EXTRACCIN Y ANLISIS DE

LPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO

Objetivos
Analizar las propiedades de los lpidos.
Extraer los lpidos de la yema de huevo.
Cuantificar fosfatos de lpidos fosforilados y no fosforilados.
Analizar la importancia biolgica de los lpidos presentes en la yema de
huevo.

Antecedentes acadmicos
Definicin y clasificacin de los lpidos.
Propiedades fisicoqumicas de los lpidos.
Mtodos de extraccin e identificacin de lpidos.
Mtodos de cuantificacin de fsforo.
Componentes lipdicos de la yema de huevo

99
Bioqumica Celular y de los Tejidos I

Introduccin
Los lpidos representan uno de los cuatro grupos principales de
macromolculas presentes en todas las clulas. Llevan a cabo mltiples
funciones en el organismo, como: almacenamiento de energa, transporte,
estructura, especialmente en membranas, confirindoles la propiedad de
permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas sustancias y en
determinada direccin, as como la conduccin nerviosa y el trasporte activo
como la bomba de Na+/K+. Adems actan como hormonas y algunas
vitaminas. A diferencia de los cidos nucleicos, las protenas y los
polisacridos, los lpidos no son polimricos. Sin embargo, se agregan, y es en
este estado en el que llevan a cabo su funcin estructural en las membranas
biolgicas.
Los lpidos exhiben mayor variedad estructural que las otras clases de
macromolculas biolgicas. Hasta cierto grado, los lpidos son una categora
general de sustancias similares nicamente por ser en gran medida
hidrfobas y slo escasamente solubles en agua. En general, los lpidos llevan
a cabo tres funciones biolgicas:
1. Ser componentes esenciales de las membranas biolgicas.
2. Servir como depsitos de energa.
3. Participar en numerosos acontecimientos de sealizacin intra e
intercelular.
Debido a su naturaleza hidrfoba los lpidos son fciles de separar de otros
materiales biolgicos mediante extraccin con disolventes orgnicos.

Propiedades fisicoqumicas de los lpidos

Los lpidos son insolubles en agua, cuando se agitan fuertemente en ella se
dividen en gotas formando una emulsin que es transitoria, pues desaparece
en reposo por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que, por su
menor densidad, se sita sobre el agua.

100
 Extraccin y anlisis de lpidos de la yema de huevo

Por el contrario, son solubles en disolventes orgnicos, como ter,

cloroformo, acetona, benceno, etc. Su solubilidad en alcoholes depender
del tamao del mismo as como de su ramificacin (a mayor nmero de
carbonos ms soluble ser el lpido no as con la ramificacin).

Fosfolpidos
Los fosfolpidos, son molculas anfipticas que contienen un alcohol
(glicerol), dos cidos grasos y un grupo fosfato (Fig. 1). Son los componentes
lipdicos principales de las membranas biolgicas. Se organizan como glicerol-
3-fosfato y las posiciones C1 y C2 estn esterificadas con cidos grasos,
comnmente uno saturado y otro insaturado con una longitud promedio de
18 carbonos Adicionalmente, el grupo fosforilo est unido a un hidrgeno
(cido fosfatdico) o a otro grupo, en general polar (Cuadro 1).
O cido graso saturado
(por ejemplo: palmtico)
H2C O C CH3
O
HC O C
CH3
O cido graso insaturado
H2C O P O R (por ejemplo:oleico)
-
O
Fig.1. Glicerofosfolpido.

Cuadro 1. Sustituyentes en el glicerofosfolpido.

