 Buenas tardes, honorables miembros del jurado, maestros, amigos y compañeros presentes,

soy José bastos zayas y en esta ocasión me llena de orgullo estar frente a ustedes para
presentarle mi trabajo que lleva como título –
 Este trabajo fue posible gracias a la guía de mi tutora La Doctora Erika Rodríguez y a las
observaciones recibidas de los evaluadores Jairo mercado y Andrés Sánchez, muchas
gracias a los tres.
 Este trabajo se encuentra dividido por la siguiente tabla de contenido –
 Las fuentes de información utilizadas para la elaboración del documento son las siguientes,
donde las principales fuentes de investigación fueron –

 Comenzamos definiendo que la inmunofluorescencia es una técnica de diagnóstico del tipo

inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos unidos químicamente a fluoróforos para visualizar
antígenos celulares.
 Esta se fundamenta en el principio de la unión antígeno-anticuerpo, que es una interacción
específica y altamente sensible entre una molécula diana (un antígeno) y una molécula de
unión correspondiente (un anticuerpo).
 Siendo la molécula diana un antígeno, estos son cualquier sustancia o molécula capaz de
generar una respuesta inmunitaria específica o que pueda ser reconocida por el sistema
inmune. Estos pueden presentarse en varias formas, desde moléculas elementales,
sustancias químicas, proteínas, carbohidratos, lípidos o ácidos nucleicos derivados de
microorganismos o células.
 Mientras que la molécula de unión correspondiente se refiere a los anticuerpos que son
proteínas producidas por el sistema inmunológico en respuesta a la presencia de una
sustancia extraña y pertenecen a un grupo de proteínas globulares presentes en el suero o
plasma, también se les conocen como inmunoglobulinas. son producidas por los linfocitos B y
su forma de 𝑌 con una estructura que consta de cuatro cadenas de proteínas: dos cadenas
pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, que se mantienen unidas por enlaces
disulfuro.
 En esta estructura se encuentra por dos dominios: un dominio variable conde se encuentra
ubicado una región conocida como fragmento de unión de antígeno, y es el lugar donde se
realiza el reconocimiento y unión al antígeno. El otro dominio se le conoce como dominio
constante y contiene una región llamada fragmento cristalizable, es en esta región donde la
proteína interacciona con el sistema inmunológico, a su vez en este dominio es donde se
realiza la conjugación química con los fluoróforos.
 Estos (Los fluoróforos) son compuestos químicos con la capacidad de emitir fluorescencia al
ser excitados por luz de una determinada longitud de onda. Estos compuestos son
ampliamente utilizados en campos como biología molecular, bioquímica y otros, para
visualizar y etiquetar moléculas, células y tejidos específicos. Estos compuestos pueden ser
intrínsecos o extrínsecos, y existen tres clases principales que son: colorantes orgánicos,
proteínas fluorescentes y sondas inorgánicas. De estas tres clases la más utilizadas en los
laboratorios clínicos son los colorantes orgánicos.
 Estos están unido al anticuerpo mediante una conjugación covalente en los grupos tiol y
amino de la molécula

 La inmunofluorescencia se clasifica en dos grupos, inmunofluorescencia directa e

inmunofluorescencia indirecta, dependiendo de si se usa un solo anticuerpo o dos
anticuerpos para el marcaje con fluoróforos del antígeno de interés.
 Directa: Este método es utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas,
autoinmunitarias y cancerígenas, caracterizándose por tener protocolos más simples para el
etiquetado de antígenos, tiempos de incubación más cortos y la tinción con múltiples
anticuerpos generados en la misma especie no plantea ningún problema.
  Por otro lado, en este método no hay amplificación de la señal, y como resultado, la
intensidad de la tinción puede ser baja si el antígeno de interés se expresa en baja
abundancia, es decir, tiene una sensibilidad limitada dado que el número de moléculas
fluorescentes que pueden unirse al anticuerpo conjugado es limitado. Además, los
experimentos pueden ser limitados, en función de la disponibilidad y el costo de los
anticuerpos conjugados con fluoróforo. Este método de marcaje inmunológico se utiliza
habitualmente para aplicaciones de citometría de flujo.
 Indirecta: Como consecuencia de su aplicación, este método se caracteriza por requerir más
tiempo al tener que realizar más pasos. Este ensayo es utilizado en el diagnóstico de
enfermedades autoinmunitarias, identificación de anticuerpos contra virus, investigaciones
biomédicas y en control de calidad de medicamentos y productos biológicos.
 La ventaja más beneficiosa que brinda este método es una alta y amplia sensibilidad, ya
que múltiples anticuerpos secundarios pueden unirse a un anticuerpo primario dando
como resultado la amplificación de la señal que es extremadamente útil para detectar
antígenos de baja abundancia. Otra ventaja es su bajo costo, ya que el anticuerpo
secundario se puede usar para diferentes anticuerpos primarios y su posibilidad de
realizar análisis cuantitativo de los títulos de anticuerpos, que puede ser útil para
monitorear la progresión y el tratamiento de la en enfermedad.

