PRÁCTICA 7

EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y CROMATOGRAFÍA DE LOS LÍPIDOS DEL HUEVO

OBJETIVO
Objetivo general
Extraer los lípidos de la yema del huevo, con diclorometano y evaluar el contenido de lípidos insaturados y colesterol en el extracto, así como
identificar cromatográficamente los componentes lipídicos extraídos.
Objetivos conductuales
Durante la sesión práctica el estudiante deberá:
Extraer los lípidos de la yema del huevo por:
 separación de la yema de la clara;
 extracción líquido-líquido usando diclorometano.
Analiza cualitativa y cuantitativamente el extracto en diclorometano mediante:
 la cromatografía de capa fina en mezcla de cloroformo:metanol:amoniaco (75:25:4) revelando con vapores de yodo;
 la determinación de esteroles por el método de Liebermann-Burchard; y
 la determinación de lípidos insaturados por el método de Sulfo-fosfo-vainillina.
Posteriormente la sesión práctica el estudiante deberá ser capaz de:
Comparar los resultados obtenidos por los diferentes grupos.

MARCO TEÓRICO
Generalidades sobre Lípidos
Los lípidos constituyen un conjunto de biomoléculas que presentan muy baja solubilidad en agua y pueden extraerse de los materiales
biológicos por medio de solventes orgánicos de baja polaridad (éter de petróleo, éter etílico, hexano, cloroformo, por ejemplo).
Aparecen principalmente en:
 las membranas biológicas (tanto en la membrana celular como en las de las diferentes organelas);
 material de reserva energética en las células adiposas, de los organismos pluricelulares y polisistémicos o bajo forma de gotas
aceitosas en algunos seres unicelulares aunque sus funciones son mucho más variadas.
Entre los lípidos están los ácidos grasos libres (saturados e insaturados), los glicéridos (acilglicéridos, fosfoglicéridos) y otros tipos de
fosfolípidos, ceras, esteroides, etc.
Debido a su insolubilidad en agua, los lípidos presentes en las estructuras biológicas se encuentran generalmente asociados a otras
biomoléculas como proteínas e hidratos de carbono.
Los lípidos son uno de los mayores constituyentes de los alimentos, y son muy importantes pues, entre otras razones, constituyen la mayor
fuente de energía y proveen lípidos esenciales. Sin embargo, el consumo en exceso puede ir en detrimento de la salud.
En muchos alimentos los lípidos juegan un papel determinante en las características físicas del producto, tales como sabor, textura, apariencia,
palatabilidad, etc.

Características de los Lípidos y su Extracción y Separación

Aunque los lípidos se consideran sustancias hidrofóbicas o apolares, presentan diferente grado de polaridad:
 los triglicéridos totalmente apolares, no tienen ningún grado de interacción con el agua,
 los fosfolípidos son moléculas bipolares e interactúan con el agua formando monocapas, bicapas y micelas; y
 el colesterol es también una molécula bipolar debido al grupo OH unido a su anillo esteroidal.
Así, por ejemplo, la acetona extrae principalmente triglicéridos y colesterol, ya que los fosfolípidos son poco solubles en acetona.
Se han descrito varios métodos para efectuar los extractos lipídicos. Todos se caracterizan porque deben destruir la estructura celular con
soluciones que desarticulan las membranas a la vez que precipitan las proteínas y algunos polisacáridos; posteriormente, con los solventes
de poca polaridad, se da la extracción propiamente dicha.
Aprovechando la solubilidad diferencial de los lípidos se puede realizar una extracción fraccionada con distintos solventes, lo que permite a
la vez la separación de los diferentes lípidos.
Alternativamente, se pueden extraer lípidos totales con diclorometano (CH2Cl2) o con una mezcla de metanol:éter (1:1) y separarlos
posteriormente por cromatografía de adsorción en capa fina.

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Análisis Cualitativo de Lípidos
Debido a la variedad estructural de las sustancias que caen en esta definición, la única prueba para sospechar que una sustancia es un lípido
lo es su condición de extractable con los solventes orgánicos de escasa polaridad.
Una vez extraídos los lípidos, se puede iniciar su caracterización separándo sus componentes por cromatografía.
Cromatografía de adsorción en capa fina
La separación de los componentes de una mezcla por cromatografía de adsorción se basa en:
1. El grado en que cada componente es adsorbido a un soporte sólido (fase estacionaria).
2. La solubilidad de cada componente en una combinación de solventes de diferente polaridad, que se hace pasar por el soporte sólido (fase
móvil).
El soporte sólido debe ser los suficientemente poderoso (activo) para retener la mayor cantidad de sustancia. Por ejemplo, el gel de sílice se
utiliza como soporte sólido para sustancias apolares como los lípidos
El grado de adsorción de cada sustancia es variable, así por ejemplo un fosfolípido con un grupo bastante polar será más retenido que el
colesterol libre con un grupo menos polar y éste más retenido que los triglicéridos. De esta manera, el fosfolípido y el colesterol migran más
lentamente que los triglicéridos, haciendo posible su separación.
Para la identificación de los diferentes lípidos se usan patrones o estándar de la sustancia pura y se reconocen por comparación de sus Rf.

Distancia recorrida por la sustancia (x) Frente de solvente

Rf = ——————————————————
Distancia recorrida por el solvente (s)
s
El Rf es una constante para cada sustancia en las x
condiciones establecidas.
Punto de aplicación