R Estructura de R Nombre
Hidrgeno H H cido fosfatdico
+
Etanolamina H3C CH2 CH2 NH3 Fosfatidiletanolamina
H3C CH3
+
Colina H3C CH2 CH2 N Fosfatidilcolina
CH3
+
H3C CH2 CH NH3

Serina Fosfatidilserina
C
HO O

101
Bioqumica Celular y de los Tejidos I

Los fosfolpidos son componentes estructurales importantes de las

membranas, varios fosfolpidos son agentes emulsionantes y agentes
superficiales activos (un agente superficial activo es una sustancia que
disminuye la tensin superficial de un lquido, normalmente el agua, de
forma que se dispersa por una superficie).
Son muy adecuados para estas funciones ya que son anfipticos, esto es que
son simultneamente hidroflicos e hidrofbicos. Es la parte hidroflica donde
se encuentran el grupo fosfato y el aminoalcohol o base nitrogenada. Esta
caracterstica estructural hace posible que los fosfolpidos participen en el
intercambio de sustancias entre un sistema acuoso y el sistema lipdico
separando y aislando a los dos sistemas, a la vez que los mantiene juntos.
Cuando los fosfolpidos se suspenden en agua, se reagrupan
espontneamente en estructuras ordenadas, los grupos hidrfobos quedan
enterrados en el interior para excluir el agua, simultneamente, los grupos de
cabeza polar se orientan de forma que se exponen al agua. Cuando estn
presentes las molculas de fosfolpidos en una concentracin suficiente,
forman capas bimoleculares. Esta propiedad de los fosfolpidos es la base de
la estructura de la membrana (Fig. 2).

Fig. 2. Molculas de fosfolpidos en solucin acuosa.

Con la finalidad de analizar las propiedades y determinar la cantidad de
fosfolpidos presentes en la yema de huevo, se utiliza como referencia la
fosfatidilcolina (lecitina), debido a que es el fosfolpido ms abundante en
ella.

102
 Extraccin y anlisis de lpidos de la yema de huevo

La yema de huevo es una fuente rica en lpidos, en el cuadro2 se muestra el

contenido de los principales fosfolpidos en ella.

Cuadro2.Contenido de fosfolpidos en
100g de yema de huevo
Fosfolpidos totales 10.34 g
Fosfatidilcolina 6.79 g
Fosfatidiletanolamina 1.93 g
Fosfatidilinositol 64.00 mg
Esfingomielina 488.00 mg

Digestin por el mtodo de Kjeldahl

Este mtodo fue desarrollado para separar el nitrgeno contenido en las
protenas y cuantificarlas de forma indirecta. En esta prctica debido a que el
fsforo se encuentra en combinacin con materia orgnica en los lpidos, la
determinacin de fsforo total debe necesariamente contemplar una
oxidacin efectiva de la materia orgnica.
Por lo anterior se calienta el compuesto que contiene fsforo con cido
sulfrico concentrado, durante el proceso se agregan gotas de H2O2 el cual
acelera la reaccin. Se lleva a cabo la operacin en matraces de cuello largo
(matraces Kjeldahl) sobre un digestor de alto calentamiento.
Los compuestos orgnicos se carbonizan por la accin del cido sulfrico, los
elementos carbono, hidrgeno, fosforo y azufre son oxidados a CO2, CO, H2O,
P2O7-4 y SO2. El abundante desprendimiento de dixido y trixido de azufre
exige efectuar el proceso en la campana de extraccin. Se continua la
digestin hasta que la muestra reaccionante sea completamente incolora.

Determinacin de fsforo por el mtodo de Fiske & Subbarow

Se utiliza este mtodo con la finalidad de cuantificar el fsforo contenido en
los lpidos de la muestra. Los iones fosfato reaccionan con al molibdato de
amonio en medio cido para producir el complejo fosfomolibdato de amonio,
el cual en presencia de un agente reductor, produce un complejo
heteropolimrico de color azul, azul de molibdeno, cuya absorbancia se mide
a los 615 nm. La intensidad de color es proporcional a la concentracin de
fsforo de la muestra..

