible analizar una gran variedad de compuestos tales
como drogas, antibióticos, neurotransmisores y vitaminas, entre otros. Incluso,
se puede detectar la presencia de microrganismos patógenos. Estos compuestos
pueden estar en plasma, suero, leche, orina, saliva, linfa, líquido amniótico y
heces6.

III.2. Antígeno “frío”

El antígeno “frío” es la molécula que se va a determinar por RIA compitiendo
con el trazador radiactivo por unirse al anticuerpo. El antígeno interviene en el
RIA en tres acciones diferentes: como antígeno en la obtención del anticuerpo,
como sustancia pura en la preparación de la curva patrón, y frecuentemente
también como sustrato en la reacción de marcaje para la síntesis del trazador
radiactivo6.
En la preparación de la curva patrón se necesita que el antígeno esté altamente
purificado, tanto en isomería, si posee isómeros ópticos o de posición, como en
estructura molecular en el caso de que tenga estructura muy compleja, etc6.

7
 Las soluciones para realizar la curva patrón, con cantidades conocidas de
antígeno, se pueden preparar en diferentes solventes según naturaleza de las
muestras que se vayan a analizar (tampón adecuado, suero o plasma sanguíneo,
sangre completa, orina, etc.) para que la curva patrón y los problemas sean
semejantes y la reacción del RIA se produzca en las mismas condiciones en
ambos casos6.
Las soluciones controladas para la curva patrón se preparan a partir de una
solución madre concentrada, por diluciones sucesivas, en un solvente
apropiado, preparando cada una a partir de la anterior, o mejor aún por
diluciones directas crecientes, evitando de esta forma que los posibles errores
cometidos en la preparación de la solución patrón más concentrada se
transmitan a las demás disoluciones, con lo que el error del método
aumentaría6.
La pureza química y estructural del antígeno es necesaria para evitar las
reacciones cruzadas con el anticuerpo que pueden inducir las moléculas de
estructura muy semejante a la del antígeno6.

III.3. Trazador (antígeno marcado)

Es la sustancia a medir (antígeno) unida a una partícula radiactiva. La mayoría de

los RIA iniciales utilizaron el tritio (H3). Este isótopo tiene la ventaja de poseer
una larga vida media (12.3 años). Los antígenos tritiados son muy estables y el
riesgo de exposición radiactiva es baja. Sin embargo, la medición del H 3 tiene
una eficiencia entre el 15% y 40%; por lo tanto, se debe utilizar en altas
concentraciones. El conteo de compuestos marcados con tritio es oneroso y, en
consecuencia, poco usado en la actualidad6.
Lo antígenos marcados con I125 posibilitan el diseño de protocolos donde una de
las fracciones se queda en el tubo de ensayo y puede ser contada directamente,
disminuyendo el costo del material y aumentando la precisión de la prueba.
Entre las desventajas se pueden mencionar la corta vida media del isótopo (60

8
 días), la baja estabilidad del compuesto que puede reducir la sensibilidad del
ensayo, y el mayor riesgo de contaminación radiactiva para el personal6.

III.4. Anticuerpo
El anticuerpo es una inmunoglobulina, generalmente una Ig. Capaz de reaccionar
con la sustancia a medir y de alta especificidad y afinidad 7. También se obtiene
específicamente contra el antígeno que se quiere determinar 6. El antígeno, por
sus características puede ser un antígeno verdadero, capaz de inducir la
formación de anticuerpos específicos y reaccionar con ellos, o tener solo
capacidad hapténica, es decir, que reacciona con el anticuerpo pero no tiene
tamaño suficiente para inducir su formación, sino que hay que ligarlo a una
molécula de mayor tamaño para que el hapteno adquiera capacidad antigénica6.
Los antígenos verdaderos son las macromoléculas de peso molecular superior a
10.000, que inducen fácilmente la respuesta inmune cuando se inyectan en una
especie animal diferente a la de procedencia6.
Por su parte, los haptenos son moléculas que no tienen tamaño suficiente para
inducir la respuesta inmune, aunque pueden reaccionar con el anticuerpo ya
formado. En este caso, para obtener anticuerpos, hay que unir el hapteno a una
molécula portadora que aumente el tamaño de este y pueda desencadenar la
respuesta inmune. Como moléculas portadoras pueden emplearse diversas
macromoléculas (proteínas, lipopolisacáridos), partículas (sílice, liposomas),
etc. La respuesta inmune se exalta mediante el empleo de agentes
coadyuvantes6.
Cuando se estima una adecuada producción de anticuerpos se sangra al animal
productor, se separa el suero y se titula el antisuero obtenido6.
En numerosas ocasiones la producción de un anticuerpo en un animal provoca un
aumento en la concentración del hapteno. Un ejemplo es la producción de
anticuerpos anti- hormonas tiroideas, que tienen la misma estructura en las