Para la cromatografía de adsorción se usan placas de vidrio de 20 x 20 cm, cubiertas con una capa fina (+ 0,25 mm) de gel de sílice (Silica
gel G), formada a partir de una pasta fluida (10 g de Silica gel G + 20 ml de agua destilada). La placa es posteriormente deshidratada o
activada colocándola a 120ºC por 30 minutos. También se pueden utilizar cromatofolios con capas delgadas de gel de sílice con soporte de
aluminio o plástico, los cuales se pueden manipular fácilmente y obtener placas del tamaño que se desee debido a que se pueden cortar
fácilmente.
El revelado del cromatograma se puede hacer de diversas maneras. En el caso de los lípidos, se usan los vapores de yodo que interaccionan
ya sea disolviéndose o formando complejos de transferencia de carga con la mayoría de las sustancias orgánicas dando a la mancha un tono
entre amarillo y marrón sobre el fondo amarillo pálido de la placa. Esta mancha se puede estabilizar nebulizando sobre el cromatograma con
iodo una solución de almidón diluido para producir el azul característico de la reacción de Lugol (Sherma & Fried, 2005).
Otro revelador es el ácido fosfomolíbdico al 10% en etanol que se nebuliza sobre la placa cromatográfica y genera una coloración azul verdosa
por la formación del azul de molibdeno como producto reducido.
Análisis Cualitativo de Lípidos
No existe una prueba que formalmente pueda determinar el contenido de lípidos totales. Lo más cercano, sería un análisis gravimétrico por
extracción con un solvente o mezcla de solventes (tales como, diclorometano, mezclas de metanol y eter etílico) de una cantidad conocida
de la matriz inicial y la eliminación posterior del solvente (por evaporación al vacío con recuperación, destilación, etc.) para finalmente pesar
el residuo extraído. Esta metodología puede tener errores positivos por la extracción de sustancias no lipídicas y no volátiles, solubles en el
solvente escogido y errores negativos por la perdida por evaporación o arrastre de lípidos volátiles o por su descomposición durante el
proceso.
En realidad, las pruebas que generalmente se utilizan para análisis cuantitativo de lípidos se limitan a subgrupos de los mismos.
Reacción de Sulfo-Fosfo-Vainillina para Lípidos Insaturados (Knight et al, 1972)
Una prueba muy usada es la reacción de la muestra con lípidos con vainillina en un medio ácido para obtener compuestos de coloración roja.
La reacción de sulfo-fosfo-vainillina se da en dos etapas: la digestión del extracto de lípidos con ácido sulfúrico concentrado y la reacción del
material tratado con el ácido con la fosfo-vainillina.
En realidad, la reacción tiene varias etapas:
1. Los compuestos insaturados reaccionan con el ácido sulfúrico para formar un ión carbonio.

H H H H
| | | |
—C═C— + H2SO4 —C—C— + HSO4
| 

2
2. La vainillina reacciona con el ácido fosfórico para formar un éster aromático de fosfato que se isomeriza

OH OPO3H2 OPO3H2
OCH3 OCH3 OCH3

+ H3PO4

C=O C=O C—O

| | |
H H H
3. El ión carbonio (que se representa como Rreacciona con el isómero del carbonilo activado de la fosfovainillina y se vuelve a
isomerizar para dar el color.

OPO3H2 OPO3H2
OPO3H2
OCH3 OCH3
OCH3
+ (R)

C—O—R C—O—R
C—O
| |
|
H H
H

Aunque la prueba es para lípidos insaturados (esteroles, ácidos grasos insaturados, triglicéridos o fosfoglicéridos enólicos); algunos
compuestos lipídicos constituidos por ácidos grasos saturados, pueden dar esta reacción como consecuencia del tratamiento con ácido
sulfúrico concentrado en caliente a que son sometidos. Cómo puede concluirse, esta reacción se ha usado para determinar “lípidos totales”
(McMahon et al, 2013).
En la figura siguiente (Knight et al, 1972), puede notarse que el que más color da es el ácido oleico (un insaturado), seguido de la trioleína
(un triglicérido con tres ácidos oleicos), estándar Dade (una mezcla de ácido oleico, esteárico y palmítico), una mezcla 70:30 de ácido
oleico:ácido esteárico), colesterol, y al aceite de oliva. Mas por abajo, tenemos la fosfatidilcolina y muy por debajo los ácidos esteárico y
palmítico (ambos saturados), la tripalmitina y el glicerol.

Ácido oleico
0.60
Trioleina
Mezcla de ácidos oleico, esteárico y palmítico (Dade Total Lipids Standard).
0.50 Mezcla de 70% ácido oleico y 30%ácido esteárico
Colesterol
Absorbancia a 525 nm

Aceite de oliva
0.40

0.30
Fosfatidil colina

0.20

0.10
Mezcla de Acido esteárico, ácido palmítico, tripalmitina y glicerol
0 250 500 750 1000
mg/100 mL

Para aproximarse a una determinación de lípidos totales, lo que se hace normalmente es preparar una mezcla que tenga lo composición
media esperada de la matriz que se analiza.

Reacción de Liebermann-Burchard para Colesterol (Burke et al, 1974)

Una clase de lípidos de gran importancia es la de los esteroides. Estos poseen diversas funciones que van desde la hormonal (progesterona
y testosterona) hasta la de participación en membranas (colesterol), dándole a éstas rigidez y baja permeabilidad.
La identificación de dichos compuestos se lleva a cabo con la prueba de Libermann-Bouchard, que se basa en la obtención de compuestos
coloreados (variando del verde al azul oscuro) al agregarle ácido sulfúrico a una solución del esterol en anhídrido acético
Existen dos reacciones de oxidación de colesterol que dan derivados coloreados y que se han usado desde hace mucho tiempo para la
determinación de dicho esterol. Ambas se basan en la oxidación por pasos del colesterol y se diferencian en el reactivo oxidante.

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Ambas reacciones utilizan ácido acético en presencia de ácido sulfúrico que dan origen a la formación del ion carbonio del 3,5 colestadieno.
En el caso de la reacción de Zak, el reactivo contiene Fe+3 que promueve la formación del catión dienílico, luego del catión trienílico y finalmente
el catión tetraenílico, consumiéndose 5 Fe+3 por cada molécula de colesterol, para formar 5 Fe+2 y el catión tetraenílico.

+ Fe+2 +
ZAK + +

Catión dienílico Catión trienílico Catión tetraenilico

Fe+3
( max = 412 nm) ( max = 478 nm) ( max = 563 nm)

HOAc/H2SO4 Ac2O
+
HO (SO3)
Colesterol Ión carbonio del 3,5-dieno + + SO2

LIEBERMANN- HO3S
BURCHARD Catión pentaenílico
Ácido colestahexaen sulfónico
( max = 410 nm)
( max = 620 nm)

En el caso de la reacción de Liebermann-Burchard, en lugar del ion Fe+3, se utiliza anhídrido acético que promueve la formación de SO3 a
partir del ácido sulfúrico. El SO3 actúa como oxidante para formar el catión pentaenílico y terminar con un ácido sulfónico del colestahexaeno.
En dicha reacción se consumen 4 SO3 por molécula de colesterol para formar 3 SO2 y ácido sulfónico del colestahexaeno.
Análisis de Fosfolípidos
Finalmente, otros constituyentes de la membrana de gran importancia son los fosfolípidos. Dada su anfipaticidad, estos compuestos son
ideales para la estructuración de la doble capa de lípidos.
Una forma sencilla de determinar la presencia o ausencia de un fosfolípido en una muestra (aunque no es definitiva) es la determinación de
fósforo en la misma. Para esto el fosfolípido se mineraliza por oxidación con ácidos concentrados (perclórico y nítrico). Una vez ocurrida la
mineralización, el fosfato orgánico se transforma en fosfato inorgánico y se determina por medio de la formación de complejos derivados del
heptamolibdato de amonio en medio ácido y su posterior reducción y formación del complejo azul de molibdeno.