103
Bioqumica Celular y de los Tejidos I

Material y Equipo
Anillo de hierro
Embudo de separacin de 125 mL
Embudo de tallo corto
Marcador indeleble de punta extrafina
Matraces aforados de 10, 50 y 100mL
MatracesMicoKjeldahl de 30mL
Micropipetas. p200, p1000 y p5000 L
Papel filtro Whatman # 1 y de poro grueso
Pipetas graduadas de 5y 10 mL 1/100
Probetas graduadas de 25 y 100mL
Puntas nuevas para las micropipetas
Soporte universal
Vasos de precipitados de 25, 50, 150 y 250 mL
Bao mara
Parrilla de calentamiento
Balanza analtica
Espectrofotmetro
Celdas para espectrofotmetro

Reactivos
- Reactivo 1: Con mucha precaucin aadir 26 mL de H2SO4 concentrado
en 70 mL de agua destilada (enfriar con flujo de agua en la parte
externa del recipiente), posteriormente agregar y disolver 2.5 g de
molibdato de amonio, completar a 100 mL con agua destilada.
- Reactivo 2: Disolver en agua: 14 g de bisulfito de sodio, 0.5 g de sulfito
de sodio, 0.25 g de cido 1 amino-2 naftol- 4 sulfnico, es importante
disolver en ese orden y no agregar el siguiente reactivo hasta que se
disuelva el anterior, finalmente llevar a 200 mLcon agua destilada.
Conservar en refrigeracin donde es estable durante 2 semanas.

104
 Extraccin y anlisis de lpidos de la yema de huevo

- Solucin estndar de fosfato: Disolver 0.4394 g de fosfato

monopotsico en agua destilada y aforar a 1000mL con agua (Solucin
Stock). Realizar una dilucin 1:10 de la solucin Stock.
- Mezcla cloroformo-Metanol 2:1 V/V
- Acetona
- Cloruro de sodioal 1 %
- Sulfato de sodio anhidro
- ter de petrleo
- cido sulfrico
- H2O2 al 30%
- Hidroxiquinona
- NaOH1N

Material Biolgico
-Huevo de gallina

Mtodo
Extraccin y separacin de fosfolpidos y lpidos no fosforilados.

1. Romper un huevo de gallina a la mitad y separar la clara de la yema

utilizando un desyemador.
2. Pasar la yema a un vaso de precipitados de 250 mL, adicionar 90 mL de
una mezcla de disolventes: cloroformo-metanol 2:1 V/V, agitar
suavemente mezclando bien la yema con el disolvente. Dejar reposar
10 minutos.
3. Filtrar el homogenizado a travs de un filtro de poro grueso. Dividir el
filtrado en dos partes para que sea utilizado por dos equipos de trabajo
y continuar.
4. Colocar el filtrado en un embudo de separacin con 25 mL de solucin
acuosa de NaCl al 1 %, invertir cuidadosamente dos veces el embudo
para lavar el filtrado y dejar reposar 10 minutos para permitir la

105
Bioqumica Celular y de los Tejidos I

separacin de ambas fases. Finalmente obtener slo la fase

clorofrmica.
5. Eliminar el agua que pueda haber en la fase clorofrmica mediante la
adicin de aproximadamente 2g de Na2SO4 anhidro, agitar
vigorosamente y filtrar. Repetir esta misma operacin en caso de que
la solucin est turbia.
6. Evaporar el disolvente en bao mara, adicionar al residuo (lquido
espeso sin olor a disolvente) 15 mL de acetona y colocar en bao de
hielo durante 15 min. Decantar y filtrar en papel filtro poro grueso para
separar la solucin cetnica (lpidos no fosforilados) del precipitado
(fosforilados).
7. Lavar los lpidos fosforilados con 5 mL de acetona fra, eliminar el
disolvente por decantacin y disolver en 10 mL de ter de petrleo.
Guardar en un frasco mbar, etiquetar y guardar en refrigeracin.
8. Evaporar la solucin cetnica en bao mara y disolver en 10 mL de
ter de petrleo (no fosforilados).
Precaucin: Etiquetar bien sus recipientes y adicionar trazas del
antioxidante hidroxiquinona para guardar las muestras. Guardar en
refrigeracin.