9
 diferentes especies animales y se regulan por un circuito feed – back. El
conjunto de hormona – molécula portadora induce la producción de
anticuerpos, de forma que el anticuerpo formado se unirá a la hormona del
animal activándola y estimulando su producción. Las moléculas de anticuerpo,
por tanto, irán unidas a moléculas de hapteno, por lo que en estos casos es
imprescindible la purificación del antisuero para eliminar las moléculas de
hapteno y poder utilizado en el RIA con un buen rendimiento6.
Se obtienen dos tipos de anticuerpos. Los Ac policlonales que se obtienen
inyectando sustancias antigénicas en animales de laboratorio. Este antígeno
desencadena una respuesta inmunológica que produce anticuerpos contra
distintos componentes antigénicos de su molécula. El conjunto de anticuerpos
producidos contra el suero del animal inmunizado se le denomina antisuero.
Por otro lado, los Ac monoclonales son producidos por hibridomas, células
resultantes de la fusión de células específicas del bazo (de animales
previamente inmunizados) con células tumorales de mieloma. Los hibridomas
retienen las propiedades de las células esplénicas de producir anticuerpos y de
las células tumorales de reproducirse en condiciones in vitro6.
La estructura de las hormonas péptidas, a diferencia de las hormonas esteroides,
difieren entre especies, de modo que los anticuerpos producidos contra ellas
son característicos para cada especie. Esto es importante, toda vez que los kits
comerciales para determinación de hormonas péptidas están diseñada es para
uso en humanos., estos kits no pueden ser utilizados para medir hormonas en
amínales domésticos, a menos que sean validados para la especies en cuestión
y, aún así sólo pueden ser utilizados para determinar cantidades relativas y no
absolutas6.

III.5. Separación de las fracciones unidas y libres

El RIA requiere de un eficiente sistema de separación del complejo antígeno-
anticuerpo o fracción unida (AgAc y Ag*Ac) del antígeno libre (Ag y Ag*).
Existen diferentes métodos de separación, entre ellos la asociación de
anticuerpos a polímeros insolubles; la precipitación química de la fracción

10
 unida (sulfato o polietilenglicol); la adsorción de la fracción libre (carbón
recubierto con dextrán); el inmunológico (usando un segundo anticuerpo que
reacciona contra el primer anticuerpo); y la fase sólida donde se utilizan tubos
de ensayo o una matriz recubierta con el anticuerpo6.

IV. CLASIFICACIÓN
Se clasifican en:
1. Directo o competitivos (RIA):

El RIA directo se basa en la reacción antígeno – anticuerpo, en la que un

antígeno se une a su anticuerpo específico sin establecer enlaces químicos, sino
que se unen por fuerzas débiles tales como atracciones electrostáticas, fuerzas
hidrofóbicas, etc., de forma que al cabo de un tiempo se alcanza un equilibrio entre
el complejo antígeno- anticuerpo que se forma y el que se disocia6.

Antígeno + Anticuerpo

Complejo Antígeno- Anticuerpo

Si en este sistema antígeno – anticuerpo en equilibrio se introduce una

molécula de estructura similar a la del antígeno (Ag) pero marcada con un
radionúclido (Ag*), el anticuerpo (Ab) no la puede distinguir y reacciona con ella
igual con el antígeno inicial, hasta que finalmente se alcanza un nuevo equilibrio,
formándose los dos complejos antígeno – anticuerpo, el radiactivo y el no
radiactivo o “frío”6:

Antígeno marcado

Anticuerpo Complejo antígeno-anticuerpo radiactivo

Anticuerpo no marcado

11
 Complejo antígeno - anticuerpo

Si se mantienen constantes las cantidades de trazador y de anticuerpo en este

sistema en equilibrio, en una serie de tubos de ensayo, el que se forme mayor o
menor proporción del complejo antígeno – anticuerpo “frío” o radiactivo
dependerá únicamente de la cantidad de antígeno frío6.

La base del RIA consiste en la inhibición competitiva 8 del antígeno “frío” y

el trazador por unirse con el mismo anticuerpo, de forma que ausencia de antígeno
todo el complejo que se forma es radiactivo6, y a medida que aumenta la
concentración de antígeno "frío", más de lo mismo se une al anticuerpo,
desplazando la variante radiomarcado, y la reducción de la relación de antígeno
radiomarcado unido al anticuerpo al antígeno radiomarcado libre. Los antígenos
unidos se separan entonces de los no unidos queridos, y la radiactividad del
antígeno libre que queda en el sobrenadante se mide usando un contador gamma2.