 Es una herramienta diagnóstica importante en la evaluación de enfermedades

autoinmunitarias, esta prueba se realiza típicamente mediante la detección de anticuerpos en
suero sanguíneo del paciente. Pero, la presencia de ANA no siempre es indicativo de dichas
enfermedades, ya que también pueden estar presentes en individuos sanos. Por lo tanto,
estas pruebas se utilizan como una herramienta complementaria en el diagnóstico de
enfermedades, junto con la evaluación clínica y otros exámenes de laboratorio.
 Los ANA son un tipo de anticuerpos que el sistema inmunológico produce en respuesta a
antígenos nucleares que se encuentran en componentes celulares del núcleo, como
proteínas, ADN, ARN y complejos de ácido nucleico-proteína, formando patrones visibles
cuando se usan conjugados.
 Existen diferentes técnicas en la actualidad que realizan estas pruebas de detección de ANA,
entre ellas se encuentran la inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), la extracción en fase sólida
y el ensayo multiplexado, entre otras, siendo IFI y ELISA las más comúnmente utilizados en
laboratorios clínicos.
 El ELISA utiliza proteínas nucleares específicas que se adhieren a una placa de micro
titulación y se incuban con el suero del paciente. Si hay anticuerpos antinucleares presentes
en el suero, se unirán a las proteínas nucleares específicas y podrán ser detectados
mediante el uso de anticuerpos secundarios marcados con enzimas. El ELISA es la técnica
más rápida y puede ser más fácil de interpretar que la IFI, pero tiende ser menos sensible y
específica que la IFI.
 En el caso de IFI se incuba el suero del paciente con células humanas de núcleos intactos,
siendo la línea de células HEp-2 las más usadas. Si hay anticuerpos antinucleares presentes,
se unirán a los núcleos de las células y podrán ser detectados mediante el uso de
anticuerpos secundarios conjugados, ya que aparte de emitir tinción también forma un patrón
característico para cada uno de los ANA.
 Estos patrones son una característica definitoria de enfermedades autoinmunitarias del tejido
conectivo y su identificación es una herramienta importante para el diagnóstico de
enfermedades como la artritis reumatoidea, el lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta
del tejido conectivo, síndrome de Sjögren, esclerosis sistémica, polimiositis, dermatomiositis
y cirrosis biliar primaria, entre otras más.
 En la actualidad estos patrones se clasifican mediante unas pautas publicadas por la
Comisión Internacional de Muestras de ANA (ICAP, International Consensus on Antinuclear
Antibody (ANA) Patterns)

 La clasificación ICAP identifica tres categorías positivas de patrones principales de

fluorescencia; nuclear, citoplasmática y mitótica; y una categoría negativa de patrones. Cada
categoría positiva se subdivide en grupos y subgrupos de patrones creando un árbol de
clasificación donde a cada patrón y sub patrón se le asigna un código alfanumérico que va
desde AC-1 hasta AC-29 que representando una relevancia clínica a ciertas enfermedades
asociadas.