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MATERIALES Y REACTIVOS
Lista de Materiales
NOTA: Cada equipo debe traer un huevo fresco.
NOTA: Los EQUIPOS son de dos personas y los GRUPOS se estimaron con 8 equipos (16 personas).

MATERIALES POR EQUIPO POR GRUPO

Baño de agua a 37°C 1 1

Botella de aspersión de niebla para revelador 1 1
Cámara cromatográfica para placas de 20 cm X 20 cm 1 4
Cámara de revelado para placas de 20 cm X 20 cm 1 4
Cámara para visualización con luces de longitud de onda variada 1 1
Cubetas para espectrofotómetro 2 8
Embudo separador de 250 mL de capacidad 2 16
Espectrofotómetro capaz de leer a 650 nm 1 4
Gradilla para tubos de ensayo de 16 X 100 mm 1 8
Microcapilares 6 48

Micropipeteador de 10 a 100 L de capacidad 1 4

Pipeta graduada de 10.00 mL de capacidad 1 8

Placa cromatográfica de 20 cm X 20 cm 1 8
Probeta de 100 mL de capacidad 1 8
Probeta de 25 mL de capacidad 1 8
Tubos de ensayo de 16 X 100 mm 10 80

Lista de Reactivos

MATERIAL POR EQUIPO POR GRUPO

Ácido acético glacial 10 mL 100 mL

Ácido sulfúrico concentrado 10 mL 100 mL
Diclorometano 100 mL 1000 mL
Mezcla cloroformo : metanol : amoníaco (75:25:4) 75 mL 300 mL
Reactivo de ácido fosfomolíbdico al 10% p/v en etanol absoluto 2 mL 20 mL
Reactivo de Fosfo-Vainillina 30 mL 300 mL
Reactivo de Liebermann-Bouchard 75 mL 600 mL
Solución de 20 mg/mL de ácido esteárico en diclorometano 2 mL 10 mL
Solución de 20 mg/mL de ácido oleico en diclorometano 2 mL 10 mL
Solución de 20 mg/mL de colesterol en diclorometano 2 mL 10 mL
Solución de 20 mg/mL de lecitina en diclorometano 2 mL 10 mL
Solución de 20 mg/mL de tripalmitina en diclorometano 2 mL 10 mL
Solución patrón de 1 mg/mL de colesterol en etanol absoluto 2 mL 10 mL
Solución patrón de 10 mg/mL de colesterol en ácido acético glacial 2 mL 10 mL
Yodo en cristales 10 g 40 g

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Preparación de Reactivos
Mezcla cloroformo : metanol : amoniaco (75:25:4)
PELIGRO: La mezcla cloroformo : metanol : amoniaco, CHCl3:CH3OH:NH4OH, es un líquido inflamable con toxicidad oral, por inhalación, cutánea y
ocular. Su ingestión es nociva, pudiendo provocar náuseas, vómitos y daños en todo el tracto digestivo. Su inhalación es nociva con irritación de
mucosas, fuerte irritación y daños al tracto respiratorio. El contacto con la piel puede provocar fuerte irritación dérmica con dermatitis, efecto
desengrasante y resquebrajante, quemaduras y necrosis. El contacto con los ojos es nocivo con posible fuerte irritación ocular grave con riesgo de
ceguera. También puede presentar toxicidad aguda acuática.

En una botella de vidrio de 1 L de capacidad coloque 675 mL de cloroformo, 225 mL de metanol y 36 mL de amoniaco concentrado.
PELIGRO: El cloroformo, CHCl3, es un líquido denso (1.48 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular, tóxico, que puede provocar somnolencia y
vértigo. Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda; DL50 rata 685 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar
que puede causar edema pulmonar y neumonía (categoría 4). La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación estimada 0,5
mg/L, aerosol) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria (categoría 3). El contacto con la piel puede ser nocivo
(toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 3980 mg/Kg) y provoca ligera irritación cutánea con acción desengrasante y resquebrajante (categoría 2). El
contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer (carcinogenecidad categoría 2). Presenta toxicidad
específica al hígado y riñón tras exposiciones repetidas (categoría 1).

PELIGRO: El metanol, CH3OH, es un líquido inflamable (categoría 2), tóxico, irritante cutáneo y ocular. Su ingestión puede ser nociva (toxicidad
oral aguda; LDLO hombre 143 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que puede causar edema pulmonar y
neumonía (categoría 3). La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación CL50 ratas 131.25 mg/L, 4 horas, vapor) y provoca
también irritación de las mucosas (categoría 3). El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 conejo 17500 mg/Kg) y
provoca ligera irritación cutánea con acción desengrasante y resquebrajante (categoría 3). El contacto con los ojos muestra toxicidad ocular en
exposición única (categoría 1) y provoca ligera irritación ocular.

PELIGRO: El amoniaco o hidróxido de amonio concentrado, NH4OH, es un líquido corrosivo a metales (categoría 1), tóxico, corrosivo cutáneo y
ocular. Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda; LDLO hombre 43 mg/Kg) y provoca dolores de estómago, vómitos sanguinolentos,
quemaduras severas en boca y garganta y peligro de perforación de esófago y estómago. La inhalación de sus vapores provoca también irritación
de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, bronquitis con toxicidad específica por exposición única al sistema respiratorio (categoría 3). El
contacto con la piel provoca fuerte irritación cutánea, dermatitis, quemaduras y necrosis (categoría 1B). El contacto con los ojos provoca fuerte
irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera. También muestra toxicidad aguda acuática (categoría 1).

ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio.