+ +

Antígeno Antígeno no Anticuerpo Complejo Antígeno-Anticuerpo

Radiactivo radiactivo
Separación

Recuento de

Radiactividad

12
 Método directo de RIA

Bajo este principio se puede determinar la concentración del antígeno en

muestras complejas de fluidos biológicos con suficiente sensibilidad y
especificidad si se cumplen los siguientes requisitos:

● El trazador es altamente radiactivo y por lo tanto puede colocarse en

concentraciones infinitesimales, pero cuantificables.
● El anticuerpo es altamente específico, posee muy alta finalidad y se halla en
muy baja concentraciones8.

De esta forma, con cantidades conocidas de antígeno se podrá preparar una

curva patrón al añadir cantidades conocidas y crecientes de antígeno en la anterior
serie de tubos y con esa curva patrón se podrán comparar las muestras problema
con cantidades de antígeno desconocidas6.

13
 Esquema de radioinmunoensayo directo para medir hormonas (progesterona)

2. RIA de inhibición:
El RIA de inhibición también sería una técnica competitiva de análisis pero lo que se
une a la fase sólida es una cantidad fija de antígeno. Para el proceso de
inhibición se incuba una concentración fija de anticuerpo marcado frente a una
serie de diluciones de la muestra que contiene el antígeno9.

Se procede cuando no se puede marcar el antígeno.

1. Se inmoviliza una cantidad constante de antígeno en un soporte sólido. Se

suele saturar con BSA, leche en polvo o caseína para que no se una nada más
al soporte.
2. Se añade una cantidad constante de Anticuerpo marcado y el antígeno frío a
medir (o de calibrado). En este paso se establece una competencia en la que
el Ac se une al Ag fijo al soporte o al problema10.
3. Se eliminan el anticuerpo no inmovilizado y el antígeno soluble y se
determina la cantidad de anticuerpo marcado que se ha inmovilizado10.
4. Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de anticuerpo
marcado inmovilizado frente a la concentración de antígeno soluble añadida
o bien se interpola la radiactividad medida en esta curva de calibrado10.
14
 Método de Inhibición de RIA

3. IRMA inmunoradiometría (no competitivo o sándwich ):

El IRMA es una técnica analítica basada en el empleo de un trazador radiactivo,
pero es no competitiva. La muestra, o la solución calibrada, se incuba en un
tubo de ensayo que posee el anticuerpo unido a la pared del tubo, y a
continuación se añade un segundo anticuerpo marcado con un radionúclido,
normalmente I125. Así se forma un sándwich en el que la cantidad de trazador
retenida aumenta con la presencia de antígeno. Por ello la técnica es no
competitiva6.

15
 En el IRMA los reactivos que se añaden a la muestra están en exceso, de forma
que la cantidad de radiactividad empleada en cada tubo es notablemente mayor
que en el RIA. Por ello tras la incubación es necesario lavar varias veces el
tubo para eliminar el exceso de radiactividad que no ha reaccionado, ya que al
tener esa radiactividad por tubo, una cantidad pequeña retenida puede
representar un error significativo6.
Al ser una técnica no competitiva la curva de calibración del IRMA es inversa a
la del RIA, ya que la fracción de radiactividad ligada aumenta con la cantidad
de antígeno presente en la muestra6.
En el orden práctico el IRMA no ha significado una mejoría sustancial respecto a
los logros del RIA6.

Método de Sándwich

16
 /

V. SEPARACIÓN DE LAS FASES LIGADA Y NO LIGADA

Tras la reacción antígeno-anticuerpo, en el tubo de reacción encontraremos: ·
✓ Las fracciones libres, constituidas por antígeno frío y antígeno marcado.
✓ Las fracciones ligadas formadas por complejos antígeno-anticuerpo y
antígeno marcado-anticuerpo11.

Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y después de la

reacción, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la
radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra11.
Hay diferentes métodos de separación están basados en las distintas propiedades del
antígeno libre y del complejo antígeno-anticuerpo11:

V.1. Adsorción: Con carbón activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen)
específicamente la fase libre (antígenos frío y caliente) pero no se unen a los
complejos antígeno-anticuerpo que quedarían en solución. Tras centrifugación,
el carbón sedimenta en el fondo del tubo con la fase no ligada mientras que la
fase ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o decanta. Este método se
utiliza cada vez menos11. El carbón activo tiene la propiedad de adsorber una
gran variedad de sustancias y pequeñas moléculas y lo realiza casi
instantáneamente. Aunque de modo algo más lento y en menor grado también
es capaz de adsorber proteínas y los complejos antígeno – anticuerpo. Sin
embargo, cuando recubren las partículas de carbón activo con una ligera capa
de un polisacárido como el dextrano, que presenta uniones covalentes entre sus
cadenas formando una malla (un tamiz molecular por el cual no pueden pasar
moléculas de gran tamaño), ni Ac no Ac- Ag* pueden adsorberse a dichas
partículas de carbón activo. Por lo tanto, si se añade carbón activo recubierto
de dextrano a una mezcla de Ag* libre y Ac- Ag*, al centrifugar
inmediatamente después se obtiene como resultado la sedimentación de la
fracción radiactiva no unida a AC (es decir, Ag*) y la radiactividad
correspondiente a Ac- Ag* permanece en el sobrenadante6.
17
 = Ac
Centrifugación
= Ag*
= Ac + Ag* Sólo en el sobrenadante
= = Dextrano

V.2. Precipitación química: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o

el sulfato amónico que alteran la solubilidad de las proteínas provocando su
precipitación. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugación, quedan
los complejos ligados en el sedimento y la fracción libre en el sobrenadante,
que se elimina por aspiración o decantación11.

V.3. Precipitación inmunológica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el

anticuerpo del sistema. La unión del segundo anticuerpo al complejo antígeno-
anticuerpo da lugar a un complejo de gran tamaño, en general insoluble y
fácilmente precipitable. Tras incubación y centrifugación, la fase libre queda
en el sobrenadante y se separa por aspiración o decantación. Este método es
muy utilizado en RIA11. · El anticuerpo se prepara normalmente en un conejo;
dado que la γ- globulina del conejo es un antígeno en otros animales, estos
anticuerpos se utilizan para la producción de γ- globulinas anticonejo en cabra,
oveja, caballo y vaca. La adición de suero anticonejo de cabra a γ- globulina
de conejo, da como resultado la formación de precipitados que pueden ser

18
 recogidos por centrifugación. En consecuencia, puede utilizarse el siguiente
procedimiento. A cada uno de los tubos utilizados para obtener la curva patrón
y a los tubos de la muestra (que han sido incubados previamente todos ellos el
tiempo suficiente para formar los complejos Ac- Ag*), se les añade Ac
anticonejo de cabra en la cantidad adecuada al punto de equivalencia de la
reacción de la precipitina. A continuación, se incuban las mezclas (usualmente
por un período de tiempo que oscila entre las 16 y las 48 horas) y, después de
la incubación, se someten a centrifugación. Los complejos Ac- Ag* quedarán
en el sedimento y el Ag* libre en el sobrenadante. Este método resulta, en
general, altamente satisfactorio, pero requiere mantener animales de gran
tamaño para obtener el antisuero6.

Ac (g) = γ- globulina anticonejo de cabra.

Ac ( r) = Antiantígeno de conejo

Ac (r ) + Ag* Ac (r ) Ag* + Ag*

Exceso En menor
Cantidad
Ac (g) añadido

+ Ag*
Ac(g) [Ac(r ) Ag*]

Centrifugación

Ac(g) [Ac (r )Ag*] en sedimento

Ag* en sobrenadante

V.4. Fase sólida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte sólido, que

puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partículas de Sephadex
(polímero). La separación se consigue simplemente aspirando el medio de
incubación. Este método tiende cada vez más a utilizarse por ser sencillo,

19
 práctico, más corto y requiere menos manipulación, e incluso permite su
automatización11.
VI. CONTAJE DE LA RADIACTIVIDAD
Para proceder al cálculo del RIA para determinar la concentración de antígeno en las
muestras problema se cuenta la radiactividad retenida en cada tubo. El contaje de la
radiactividad se realiza en contadores apropiados según el tipo de emisión del
radionúclido, contador gamma (γ), si el isótopo utilizado para el marcaje es I 125, o
contador Beta (β) en el caso de haber marcado con tritio (H3)6.
Los contadores de radiactividad más comunes son los de centello, éstos no detectan
directamente la presencia de un radioisótopo sino que la muestra radiactiva se halla
dispersa en el centelleador 6. Consta fundamentalmente del contador, está compuesto
por una sustancia fluorescente y un tubo fotomultiplicador asociado. La sustancia
fluorescente o centellador es una sustancia apropiada con la que interacciona la
radiación emitiendo un destello luminoso, es decir, transforma la radiación
absorbida en impulsos luminosos. El fotomultiplicador asociado posee un
fotocátodo que libera electrones por la acción de la luz emitida por el centelleador, y
un sistema de dínodos que amplía la respuesta electrónica hasta un rango adecuado6.
Como centelleadores se emplean cristales de NaI activado con TI en la detección de
radiación γ (centelleo sólido), y para la radiación β se emplean líquidos orgánicos
fluorescentes como terfenilo, antraceno o xileno, en los que se disuelve la muestra a
contar (centelleador líquido)6.
Para aumentar el rendimiento de contaje del contador de centelleo sólido, su eficiencia,
el detector generalmente no es plano, sino que posee un orificio en el que se
introduce el tubo a contar y así poder detectar la radiactividad emitida en casi todas
las muestras y realizar cálculos con el resultado del contaje6.
Existen también contadores específicos para la lectura de muestra de RIA, que disponen
de una serie de detectores independientes capaces de leer muchos tubos
simultáneamente dispuestos en gradillas de plástico especiales. El contador,
previamente programado, reconoce la función de cada tubo por la posición que
ocupa para establecer la curva patrón y dar el resultado de las muestras
directamente6.