 Los sistemas asistidos por computadoras nacieron en la década de los años 80, y su uso
durante esa década fue principalmente en el campo de ingenierías, ayudando en el proceso
de diseño y visualización de equipos mediante gráficos de computadora. Durante los años 90
estos sistemas se integraron en el campo de la salud e investigación siendo su enfoque
principal las áreas de radiografía, ecografía, dermatología y en esta última década usan
inteligencia artificial.
 Son programas informáticos que ayudan a los profesionales de la salud a diagnosticar
condiciones médicas a partir de datos obtenidos de imágenes. Estos sistemas utilizan
algoritmos y técnicas de aprendizaje automático para identificar y resaltar automáticamente
áreas de interés en las imágenes, lo que permite una detección temprana de patologías y
una toma de decisiones más eficiente y precisa en el diagnóstico médico.
 Formado por los siguientes módulos:
 Sistema óptico: este módulo incluye un microscopio de inmunofluorescencia equipado con
un sistema de iluminación de luz transmitida y reflejada para detectar los ANA en las
muestras. Además, cuenta con una unidad óptica y varios objetivos que permiten la
observación y captura de imágenes de alta resolución de las muestras.
 Sistema de detección y adquisición de imágenes: este módulo incluye una cámara de alta
resolución que puede capturar imágenes de las muestras procesadas, un software
especializado para la adquisición de imágenes y análisis de datos, pudiendo incluir
también sensores para la detección de fluorescencia y la medición de la intensidad de la
señal.

 El proceso de funcionamiento de un sistema CAD para pruebas ANA involucra varias etapas,
que pueden variar según el proveedor del software y la técnica utilizada en la prueba, en este
caso es la técnica de IFI, así que, de manera general, estos son los pasos que sigue un
sistema CAD para analizar la muestra de pruebas ANA

 Adquisición de la imagen: en primer lugar, se captura una imagen digital del portaobjetos
de la muestra mediante un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital.
La imagen puede ser una completa del portaobjeto o una auto enfocada de cada pozo de
muestra, esta pasa un control de calidad para permitir un reconocimiento de patrones
preciso.
 Preprocesamiento: la imagen digital se preprocesa para mejorar el contraste y eliminar
cualquier ruido de fondo o artefactos que puedan interferir con el proceso de
reconocimiento de patrones. Este paso puede implicar filtrado, umbralización y otras
técnicas de procesamiento de imágenes.
 Reconocimiento de patrones: el sistema CAD analiza la imagen preprocesada utilizando
algoritmos de reconocimiento de patrones para identificar y clasificar los patrones de
fluorescencia presentes en el portaobjetos de la muestra. El sistema puede usar varias
características como intensidad, forma y textura para diferenciar entre diferentes
patrones.
  Clasificación de patrones: una vez que se han identificado y clasificado los patrones de
fluorescencia, el sistema CAD compara los resultados con una base de datos preexistente
de patrones ANA conocidos.
 Diagnóstico: finalmente, el sistema CAD produce un informe de diagnóstico basado en los
resultados de la clasificación. El informe puede incluir información sobre el patrón
observado, la intensidad de fluorescencia, la probabilidad de ciertas enfermedades y
recomendaciones para pruebas o seguimiento adicionales.

 Como herramientas los sistemas de diagnóstico asistido por computadora son una opción
cada vez más común en el análisis de pruebas ANA IFI, y presentan tanto ventajas como
desventajas que deben ser consideradas antes de su implementación.
Entre las principales ventajas que brinda esta herramienta se encuentran:
 Mayor eficiencia: los sistemas CAD pueden automatizar el proceso de reconocimiento de
patrones, lo que reduce significativamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para el
análisis manual.
 Precisión mejorada: los sistemas CAD eliminan la posibilidad de errores humanos, tales
como la fatiga o la subjetividad, y pueden proporcionar resultados consistentes y
confiables.
 Estandarización: los sistemas CAD pueden ayudar a estandarizar la interpretación de las
pruebas ANA IFI al proporcionar resultados consistentes en diferentes laboratorios y
analistas.
 Rentabilidad: los sistemas CAD pueden reducir la necesidad de contar con analistas
altamente capacitados, lo que puede ahorrar costos en términos de salarios y tiempo de
capacitación.
 En contraparte de estas ventajas esta herramienta cuenta con desventaja de las cuales estas
son las principales:
 Alcance de diagnóstico limitado: los sistemas CAD solo son capaces de reconocer
patrones específicos de fluorescencia, que pueden no cubrir todas las posibles
variaciones de los resultados de la prueba ANA IFI. Algunos patrones raros aún pueden
requerir una interpretación manual.
 Capacidad de generalización limitada: el rendimiento de los sistemas CAD puede estar
limitado al kit de prueba ANA IFI específico utilizado durante el entrenamiento del
algoritmo. Otros kits con diferentes sustratos o tintes pueden requerir más capacitación.
 Dependencia de la calidad de las imágenes: La calidad de las imágenes digitales puede
afectar la precisión de los resultados del sistema CAD. La mala calidad de la imagen,
como la borrosidad o la distorsión, puede provocar errores en el reconocimiento de
patrones.