ALMACENAMIENTO: Guarde a temperatura ambiente.
Reactivo de ácido fosfomolíbdico al 10% p/v en etanol absoluto
PELIGRO: El ácido fosfomolíbdico, H3[P(Mo3O10)4P]•xH2O, al 10% en etanol absoluto, C2H5OH, es una mezcla líquida inflamable, al igual que sus vapores
(categoría 2), y comburente (categoría 3). Su ingestión es nociva y puede provocar severas quemaduras de boca y garganta, así como peligro de
perforación el esófago y estómago. La inhalación de sus vapores provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible
daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel provoca fuerte irritación cutánea y quemaduras (categoría 1B). El contacto con los ojos provoco
fuerte irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera.

Coloque 10 g de ácido fosfomolíbdico en un beaker de 150 mL y agregue 80 mL etanol absoluto

PELIGRO: El ácido fosfomolíbdico, H3[P(Mo3O10)4P]•xH2O, es un sólido corrosivo cutáneo. Su ingestión es nociva y provoca severas quemaduras
de boca y garganta, así como peligro de perforación el esófago y estómago. La inhalación de sus vapores provoca también irritación de las mucosas,
tos, insuficiencia respiratoria, con posible daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel provoca fuerte irritación cutánea y quemaduras
(categoría 1B). El contacto con los ojos provoco fuerte irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera.

PELIGRO: El etanol absoluto, C2H5OH, es un líquido inflamable (categoría 2). Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata 10740
mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus
vapores puede ser nociva (toxicidad oral aguda CL50 rata 124.7 mg/L; 4h) provocando leve irritación en las mucosas. El contacto con la piel no es
irritante a no ser que haya exposición prolongada que tiene efecto desengrasante. El contacto con los ojos puede provocar irritación ocular grave
(categoría 2).

Mezcle bien hasta disolver todo el ácido, transfiera a una probeta de 100 mL y afore a 100 mL con etanol absoluto.
ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio oscura con gotero.
ALMACENAMIENTO: Guarde a temperatura ambiente, es estable por varias semanas.
Reactivo de fosfo-vainillina
PELIGRO: El reactivo de fosfo-vainillina, por su alto contenido de ácido fosfórico, H3PO4 al 68%, es líquido que causa corrosión en metales (categoría
1) y en la piel (categoría 1B) y provoca lesiones oculares graves. Su ingestión provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro
de perforación del esófago y del estómago y dolor. La inhalación de sus vapores provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria,
con posible daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel provoca fuerte irritación cutánea y quemaduras (categoría 1B). El contacto con los ojos
provoca irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera.

Disuelva 0.6 g de vainillina en 8 a 10 mL de etanol absoluto y diluya a 100 mL con agua destilada.
ATENCIÓN: La vainillina, (CH₃O)(OH)C₆H₃CHO, es un irritante ocular (categoría 2). Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata
≥ 4200 mg/Kg). No se tiene información del efecto de la inhalación de sus vapores. El contacto con la piel no es irritante y la toxicidad cutánea
aguda es > 5010 mg/Kg.. El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2).

PELIGRO: El etanol absoluto, C2H5OH, es un líquido inflamable (categoría 2). Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata 10740
mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus
vapores puede ser nociva (toxicidad oral aguda CL50 rata 124.7 mg/L; 4h) provocando leve irritación en las mucosas. El contacto con la piel no es
irritante a no ser que haya exposición prolongada que tiene efecto desengrasante. El contacto con los ojos puede provocar irritación ocular grave
(categoría 2).

Agregue a la dilución anterior, poco a poco y con agitación constante, 400 mL de ácido fosfórico al 85%.
PELIGRO: El ácido fosfórico (H3PO4) al 85% puede ser corrosivo para metales (categoría 1) y provoca quemaduras graves en la piel (categoría 1B)
y lesiones oculares graves. Presenta toxicidad aguda por inhalación provocando irritación y corrosión de las mucosas, tos, dolor e insuficiencia

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 respiratoria. Es altamente irritante y corrosivo al contacto con la piel, provocando quemaduras. El contacto con los ojos resulta en irritación ocular,
conjuntivitis y lesiones oculares graves con riesgo de ceguera. Si es ingerido, provoca quemaduras severas en la boca y garganta, así como
perforación del estómago y el esófago, con dolor.

ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar.

ALMACENAMIENTO: Guarde en la oscuridad a temperatura ambiente.
Reactivo de Liebermann-Bouchard (Kim & Golberg, 1974)
PELIGRO: El reactivo de Liebermann-Bouchard es una mezcla de anhídrido acético: ácido acético glacial : ácido sulfúrico (22:20:3) y por lo tanto tiene
los peligros combinados de sus componentes. Es un liquido inflamable y comburente con toxicidad oral, cutánea y por inhalación. Su ingestión es nociva
y puede provocar severas quemaduras de boca y garganta, así como peligro de perforación el esófago y estómago, trastornos gastrointestinales, vómito
sanguinolento y posible obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es también nociva y provoca también irritación
de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel es nocivo y provoca corrosión cutánea y
quemaduras. El contacto con los ojos provoca fuerte irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera.

En una botella ámbar de 500 mL con tapon plástico agregue 220 mL de anhídrido acético frío y 200 mL de ácido acético glacial a
temperatura ambiente.
PELIGRO: El anhídrido acético, (CH3CO)2O, es un líquido inflamable, al igual que sus vapores (categoría 3 y comburente (categoría 3), con toxicidad
oral. cutánea y por inhalación. Su ingestión es nociva (toxicidad oral aguda, DL50 rata 630 mg/Kg; categoría 4) y puede provocar severas quemaduras
de boca y garganta, así como peligro de perforación el esófago y estómago, trastornos gastrointestinales, vómito sanguinolento y posible obstrucción
pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es también nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL50 rata >0,5 a <2 mg/L, 4
h, vapor; categoría 2) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible daño del tracto respiratorio. El contacto
con la piel es nocivo (toxicidad cutánea aguda, DL50 conejo, 4320 mg/Kg) y provoca corrosión cutánea y quemaduras (categoría 1B). El contacto
con los ojos provoca fuerte irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera.