20
 VII. CÁLCULO Y INTERPRETACIÓN DEL RIA
Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la concentración de
hormonas, hay que construir una curva patrón que relacione estos parámetros. La
curva patrón se prepara al mismo tiempo que el análisis de las muestras problema,
aplicando la técnica a una serie de tubos que contienen cantidades conocidas de la
hormona a determinar (antígeno no marcado patrón) y las mismas cantidades de
antígeno marcado y de anticuerpo que se usan en el análisis11:
- En el primer tubo no hay antígeno no marcado, por lo que todos los centros de
unión del anticuerpo serán ocupados por el antígeno marcado. A este punto de
máxima unión del antígeno marcado se llama B 0 o Bmáx, que representa la
radiactividad máxima que se puede unir11.
- Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas cada vez mayores de
hormona, a mayor concentración de antígeno no marcado menor formación de
complejos antígeno marcado-anticuerpo, ya que ambos antígenos compiten por
unirse al anticuerpo11.
Los resultados obtenidos nos permiten construir una curva patrón representando
gráficamente la radioactividad obtenida (ó el % sobre Bo) en estos tubos (eje de
ordenadas, eje Y), frente a las concentraciones conocidas de antígeno no marcado
contenida en cada uno de los tubos (eje de abscisas, eje X)11.
Ejemplo de curva patrón: (100 de Ag*)

21
 La concentración de hormona en las muestras problema se calcula interpolando en esta
curva patrón la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema. La
curva patrón se puede representar gráficamente como una recta utilizando un papel
semilogarítmico, lo que facilita la lectura de los resultados11.
Como se ha indicado anteriormente, la cuantificación del RIA se realiza normalmente
en base a la fracción de trazador que queda retenida por el anticuerpo en forma de
complejo antígeno- anticuerpo radiactivo. La cantidad de antígeno presente en las
muestras problema se determinará por comparación con la fracción de
radiactividad ligada por el anticuerpo en las soluciones patrón. La comparación de
las muestras desconocidas con la curva patrón debe hacerse siempre por
interpolación entre concentraciones calibradas conocidas, nunca por extrapolación,
ya que no se puede predecir el comportamiento de la reacción fuera de los puntos
conocidos6.
La representación y cuantificación del RIA necesita relacionar la fracción de
radiactividad ligada al anticuerpo con la concentración de antígeno. Esta relación se
puede establecer de varias formas: relación lineal, escala logarítmica o
semilogarítmica, transformación logit, etc6.

%B Log
%B
it B

Ag Log Ag Log Ag

Figura. Diversas formas de representar la curva patrón del radioinmunoensayo (RIA): representación decimal (A),
semilogarítmica (B) y transformación logit (C). Al ser un método competitivo, la fracción de trazador
radiactivo unido al anticuerpo disminuye al aumentar la cantidad de antígeno presente en el tubo6.

22
VIII.CARACTERÍSTICAS DEL RIA

- Alta especificidad, gran avidez por el antígeno y elevado título11.

- El anticuerpo debe ser utilizado en una concentración conocida y limitada, para

que la reacción se mantenga en la llamada zona de equivalencia. Si el
anticuerpo es levantado con el mismo antígeno que se va a detectar, y el
antígeno marcado también, se considera un ensayo homólogo, en el caso
contrario, es un ensayo heterólogo11.

- Método de gran sensibilidad.

- Gran auge en sus comienzos (década 60).

- En la actualidad de empleo más restringido.

- Muchas aplicaciones han sido sustituidas por otras técnicas que ofrecen más
ventajas.

- Son las más sensibles de las técnicas.

- Los equipos se usan para su medición son sumamente sensibles12.

IX. VENTAJAS

Radioinmunoensayo análisis de un número de otras ventajas sin precedentes3.