Determinacin del contenido de fsforo en fosfolpidos y lpidos no

fosforilados.
1. Evaporar las dos soluciones etreas a sequedad en bao mara.
2. Pesar en dos pequeos papeles filtro, 10 mg de fosofolpidos y lpidos
no fosforilados. Colocar los papeles en dos matraces microkjedahl y
digerirlos con1.0mLde H2SO4, adicionar durante el calentamiento gotas
de H2O2 al 30 %. Continuar con la digestin hasta que el lquido se
encuentre incoloro. Tener cuidado al momento de agregar el perxido
evitando que el matraz este muy caliente.
3. Aforar los lquidos resultantes a 50mL con agua destilada.
4. Tomar alcuotas de 1mL y neutralizar al tornasol con NaOH 1N y
aforara 10 mL con agua destilada.
5. Vaciar cada muestra a un vaso de precipitados de 25 mL y agregar a
cada una 0.4mL del reactivo de molibdato (reactivo 1), dejar reposar
10 minutos.

106
 Extraccin y anlisis de lpidos de la yema de huevo

6. Agregar 0.2mL del reactivo 2, dejar reposar 5 minutos.

7. Leer en el espectrofotmetro a 615 nm.

Curva estndar de fsforo

1. Tomar 5 alcuotas de la solucin patrn de fosfatos: 0.2, 0.6, 1.0, 2.0,
3.0mL respectivamente y aforara 10mLcon agua destilada.
2. Vaciar cada solucin estndar a un vaso de precipitados de 25 mL y
agregar a cada uno0.4 mL del reactivo de molibdato (reactivo 1), dejar
reposar 10 minutos.
3. Agregar 0.2 mL del reactivo 2, dejar reposar 5 minutos.
4. Leer en el espectrofotmetro a 615 nm.

Resultados
- Graficar la curva estndar de fosfatos e interpolar las absorbancias de las
muestras (fosforilados y no fosforilados).
- Tomar en cuenta las diluciones de las muestras para determinar la
cantidad de fsforo en los lpidos fosforilados y no fosforilados; as como
el porcentaje de fsforo presente en las muestras.

Cuestionario
1. Menciona 5 funciones de los lpidos en los organismos biolgicos.

2. Explica el fundamento del mtodo de Kjeldahl.

3.Justifica el uso de disolventes cloroformo-metanol en la prctica.

4. Indica en qu consiste el mtodo de de cuantificacin de fosfatos

(Fiske&Subbarow) y su importancia para la prctica.

107
Bioqumica Celular y de los Tejidos I

Referencias
1. Aguilar-Santelises L, Corona-Ortega MT, Garca-del Valle A, Rangel-
Corona R, Cruz-Milln M. Antologa para los laboratorios de Bioqumica
Celular y de los Tejidos I y Laboratorio Integral de Biologa I. 2a ed.
Mxico: FES Zaragoza, UNAM; 2007.
2. Facultad de Qumica. UNAM. Licenciatura de Qumica en alimentos.
Anlisis de alimentos fundamentos y tcnicas. [on line] Disponible en:
dspace.universia.net/bitstream/2024/1067/1/ManualdeFundamentos
yTecnicasdeAnalisisdeAlimentos_6501.pdf.
3. Garca-del Valle A, Aguilar-Santelises L, Corona-Ortega MT. Protocolos
de Bioqumica Celular y de los Tejidos I (complemento). Mxico: FES
Zaragoza, UNAM; 2004.
4. Harper HA, et al. Bioqumica de Harper. 28 ed. Mxico: McGraw-Hill
Interamericana; 2010.
5. McKee T, McKee J. Bioqumica: las bases moleculares de la vida.4a ed.
Madrid: Mc Graw Hill-Interamericana; 2009.
6. Voet D, Voet JG, Pratt ChW. Fundamentos de Bioqumica. La vida a
nivel molecular. 2 ed. Buenos Aires, Argentina: Editorial Mdica
Panamericana; 2007.

108