PELIGRO: El ácido acético glacial, CH3CO2H, es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría
1). Su ingestión es nociva (toxicidad oral aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro
de perforación del esófago y del estómago; náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación
de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia
respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea
grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

Tape la botella, mezcle por inversión y agregue a la mezcla 30 mL de ácido sulfúrico concentrado frío.
PELIGRO: El ácido sulfúrico concentrado, H2SO4, es un líquido altamente corrosivo a metales (categoría 1) y a la piel (categoría 1A). Su ingestión
puede provocar severas quemaduras de boca y garganta, así como peligro de perforación el esófago y estómago, trastornos gastrointestinales,
vómito sanguinolento y posible obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores puede provocar irritación de las
mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea y quemaduras
severas (categoría 1A). El contacto con los ojos provoca fuerte irritación ocular, con lesiones oculares graves con quemaduras y daño a la córnea
con riesgo de ceguera.

Tape la botella, mezcle por inversión y guarde.

ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.
ALMACENAMIENTO: Si se guarda en refrigeración (4°C a 7°C), el reactivo es estable por 6 meses.
Solución de ácido esteárico en diclorometano de 20 mg/mL
PELIGRO: La solución de ácido esteárico en diclorometano, por su alto contenido de diclorometano presenta los mismos riesgos que el diclorometano.
Esta mezcla es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría 1). Su ingestión es nociva (toxicidad
oral aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro de perforación del esófago y del estómago;
náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por
inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el
tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto
con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

En un balón aforado de 25 mL, coloque 500 mg de ácido esteárico y 20 mL de diclorometano.

NOTA: El ácido esteárico, CH3(CH2)16CO2H, no está clasificado como una sustancia peligrosa.

ATENCIÓN: El diclorometano, CH2Cl2, es un líquido denso (1.33 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular que puede provocar somnolencia y vértigo.
Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que
puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL50 rata 60.14 mg/L, 17250
ppm; 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas. El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 2000
mg/Kg) y provoca irritación cutánea (categoría 2). El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer
(carcinogenecidad categoría 2). Presenta toxicidad específica al sistema nervioso central (categoría 3).

Una vez disuelto todo el ácido esteárico, afore a la marca con diclorometano.
ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.
ALMACENAMIENTO: Esta solución es estable por varias semanas.
Solución de ácido oleico en diclorometano de 20 mg/mL
PELIGRO: La solución de ácido oleico en diclorometano, por su alto contenido de diclorometano presenta los mismos riesgos que el diclorometano.
Esta mezcla es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría 1). Su ingestión es nociva (toxicidad
oral aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro de perforación del esófago y del estómago;
náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por
inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el
tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto
con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

En un balón aforado de 25 mL, coloque 500 mg de ácido oleico y 20 mL de diclorometano.

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 NOTA: El ácido oleico, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO2H, no está clasificado como una sustancia peligrosa.

ATENCIÓN: El diclorometano, CH2Cl2, es un líquido denso (1.33 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular que puede provocar somnolencia y vértigo.
Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que
puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL50 rata 60.14 mg/L, 17250
ppm; 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas. El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 2000
mg/Kg) y provoca irritación cutánea (categoría 2). El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer
(carcinogenecidad categoría 2). Presenta toxicidad específica al sistema nervioso central (categoría 3).

Una vez disuelto todo el ácido oleico, afore a la marca con diclorometano.
ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.

ALMACENAMIENTO: Esta solución es estable por varias semanas.

Solución de colesterol en diclorometano de 20 mg/mL

PELIGRO: La solución de colesterol en diclorometano, por su alto contenido de diclorometano presenta los mismos riesgos que el diclorometano. Esta
mezcla es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría 1). Su ingestión es nociva (toxicidad oral
aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro de perforación del esófago y del estómago;
náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por
inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el
tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto
con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

En un balón aforado de 25 mL, coloque 500 mg de colesterol y 20 mL de diclorometano.

NOTA: El colesterol, C27H46O, no está clasificado como una sustancia peligrosa.

ATENCIÓN: El diclorometano, CH2Cl2, es un líquido denso (1.33 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular que puede provocar somnolencia y vértigo.
Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que
puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL50 rata 60.14 mg/L, 17250
ppm; 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas. El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 2000
mg/Kg) y provoca irritación cutánea (categoría 2). El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer
(carcinogenecidad categoría 2). Presenta toxicidad específica al sistema nervioso central (categoría 3).

Una vez disuelto todo el colesterol, afore a la marca con diclorometano.

ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.
ALMACENAMIENTO: Esta solución es estable por varias semanas.
Solución de lecitina en diclorometano de 20 mg/mL
PELIGRO: La solución de lecitina en diclorometano, por su alto contenido de diclorometano presenta los mismos riesgos que el diclorometano. Esta
mezcla es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría 1). Su ingestión es nociva (toxicidad oral
aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro de perforación del esófago y del estómago;
náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por
inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el
tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto
con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

En un balón aforado de 25 mL, coloque 500 mg de lecitina y 20 mL de diclorometano.

NOTA: La lecitina, 1,2-diacil-fosfatidil-colina, no está clasificada como una sustancia peligrosa.

ATENCIÓN: El diclorometano, CH2Cl2, es un líquido denso (1.33 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular que puede provocar somnolencia y vértigo.
Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que
puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL50 rata 60.14 mg/L, 17250
ppm; 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas. El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 2000
mg/Kg) y provoca irritación cutánea (categoría 2). El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer
(carcinogenecidad categoría 2). Presenta toxicidad específica al sistema nervioso central (categoría 3).

Una vez disuelta toda la lecitina, afore a la marca con diclorometano.

ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.
ALMACENAMIENTO: Esta solución es estable por varias semanas.
Solución de tripalmitina en diclorometano de 20 mg/mL
PELIGRO: La solución de tripalmitina en diclorometano, por su alto contenido de diclorometano presenta los mismos riesgos que el diclorometano. Esta
mezcla es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría 1). Su ingestión es nociva (toxicidad oral
aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro de perforación del esófago y del estómago;
náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por
inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el
tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto
con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

En un balón aforado de 25 mL, coloque 500 mg de tripalmitina y 20 mL de diclorometano.

NOTA: La tripalmitina, C51H92O6, no está clasificada como una sustancia peligrosa.