- Tiene una alta especificidad de la respuesta inmune, y la alta sensibilidad de

las mediciones radiactivas, por lo tanto se puede medir con precisión una
variedad de actividad inmune muy pequeña cantidad de material3.

1. Análisis general química de alta sensibilidad, el límite de detección de 10 -10 g,

y RIA es por lo general 10 (nanogramos, ng), 10 g (picogramos, PG), o 10 g
(femtogramos, fg), 10 g (microgramos ligeramente, ag)3.

2. Debido especificidad de antígeno - anticuerpo respuesta inmune fuerte

especificidad, el analito debe ser antígeno correspondiente. Buenas anticuerpos
de especificidad pueden identificar la estructura química de material muy
similar, o incluso para identificar estereoisómeros3.

23
 3. Amplia gama de aplicaciones, según estadísticas incompletas, hay por lo
menos 300 tipos de sustancias bioactivas se han establecido RIA. Se puede
aplicar a casi todas las hormonas (incluyendo hormonas peptídicas y
esteroides), pero también para una variedad de proteínas, antígenos tumorales,
antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos de parásitos, y pequeñas
moléculas (tales como el anillo-núcleo ciclasa, etc.) y las drogas (como la
digoxina, glucósidos digitálicos, etc.) de análisis, el campo de aplicación
todavía está en expansión. En los últimos años, debido a la técnica de
preparación de anticuerpos pequeña molécula de hapteno tiene gran desarrollo,
se predijo que la casi totalidad de las sustancias activas biológicas, como
mucho, ya que no es menor que el límite de detección de RIA, puede crear el
método RIA apropiada3.

4. Simples reactivos de RIA requiere mucha variedad, se puede hacer kit

completo; procedimiento de pipeteado es simple una vez capaz de analizar un
gran número de muestras, la cantidad de muestra es también menor, el tiempo
de reacción no es largo, la medición y de procesamiento de datos fácil de
automatizar; RIA un ensayo in vitro la tecnología, los pacientes sin ningún
peligro de radiación3.

5. Los emisores utilizados para el RIA son de tipo β o γ.

6. Vidas medias adecuadas, una gran producción de energía, ser fáciles de

obtener y no se acomplejen durante su acoplamiento a la molécula ligando.

7. La corta vida media es ventajosa in vivo para reducir los efectos secundarios
de radioactividad en el paciente.

X. DESVENTAJAS

- La sensibilidad de RIA está restringida, principalmente, por la constante de

equilibrio de la reacción antígeno- anticuerpo y por los errores técnicos del
manejo de los reactivos (pipeteo y separación).
- Este método requiere siempre la elaboración de una curva estándar para la
lectura.

24
 - Debido a la utilización de agentes biológicos, su estabilidad se ve afectada por
muchos factores, la necesidad de un conjunto de medidas de control de calidad
para garantizar la fiabilidad de los resultados3.
- Las complicaciones inherentes a manipulación y deshecho de los materiales
radiactivos en el laboratorio clínico.
- Costosa y peligrosa.
- Requiere un equipo especial que es el contador gamma para medir la
radiación8.
- Mide sólo en las sustancias activas de respuesta inmune inmune, pero la
pérdida de la sustancia biológicamente activa es inmunorreactiva indetectable.
Por lo tanto los resultados RIA pueden ser incompatibles con los resultados de
los bioensayos3.
- Sensibilidad por el método en sí funciona, las restricciones en el cuerpo de
ciertas sustancias con niveles especialmente bajos aún no se determina3.
- Como el radioinmunoensayo es una reacción competitiva, el objeto medido y
la sustancia estándar no están todos los implicados en la reacción, los valores
medidos son relativos en lugar de la cantidad absoluta de la capacidad3.

A pesar de estas deficiencias existe RIA, pero es después de que todos los métodos de
análisis cuantitativos y tecnologías avanzadas. Con el avance de la ciencia y la
tecnología, la tecnología radioinmunoensayo será más amplio y profundo
desarrollo3.