 El sistema Aklides es el primer procesador semiautomático para la lectura de portaobjetos

ANA-IFI preparados y capaz de reconocer patrones de tinción. En lo que respecta a la
captura de imágenes, se emplea un enfoque automático basado en software que se apoya en
la caracterización de la textura de la imagen según el análisis de las variaciones de escala de
grises.
 Desde su primera versión, el sistema EUROPattern ha sido completamente automatizado
para el registro y archivo de imágenes de pruebas IFI, así como para la detección de
patrones nucleares y citoplasmáticos. Una vez que los portaobjetos se colocan en el
cargador del microscopio EUROPattern, las imágenes se capturan automáticamente
mediante una cámara a color. La identificación de patrones se facilita mediante la utilización
de una tinción de contraste rojo, específicamente el yoduro de propidio, que permite la
identificación de los núcleos celulares. Para la clasificación, se emplea el algoritmo k-vecino
más cercano, el cual se basa en una base de datos de entrenamiento compuesta por más de
5000 imágenes.
  El algoritmo de k-vecinos más cercanos, también conocido como k-NN, es un clasificador
de aprendizaje supervisado no paramétrico, que utiliza la proximidad para hacer
clasificaciones o predicciones sobre la agrupación de un punto de datos individual.
 Image Navigator es un sistema altamente especializado, Este software emplea algoritmos de
enfoque exclusivos para capturar cuatro imágenes por pocillo en un lapso de 25 segundos
por muestra, incluso en presencia de burbujas de aire. Interesantemente, este sistema no se
basa en la comparación de imágenes, sino que utiliza un algoritmo complejo para pre-
clasificar imágenes como negativas o positivas en las pantallas de revisión correspondientes.
 Helios es un procesador IFI altamente automatizado que realiza de manera completa el
procesamiento de diapositivas, la lectura y la discriminación positiva/negativa.
 El análisis de las imágenes capturadas se lleva a cabo mediante un algoritmo matemático
del software Helios, el cual analiza cada patrón IFI y ofrece una preclasificación sugerida
(positiva/negativa) basada en diversas variables, como el análisis de estructura, la
intensidad de fluorescencia y la proporción de fondo/células.
 El sistema NOVA View utiliza un microscopio digital automatizado que crea imágenes
digitales en color de alta resolución de áreas seleccionadas de los pocillos en el portaobjetos
del microscopio. Durante el proceso de escaneado, la platina mueve la diapositiva por
encima del objetivo y tiene lugar un proceso de enfoque. Este proceso de enfoque incluye
tomar fotografías con la cámara y analizar ciertas cualidades de la imagen, como la
intensidad de la luz y la pixelización.
 Es el sistema CAD más reciente de los seis mencionado en este artículo su lanzamiento fue
en el año 2018 por parte del grupo Menarini, el cómo este software analiza las muestras es
mediante algoritmo de reconocimiento y detención de patrones, apoyándose en la intensidad
de fluorescencia de la muestra para la discriminación positiva o negativa.