ATENCIÓN: El diclorometano, CH2Cl2, es un líquido denso (1.33 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular que puede provocar somnolencia y vértigo.
Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que
puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL50 rata 60.14 mg/L, 17250
ppm; 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas. El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 2000
mg/Kg) y provoca irritación cutánea (categoría 2). El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer
(carcinogenecidad categoría 2). Presenta toxicidad específica al sistema nervioso central (categoría 3).

8
Una vez disuelta toda la tripalmitina, afore a la marca con diclorometano.
ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.
ALMACENAMIENTO: Esta solución es estable por varias semanas.
Solución patrón de ácido oleico en etanol absoluto de 1 mg/mL
PELIGRO: La solución patrón de ácido oleico en etanol absoluto, por su alto contenido de etanol absoluto presenta los mismos riesgos que este solvente.
(categoría 2). Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata 10740 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al
vomitar que puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores puede ser nociva (toxicidad oral aguda CL50 rata 124.7 mg/L; 4h)
provocando leve irritación en las mucosas. El contacto con la piel no es irritante a no ser que haya exposición prolongada que tiene efecto desengrasante.
El contacto con los ojos puede provocar irritación ocular grave (categoría 2).

En un balón aforado de 100 mL coloque 100 mg de colesterol y 80 mL de etanol absoluto.

NOTA: El ácido oleico, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO2H, no está clasificado como una sustancia peligrosa.

PELIGRO: El etanol absoluto, C2H5OH, es un líquido inflamable (categoría 2). Su ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata 10740
mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que puede causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus
vapores puede ser nociva (toxicidad oral aguda CL50 rata 124.7 mg/L; 4h) provocando leve irritación en las mucosas. El contacto con la piel no es
irritante a no ser que haya exposición prolongada que tiene efecto desengrasante. El contacto con los ojos puede provocar irritación ocular grave
(categoría 2).

Una vez disuelto todo el ácido oleico, afore a la marca con etanol absoluto.
ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.
ALMACENAMIENTO: Si se guarda en refrigeración (4°C a 7°C), el reactivo es estable por varias semanas.
Solución patrón de colesterol en ácido acético glacial de 10 mg/mL
PELIGRO: La solución patrón de colesterol en ácido acético glacial, por su alto contenido de ácido acético glacial presenta los mismos riesgos que el
ácido acético glacial. Esta mezcla es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría 1). Su ingestión
es nociva (toxicidad oral aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro de perforación del
esófago y del estómago; náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación de sus vapores es nociva
(toxicidad aguda por inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, pulmonía,
bronquitis, edemas en el tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea grave y quemaduras
(categoría 1A). El contacto con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

En un balón aforado de 100 mL coloque 1.000 g de colesterol y 80 mL de ácido acético glacial.

NOTA: El colesterol, C27H46O, no está clasificado como una sustancia peligrosa.

PELIGRO: El ácido acético glacial, CH3CO2H, es un líquido inflamable y genera vapores inflamables (categoría 3), corrosivo para metales (categoría
1). Su ingestión es nociva (toxicidad oral aguda, DL50 rata 3310 mg/Kg) y provoca quemaduras severas de la boca y la garganta, así como peligro
de perforación del esófago y del estómago; náusea, vómitos con posible riesgo de obstrucción pulmonar tras aspiración del vómito. La inhalación
de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, LCLO rata 39 mg/L, 4 horas) y provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia
respiratoria, pulmonía, bronquitis, edemas en el tracto respiratorio; los síntomas pueden retrasarse. El contacto con la piel provoca corrosión cutánea
grave y quemaduras (categoría 1A). El contacto con los ojos provoca lesiones oculares graves con riesgo de turbidez en la córnea y ceguera.

Una vez disuelto todo el colesterol, afore a la marca con ácido acético glacial (ver Ácido Acético Glacial en este apartado).
ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio ámbar con tapón de plástico.

ALMACENAMIENTO: Si se guarda en refrigeración (4°C a 7°C), el reactivo es estable por una semana.

Yodo en cristales
PELIGRO: El yodo, I2, en cristales aguda por inhalación y contacto con la piel y toxicidad específia oral a la glandula tiroides (categoría 1) y por inhalación
al sistema respiratorio (categoría 3). Su ingestión es nociva (toxicidad oral aguda, DL50 rata 14000 mg/Kg; categoría 4) y puede provocar gusto metálico,
diarrea sangrienta y colapso cirulatorio. La inhalación de polvo/niebla es nociva (toxicida aguda por inhalación CL50 rata > 4,588 mg/L; 4 h; polvo/niebla;
categoría 4) y puede provocar irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel es
nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 conejo 1425 mg/Kg por absorción; categoría 3) y provoca irritación cutánea y posible dermatitis (categoría 2). El
contacto con los ojos provoca irritación ocular grave con quemaduras y daño a la córnea con riesgo de ceguera. También muestra toxicidad aguda
acuática (categoría 1).

ENVASADO: Coloque en una botella de vidrio.

ALMACENAMIENTO: Guarde a temperatura ambiente.

9
PROCEDIMIENTO:
Extracción de los lípidos de la yema del huevo
Separe cuidadosamente la clara de la yema de un huevo en forma manual.
Transfiera la yema a un beaker tarado y pésela con precisión a la centésima de gramo.
PESO DE LA YEMA_____________ g
Transfiera la yema en un embudo separador de 250 mL de capacidad, lavando con 25 mL de agua destilada y mezcle bien en el embudo,
evitando que se forme espuma.
Agregue, al embudo separador con la yema diluida, 25 mL de diclorometano (CH2Cl2).
ATENCIÓN: El diclorometano, CH2Cl2, es un líquido denso (1.33 g/mL a 20°C), irritante cutáneo y ocular que puede provocar somnolencia y vértigo. Su
ingestión puede ser nociva (toxicidad oral aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca náusea y vómitos con riesgo de aspiración al vomitar que puede
causar edema pulmonar y neumonía. La inhalación de sus vapores es nociva (toxicidad aguda por inhalación, CL 50 rata 60.14 mg/L, 17250 ppm; 4
horas) y provoca también irritación de las mucosas. El contacto con la piel puede ser nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 rata > 2000 mg/Kg) y provoca
irritación cutánea (categoría 2). El contacto con los ojos provoca irritación ocular grave (categoría 2). Puede causar cáncer (carcinogenecidad categoría
2). Presenta toxicidad específica al sistema nervioso central (categoría 3).