25
 XI. RADIOISÓTOPOS UTILIZADOS

Elemento Isótopo Vida Media Radiación mayor Aplicaciones importantes

Aprox.
Carbono C14 5600 años Beta Investigación en metabolismo, edad por
carbono.
Hidrógeno H3 12 años beta Investigación en biología celular
Fósforo P32 14 días Beta Investigación de ácidos nucleicos,
tratamiento de policitemia.
Yodo I125 60 días Gamma Cáncer de próstata

Yodo I131 8 días Gamma Tratamiento de hipertiroidismo y cáncer de

tiroides.
Cromo Cr51 28 días Gamma Diagnóstico de la cinética de Glóbulos rojos

Tecnecio Tc99 6 horas Gamma Experimentos del flujo sanguíneo;

gammagrafías
Radio Ra226 1600 años Gamma Implantación intersticial para el tratamiento
de cáncer
Cobalto Co60 5.3 años Gamma Teleterapia para cáncer
Cesio Cs137 30 años Gamma Teleterapia para cáncer

XII. APLICACIONES

▪ Diagnóstico de tumores: Algunos tumores producen especiales que pueden ser

hallados en la sangre o en la orina. En ciertos casos, por ejemplo, la
gonadotropina coriónica humana, la hormona lactógena placentaria humana y la
fosfatasa alcalina placentaria. Los antígenos no se encuentran normalmente en
la sangre, aunque sí en el suero de un cierto porcentaje de pacientes con
determinados tipos de carcinoma6.

Cuando un tumor afecta a un tejido que normalmente controla o produce una

hormona, a menudo tiene lugar un incremento en el nivel de dicha hormona,
por ejemplo, elevada cantidades de insulina en sangre pueden ser debidas a un
26
 tumor pancreático. Cada una de estas sustancias pueden ser detectadas por
métodos de radioinmunoensayo con una sensibilidad mucho mayor que con
otros ensayos químicos y biológicos conocidos6.

Detección y diagnóstico de tumores: alfa-fetoproteína (AFP), el antígeno

carcinoembrionario (CEA), antígeno carbohidrato (CA19-9), antígeno de la
glicoproteína (CA-125, CA15-3), β2-microglobulina (β2-MG) ferritina (SF), el
antígeno prostático específico (PSA)3.

▪ Ensayo de sustancias clínicamente importantes en niños o en general,

cuando sólo se dispone de ellas en pequeñas cantidades6.

Muchas sustancias clínicamente importantes pueden ser ensayadas en grandes

muestras de sangre mediante pruebas químicas convencionales. Sin embargo, al
tratarse de lactantes, niños de corta edad, pacientes en estado grave o animales
de pequeño tamaño, la cantidad de muestra requerida puede llegar a ser mayor
de la que podría extraerse sin peligro. En estos casos, el radioinmunoensayo
evita el problema gracias a su gran sensibilidad6.

27
▪ Determinación de dímeros de pirimidina en DNA irradiado con luz
ultravioleta. En los estudios in vivo sobre los mecanismos de reparación de
DNA irradiado, siempre es necesario medir el número de dímeros de pirimidina
(el principal producto de la radiación ultravioleta del DNA). Esto puede
realizarse por cromatografía en papel o electroforesis, si el DNA intracelular
puede marcarse con H3 a una elevada actividad específica. Sin embargo, esto no
es posible cuando se utilizan células animales y vegetales. Además, es difícil
detectar pequeñas cantidades de dímeros, por ejemplo: 1 x 108 pares de bases;
por los métodos convencionales, mientras que sí puede realizarse por
radioinmunoensayo6.

Detección de dímeros de timina (TT) en DNA por radioinmunoensayo, utilizando un

anticuerpo contra DNA irradiado con ultravioleta, es decir, anti TT. Se mezcla anti –
TT y DNA iodado e irradiado con ultravioleta, y se mide la cantidad de iodo radiactivo
precipitado por el suero anticonejo de cabra. Se mide así la disminución que
experimenta la radiactividad precipitada en función de la cantidad de DNA irradiado
con ultravioleta. Realizando una curva patrón puede relacionarse el porcentaje de
inhibición con el número de dímeros de timina. En la figura se representan las gráficas
para el DNA de dos bacterias distintas. El DNA de Micrococcus luteus posee un
contenido de timina menor que el de Proteus vulgaris y, por tanto, requiere una dosis
de UV mayor para conseguir el mismo número de dímeros de timina.

▪ Función de las prostaglandinas en el hombre. En el hombre, la sangre venosa

contiene de 10 a 100 picogramos por mililitro de varios ácidos grasos
poliinsaturados, que reciben el nombre genérico de prostaglandina. La
incapacidad de titular cuantitativamente estas sustancias, y con una elevada

28
 sensibilidad, ha sido un serio obstáculo para investigar su significado en el
cuerpo humano; el radioinmunoensayo ha eliminado este problema y ha
facilitado, además el análisis de un gran número de muestras en un corto
período de tiempo6.

▪ Detección y cuantificación de antígenos y anticuerpos en laboratorios de

Bioquímica.

▪ Hematología: determinaciones de vitamina B12, ácido fólico, etc.

▪ Detección de Inmunoglobulina (IgE)

▪ Virología: determinaciones de marcadores de hepatitis B y C.