 Sistema de transporte y manejo de muestras: este módulo es responsable de mover las

muestras entre los distintos módulos de la plataforma automatizada. Puede incluir
componentes mecánicos y electrónicos como brazos robotizados, carruseles de muestras,
transportadores, entre otros, para garantizar un flujo de trabajo continuo y automatizado.
 Sistema de procesamiento de muestras: este módulo se encarga de dar las órdenes a los
otros sistemas. Puede incluir una plataforma de procesamiento motorizada, un sistema de
pipeteo y bombas, así como dispositivos para el manejo y almacenamiento de las muestras.
 Sistema de incubación y lavado: este módulo es responsable de realizar incubaciones y
lavados automáticos de las muestras. Puede incluir una plataforma de incubación y lavado
motorizada y controlada por software, así como dispositivos para el calentamiento,
enfriamiento y agitación de las muestras.
 Sistema de seguimiento y trazabilidad: este módulo identifica automáticamente las muestras
y registra los resultados. Incluye un lector de códigos de barras integrado, una base de datos
para el seguimiento y registro de los resultados, así como una interfaz de usuario para la
consulta y visualización de los datos.

 La evaluación de calidad es un proceso esencial para medir y valorar el desempeño de un

sistema o producto en relación con los estándares de calidad establecidos. En el contexto de
los sistemas CAD para las pruebas ANA IFI, la evaluación de calidad se enfoca en la
medición del rendimiento del sistema en términos de precisión, exactitud y fiabilidad en la
identificación de anticuerpos antinucleares en las muestras de los pacientes.
 ҉ La razón principal es que los mensurados, es decir, los anticuerpos, están formados por
una mezcla muy variable de diferentes moléculas en términos de reconocimiento de epítopos,
distribución de isotipos y subclases y grado de avidez.

 Norma especializada que establece los requisitos para la calidad y competencia de los
laboratorios clínicos que analizan muestras biológicas de origen humano.
 Se divide en dos partes: la gestión, que establece los requerimientos para la gestión de la
calidad, y la técnica, que detalla los requisitos para el personal, las instalaciones, el equipo,
la trazabilidad, la toma de muestra, los informes y el aseguramiento de la calidad.
 La norma ISO 15189:2013 El objetivo principal es acreditar resultados de alta calidad a los
laboratorios,
 Requisitos 5.5.1.2 y 5.5.1.3: Verificación y validación de los procesos analíticos. Esta sección
establece la necesidad de verificar y validar los métodos de ensayo, incluyendo los sistemas
CAD para las pruebas ANA IFI, para garantizar que sean adecuados para su uso previsto y
que cumplan con los requisitos de calidad establecidos.
 Requisito 5.5.1.4: Incertidumbre de medida. Esta sección establece la necesidad de evaluar
la incertidumbre de medida para los resultados de las pruebas, incluyendo los resultados
generados por los sistemas CAD de pruebas ANA IFI, para garantizar que sean precisos y
confiables.
 Requisito 5.6.2: Control de calidad interno. Esta sección establece la necesidad de
implementar controles de calidad interno para monitorear el desempeño de los sistemas de
ensayo, incluyendo los sistemas CAD para las pruebas ANA IFI, y detectar posibles
problemas en la calidad de los resultados.
 Requisito 5.6.3: Evaluación de la calidad externa. Esta sección establece la necesidad de
participar en programas de evaluación de la calidad externa para monitorear el desempeño
de los sistemas de ensayo, incluyendo los sistemas CAD para las pruebas ANA IFI, y
comparar los resultados con otros laboratorios para identificar oportunidades de mejora.

 Es el conjunto de actividades realizadas por el personal del laboratorio para verificar de

forma continuada el trabajo y los resultados que se van obteniendo.
 En este modelo la gestión o tratamiento estadístico de los resultados de control se realiza
única y exclusivamente con los datos obtenidos por el propio laboratorio.
 el uso exclusivo de materiales de control de calidad interno (CCi) proporcionados por los
fabricantes de los kits de diagnóstico no siempre resalta todos los posibles errores analíticos,
ya que las muestras de CCi suelen estar listas para usar y no requieren dilución previa como
las muestras de pacientes de rutina. Además, algunos efectos aparentemente triviales, como
la eficiencia del conjugado, pueden no ser evidentes utilizando muestras de CCi asociadas
con los valores de IF más altos, sino solo con aquellas con valores de IF alrededor del límite
de positividad. Para una evaluación de calidad más adecuada, se ha propuesto la
introducción de indicadores adicionales, como la evaluación de la mediana de los resultados
de la IF de muestras CCi obtenidas de sueros de pacientes agrupados, y el seguimiento del
porcentaje de resultados positivos de ANA IFI en la sesión analítica.