Agite para obtener la mezcla más intima posible, pero evitando que se formen emulsiones.
NOTA: Si hay problema para lograr una buena mezcla, puede usar un poco más de agua destilada para diluir.

NOTA: Es posible que se forme un precipitado de proteína.

NOTA: Si se formaran emulsiones, puede agregar sal a la mezcla a fin de que se rompa la emulsión.

Deje el contenido del embudo en reposo por 10 minutos y separe la capa acuosa de la orgánica.
Coloque la capa orgánica en una probeta de 100 mL de capacidad.
Repita la extracción de la fase acuosa dos veces más; vertiendo las capas orgánicas en la probeta de 100 mL para juntarlas todas. Afore con
diclorometano a 100 mL y transfiera el extracto aforado a un recipiente apropiado, marcado Extracto de Yema de Huevo.

Separación cromatográfica de los componentes de los extractos

Tome una placa cromatográfica y en ella, a 2.0 cm del fondo y con al menos 1.5 cm de separación entre sí, seis puntos: para colocar
aplicaciones de extracto de yema y cuatro patrones, a saber, un triglicérido (p ej. tripalmitina), un esterol (p. ej. colesterol), un ácido graso (p.
ej. ácido esteárico) y un fosfolípido (p.ej. lecitina).
NOTA: Utilice un lápiz para hacer las marcas, procure hacerlas lo menos profundas posible.

Coloque en cada punto 100 uL de la sustancia o mezcla correspondiente, usando un microcapilar diferente para cada una.
NOTA: Coloque la muestra gota a gota de manera que la mancha en cada adición tenga el menor diámetro posible.

NOTA: Si es posible, use aire caliente para secar después de cada adición.

Coloque placa cromatográfica en una cámara con mezcla de disolventes cloroformo : metanol : amoniaco (75:25:4) previamente saturada.
PELIGRO: La mezcla cloroformo : metanol : amoniaco, CHCl3:CH3OH:NH4OH, es un líquido inflamable con toxicidad oral, por inhalación, cutánea y
ocular. Su ingestión es nociva, pudiendo provocar náuseas, vómitos y daños en todo el tracto digestivo. Su inhalación es nociva con irritación de
mucosas, fuerte irritación y daños al tracto respiratorio. El contacto con la piel puede provocar fuerte irritación dérmica con dermatitis, efecto
desengrasante y resquebrajante, quemaduras y necrosis. El contacto con los ojos es nocivo con posible fuerte irritación ocular grave con riesgo de
ceguera. También puede presentar toxicidad aguda acuática.

NOTA: Para saturar la cámara coloque la mezcla de solventes en el fondo, no más de 1.5 cm de altura y deje en reposo por al menos 30 minutos con la
cámara herméticamente sellada. Para asegurar la saturación, coloque en una de las paredes un papel de filtro ligeramente menos alto y y ancho que la
pared.

Pasados 45 a 60 minutos, remueva la placa cromatográfica de la cámara y marque el frente de solvente.

Seque la placa y obsérvela primera con diferentes tipos de luz.
Luego colóquela en una cámara de revelado con vapores de yodo.
PELIGRO: El yodo, I2, en cristales aguda por inhalación y contacto con la piel y toxicidad específia oral a la glandula tiroides (categoría 1) y por inhalación
al sistema respiratorio (categoría 3). Su ingestión es nociva (toxicidad oral aguda, DL50 rata 14000 mg/Kg; categoría 4) y puede provocar gusto metálico,
diarrea sangrienta y colapso cirulatorio. La inhalación de polvo/niebla es nociva (toxicida aguda por inhalación CL50 rata > 4,588 mg/L; 4 h; polvo/niebla;
categoría 4) y puede provocar irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel es
nocivo (toxicidad cutánea aguda DL50 conejo 1425 mg/Kg por absorción; categoría 3) y provoca irritación cutánea y posible dermatitis (categoría 2). El
contacto con los ojos provoca irritación ocular grave con quemaduras y daño a la córnea con riesgo de ceguera. También muestra toxicidad aguda
acuática (categoría 1).

También puede revelarla con una aspersión de niebla de ácido fosfomolibfico al 10% p/v en etanol, dejando evaporar el etanol y colocándolo
10 minutos en la estufa a 110°C.
PELIGRO: El ácido fosfomolíbdico, H3[P(Mo3O10)4P]•xH2O, al 10% en etanol absoluto, C2H5OH, es una mezcla líquida inflamable, al igual que sus vapores
(categoría 2), y comburente (categoría 3). Su ingestión es nociva y puede provocar severas quemaduras de boca y garganta, así como peligro de
perforación el esófago y estómago. La inhalación de sus vapores provoca también irritación de las mucosas, tos, insuficiencia respiratoria, con posible
daño del tracto respiratorio. El contacto con la piel provoca fuerte irritación cutánea y quemaduras (categoría 1B). El contacto con los ojos provoco
fuerte irritación ocular, con lesiones oculares graves con riesgo de ceguera.

Calcule los Rf de cada mancha y compare los Rf de las manchas de los extractos de yema y de clara con los Rf de los patrones.
Discuta sus resultados.

10
Cuantificación algunos componentes de los extractos
Esteroles por Liebermann-Burchard
Curva de Calibración
NOTA: La curva de calibración puede realizarla un equipo por grupo.

Prepare una curva de calibración con soluciones de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 mg de colesterol/mL en sendos tubos de ensayo de 16×100 mm, usando
la solución patrón de 10 mg/mL de colesterol en ácido acético glacial, de acuerdo con lo indicado en el Cuadro 1.

CUADRO 1. PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL MÉTODO DE LIEBERMANN-BURCHARD

Identificar los tubos por concentración de colesterol en mg/mL 0 2 4 6 8 10

Agregue a cada tubo el volumen indicado (microlitros) de patrón de 10
0 20 40 60 80 100
mg/mL de colesterol en ácido acético glacial
Agregue a cada tubo el volumen indicado (microlitros) de ácido acético
100 80 60 40 20 0
glacial y mezcle bien en el Vortex.

Agregue a cada tubo 6.0 mL del Reactivo de Liebermann -Bouchard y mezcle bien en un agitador Vortex.
Incube por 10 minutos en un baño de agua a 37°C.
Lea la absorbancia a 650 nm usando agua destilada como blanco, en un plazo no mayor a 10 minutos de haber terminado la incubación.
NOTA: Recuerde devolver el material de la cubeta a cada tubo una vez hecha la lectura por si hay que repetir alguna.