▪ Farmacología y toxicología: determinaciones de fármacos en sangre, detectando

posibles sensibilizaciones de los organismos ante las alergias.

▪ En la endocrinología para cuantificar hormonas:

- En las hormonas gonadales hipófisis: la hormona folículo estimulante (FSH),

hormona luteinizante (LH), testosterona (T), estradiol (E2), la progesterona
(P), prolactina (PRL), la vida hormona de crecimiento (HGH), la
gonadotropina coriónica humana (HCG), lactógeno placentario humano (HPL)
y así sucesivamente.

- Hormonas de la glándula tiroides.

▪ Radiorreceptor Análisis: los receptores están presentes en la superficie celular,

citoplasma o el núcleo de la sustancia activa biológica, y su función es la de
moléculas de señal extracelular (ligandos) de unión específica, los efectos
biológicos de los cambios en la información3.

Análisis de radiorreceptor (ensayo de radiorreceptor, RRA) o ensayo de unión

de radioligando del receptor (ensayo de unión de radioligando, RBA) se basa en
la reacción de unión entre el ligando radiomarcado del receptor, que es las
moléculas receptoras El análisis cuantitativo del estudio y la localización
sensible y una tecnología fiable. Clínicamente el más común es TRAb análisis

29
 radiorreceptor, TRAb séricos de hipertiroidismo y el hipotiroidismo diagnóstico
etiológico tiene un significado importante. Además, el diseño biológica, el
mecanismo de acción de los fármacos, los efectos biológicos e investigar la
causa de la enfermedad, el diagnóstico y el tratamiento de tales aplicaciones se
ha desarrollado en gran medida3.

Análisis microbiológico de radiación (ensayo de radiomicrobiologic) a los

microbios específicos como un aglutinante, tal como la determinación de ácido
fólico en algunos microorganismos3.

XIII.TIPO DE CUADROS CLÍNICOS

● Pruebas inmunológicas: Para la detección del antígeno del serogrupo I de

Legionella pneumophila en muestras de orina de paciente de neumonía14.

● Infecciones víricas como los Calicivirus; el diagnóstico etiológico en

deposiciones puede realizarse mediante radioinmunoensayo, siendo sus
síntomas: gastroenteritis leve o moderada y de curso limitado, 1 a 2 días de
duración. Puede manifestarse con alguno o la totalidad de los siguientes
síntomas: náuseas, vómitos, cefalea, mialgias, fiebre moderada, dolor
abdominal y diarrea. Cabe destacar que los síntomas gástricos son más
frecuentes que en otras infecciones virales entéricas15.
● El cuadro clínico asociado a elevaciones plasmáticas de vipoma (síndrome
de diarrea acuosa) por radioinmunoensayo, son diagnósticos del vipoma.
Otras pruebas son hipocalcemia, acidosis, azotemia prerrenal, disminución
de la secreción de ácido clorhídrico, hipercalcemia, aumento de
prostaglandina E, elevación de gonadotropina coriónica e hipomagnesemía16.

● Detección de antígenos: el uso de las técnicas de radioinmunoensayo (RIA)

y ELISA y el empleo de Acs policlonales han permitido detectar, en
pacientes con histoplasmosis, la presencia de antígenos de tipo polisacárido

30
 en muestras de fluidos corporales como orina, suero, lavados
broncoalveolares y líquido cefalorraquídeo17.

● La cuantificación de T4 total, T3 total y T4 libre circulantes por

radioinmunoensayo son datos muy importantes en el diagnóstico de
disfunción tiroidea. Dado que los valores de T4 y T3 totales en suero
dependen no sólo de su tasa de secreción por el tiroides, sino también de las
concentraciones de TBG y otras proteínas a las que se ligan para su
transporte, es muy importante el conocimiento de las variaciones de estas
proteínas trasportadoras: por ello, la medición de T4 libre da una información
adicional indicadora de la tasa de secreción tiroidea, ya que no es
dependiente de las concentraciones de proteínas transportadoras. Poca
utilidad tiene la cuantificación de T3 reversa (rT3) en el diagnóstico clínico
habitual de función tiroidea. La cuantificación de T3 libre no aporta
información adicional a la que se obtiene con la medición de T4 libre18.

XIV.REACCIONES ADVERSAS

Los estrógenos pueden aumentar la globulina transportadora de hormonas

tiroideas (TBG, por sus siglas en inglés) lo que lleva a un incremento en
hormona tiroidea total circulante, medida por yodo unido a proteínas (PBI, por
sus siglas en inglés), niveles T4 por columna o radioinmunoensayo o niveles T3
por radioinmunoensayo19.

31
XV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

35
36