CUADRO 2. ABSORBANCIAS DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL MÉTODO DE LIEBERMANN-BURCHARD

Concentración de colesterol en mg/mL 0 2 4 6 8 10

Absorbancia a 650 nm

Elabore una gráfica mostrando la variación de la absorbancia a 650 nm (A650) con la concentración de colesterol (Cmg/mL). Calcule la pendiente
y la intersección de la sección recta de la curva obtenida por regresión lineal y así como el correspondiente coeficiente de correlación. Con
la pendiente y la intersección calculadas, plantee una ecuación que le permita la concentración de proteína en la muestra utilizada (Cmg/mL),
con base en la absorbancia a 650 nm (A650).

Análisis de los Extractos

Marque cuatro tubos de ensayo de 16 X 100 mm con los números 100, 100, 200 y 200.
En cada tubo coloque el número marcado de microlitros de extracto en diclorometano.
NOTA: Se deben colocar 100 L en los tubos marcados 100 y 200 L en los tubos marcados 200.

Caliente suavemente para evaporar el diclorometano de cada tubo.

Agregue a cada tubo con el residuo de evaporación, 100 L de ácido acético glacial y agite bien con el Vortex para obtener una buena mezcla.
Agregue a cada tubo 6.0 mL del Reactivo de Liebermann -Bouchard y mezcle bien en un agitador Vortex.
Incube por 10 minutos en un baño de agua a 37°C.
Lea la absorbancia a 650 nm usando agua destilada como blanco, en un plazo no mayor a 10 minutos de haber terminado la incubación.
NOTA: Si la lectura se sale del rango lineal de la curva de calibración, haga una dilución 1:10 con diclorometano como solvente, y ensáyela nuevamente.
Si se vuelve a salir del rango diluya nuevamente 1:10 la dilución anterior para obtener 1:100 y vuelva a ensayarla.

CUADRO 3 ABSORBANCIAS (LIEBERMANN-BURCHARD)

Volumen de extracto original 100 L 100 L 200 L 200 L

Absorbancia a 650 nm.
Volumen de dilución 1:10 del extracto original 100 L 100 L 200 L 200 L
Absorbancia a 650 nm.
Volumen de dilución 1:100 del extracto original 100 L 100 L 200 L 200 L
Absorbancia a 650 nm.

Calcule el contenido de colesterol del extracto original (en mg/mL) y de la yema de huevo (en mg/g).

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Lípidos Insaturados por la reacción de Sulfo-Fosfo-Vainilina
Curva de Calibración
NOTA: La curva de calibración puede realizarla un equipo por grupo.

Prepare una curva de calibración con 0, 200, 400, 600, 800 y 1000 g/mL de ácido oleico en sendos tubos de ensayo de 16×100 mm, usando
la solución patrón de 1.00 mg/mL de ácido oleico en etanol absoluto, de acuerdo con lo indicado en el Cuadro 3.

CUADRO 4. PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN (SULFO-FOSFO-VAINILLINA)

Identificar los tubos por concentración de ácido oleico en g/mL 0 200 400 600 800 1000
Agregue a cada tubo el volumen indicado (microlitros) de patrón de 1
0 20 40 60 80 100
mg/mL de ácido oleico en etanol absoluto

Caliente los tubos hasta evaporar el solvente.

Agregue a cada tubo 0.4 mL del Ácido Sulfúrico Concentrado y mezcle bien en un agitador Vortex.
Coloque el tubo tapado con una bola de vidrio en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.
Agregue a cada tubo 6.0 mL del Reactivo de Fosfo-Vaillina y mezcle bien en un agitador Vortex.
Incube por 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
Lea la absorbancia a 525 nm usando agua destilada como blanco.
NOTA: Recuerde devolver el material de la cubeta a cada tubo una vez hecha la lectura por si hay que repetir alguna.

CUADRO 5. ABSORBANCIAS DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN (SULFO-FOSFO-VAINILLINA)

Concentración de ácido oleico en mg/mL 0 200 400 600 800 1000

Absorbancia a 525 nm

Elabore una gráfica mostrando la variación de la absorbancia a 525 nm (A525) con la concentración de colesterol (Cmg/mL). Calcule la pendiente
y la intersección de la sección recta de la curva obtenida por regresión lineal y así como el correspondiente coeficiente de correlación. Con
la pendiente y la intersección calculadas, plantee una ecuación que le permita la concentración de proteína en la muestra utilizada (Cmg/mL),
con base en la absorbancia a 525 nm (A525).

Análisis de los Extractos

Marque cuatro tubos de ensayo de 16 X 100 mm con los números 100, 100, 200 y 200.
En cada tubo coloque el número marcado de microlitros de extracto en diclorometano.
NOTA: Se deben colocar 100 L en los tubos marcados 100 y 200 L en los tubos marcados 200.

Caliente suavemente para evaporar el solvente de cada tubo.

Agregue 0.4 mL de ácido sulfúrico concentrado al tubo con el residuo de evaporación y agite bien con el Vortex.
Incube el tubo tapado con una bola de vidrio por 10 minutos en un baño de agua hirviendo.
Agregue a cada tubo 6.0 mL del Reactivo de Fosfo-Vainillina y mezcle bien en un agitador Vortex.
Incube por 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 525 nm usando agua destilada como blanco.
NOTA: Si la lectura se sale del rango lineal de la curva de calibración, haga una dilución 1:10 con diclorometano como solvente, y ensáyela nuevamente.
Si se vuelve a salir del rango diluya nuevamente 1:10 la dilución anterior para obtener 1:100 y vuelva a ensayarla.

CUADRO 4. ABSORBANCIAS DE MUESTRAS (SULFO-FOSFO-VAINILLINA)

Volumen de extracto original 100 L 100 L 200 L 200 L

Absorbancia a 525 nm.
Volumen de dilución 1:10 del extracto original 100 L 100 L 200 L 200 L
Absorbancia a 525 nm.
Volumen de dilución 1:100 del extracto original 100 L 100 L 200 L 200 L
Absorbancia a 525 nm.

Calcule el contenido de lípidos insaturados expresados como ácido oleico del extracto original (en mg/mL) y de la yema de huevo (en mg/g).

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BIBLIOGRAFIA
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