FUNDAMENTOS

DEL DNA

18 Febrero 2016
Nobel 1962
Almacenamiento de información genética

1869 Miescher aisló una sustancia con fósforo de núcleos de

células, que llamó nucleína

Laboratorio Hoppe-Seyler
Principio de transformación

Streptococcus pneumoniae

Frederick Griffith

La sustancia pasa desde

la bacteria muerta a la
viva = FACTOR DE
TRANSFORMACIÓN
1944

Realizaron el experimento con

las bacterias de Griffith Streptococcus pneumoniae

¿DNA O PROTEÍNA?
Experimento para la confirmación (1952)

Alfred D. Hershey y Martha Chase

https://www.youtube.com/watch?v=inysl_ydfzQ
Composición del DNA

Erwin Chargaff

Composición del DNA

❖ La composición del DNA generalmente varía de una

especie a otra.
❖ El DNA aislado de diferentes tejidos de la misma
especie tiene la misma composición de bases.
❖ La composición de bases de DNA no cambia en un
organismo con la edad, estado nutricional o cambio
de ambiente.
❖ En todo el DNA, el número de adenosinas, es igual a
el número de timinas (A = T) y el número de
guanosinas es igual al número de citosinas (C = G)
❖ A+G = T+C

Humanos A=30.9
T=29.1
G=19.9
C=19.8
DNA

Polímero de deoxironucleótidos
Se encuentra en cromosomas, mitocondria y
cloroplastos

BASE

AZÚCAR

FOSFATO
Los nucleosidos y bases analógas pueden tener usos como

Anticancerígenos

Su eficacia radica en que se Leucemia linfoblástica aguda (LLA)

une de forma irreversible a
la enzima timidilato sintasa,
esencial para la síntesis de
nucleótidos de timina.

Agentes Antirretrovirales

Aprobado en 1987 como un medicamento indicado para personas

infectadas con el VIH por su efecto retardador de la extensión de la
infección por VIH,

Azidotimina
La secuencia del DNA siempre se sintetiza del 5` a 3´
La estructura secundaria del DNA es una DOBLE HÉLICE
❖ 2 cadenas antiparalelas que
giran sobre el mismo eje

❖ Los grupos fosfato de las

cadenas envuelven la periferia
❖ Bases ocupan el núcleo
f o r m a n d o b a s e s
complementarias A-T, G-C
❖ Se mantiene unida por puentes
de hidrógeno
2 puentes de hidrógeno entre A-T
3 Puentes de hidrógeno entre C-G
 Apilamiento

Las bases nitrogenadas en el DNA son

planares y tienen tendencia a apilarse

Fuerzas de apilamiento

Interacciones hidrofóbicas y fuerzas de

van der Waals
Formas estructurales del DNA
 Estructura terciaria

El DNA de doble hélice se enrolla alrededor de las histonas

El DNA se une a para formar fibras llamadas nucleosomas (10 nm)

Nucleosomas contienen 146 nucleótidos

 Nucleosoma

Son unidades globulares repetidas de cromatina que consiste en un complejo histona y DNA
Compactación del DNA en el cromosoma
 EN RESUMEN

❖ El DNA esta formado pro 4 bases A, G, T, C, que se encuentran en formación

lineal por arreglos de enlaces fosfodiéster.

❖ El DNA está organizado en 2 cadenas antiparalelas por el emparejamiento de

las bases A-T y G-C en cadenas complementarias. Estas cadenas forman una
doble hélice alrededor de un eje central.

❖ Las 3x10 9 pares de bases del DNA humano están organizadas en 23

cromosomas
 REPLICACIÓN
Proceso de duplicación de la cadena de DNA
(Síntesis de una nueva cadena idéntica)

Participantes

Doble hélice del DNA

DNA Polimerasa I y III

Helicasa

Topoisomerasa

SSB Primasas y ligasas

Características generales

1. Complementariedad entre las bases del DNA

Recordemos….
 2. Proceso semiconservativo

Cada una de las dos cadenas sirven de molde para la síntesis de nuevas cadenas

3. Dirección de replicación 5´- 3´

4. Primer (cebadores)

Pequeñas unidades de RNA (20 nucleótidos)

5. Primasa

Enzima que introduce el primer

7. Origen de Replicación
6. DNA polimerasa

Participan en la polimerización del DNA

8. Replicación Bidireccional

FRAGMENTOS DE OKASAKI
 DNA pol I DNA pol II DNA pol III

Monómero Monómero Multiméro

Estructura
109 kD 90 kD 900 kD

Elongación, Elongación, Elongación,

Función corrección y corrección y corrección y
reparación reparación reparación
Afecta la
Incompatible con la
Ausencia reparación del Ninguna conocida
vida
DNA
Reacción en cadena de la DNA polimerasa PCR

Técnica desarrollada en 1985 por Kary B. Mullis

Premio Nobel Química 1993
Técnica de Biología Molecular que tiene por objetivo la amplificación directa de un gen
o fragmento de DNA

Amplifica millones de fragmentos pequeños de DNA hasta 10 Kb en períodos cortos

Amplificación

PCR

Detección
 FUNDAMENTOS

Mimetiza el proceso de replicación

Complementaridad

Capacidad del DNA para desnaturalizarse y renaturalizarse

 PARTICIPANTES

1. Molde (Template) DNA

2. Primers

3. DNA Polimerasa
Microorganismos arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth).
Generalmente se emplean mezclas del polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).

4. Mg++

5. Deoxynucleótidos dNTP´s

6. Buffer
 MOLDE O TEMPLADO

Es la molécula que contiene la región de DNA que quiere amplificar

Se requiere poca cantidad

No se requiere puro

Tiene que se libre de altas concentraciones de EDTA

 PRIMERS (CEBADORES, INICIADORES)

Son oligonucleótidos sintéticos que flanquean la región blanco, uniéndose por

complementaridad de bases a cada uno de los extremos a amplificar
Deben ser específicos para la secuencia a amplificar

Deben tener idealmente entre 40-50% CG

Deben evitar estructuras secundarias

Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb

Los primers se ligan a su secuencia complementaria en el DNA target
* Un primer compuesto por solo 3 letras, ATT, por ejemplo, tiene una alta probabilidad
de encontrar complemento mas de una vez

*A medida que el cebador crece en nucleótidos, la probabilidad de que una secuencia de 35

letras se encuentre repetida se vuelve más remota.

Por ejemplo
 Características de un buen Primer

Temperatura de fusión (Tm) en el intervalo de 50ºC a 65ºC

Temperatura a la cual el 50% de las cadenas se

encuentran separadas

Que no formen horquillas > a 3pb

Bajo contenido de GC para evitar exceso de afinidad no complementaria

 Sólo puede existir una zona complementaria en el DNA donde el primer se una, lo cual
significa que el primer debe ser irrepetible

La composición de las bases afecta la especificidad de la hibridación así como su temperatura

La composción aleatoria de bases es lo mejor.
Evitar primers con secuencias de conformación GCGCGC o ATATAA
Un contenido de G+C alrededor de 40-50% nos proporcionará una buena temperatura de
alineamiento
 Temperatura de hibridación

Se calcula usando la temperatura de fusión (Tm) de los primers

Thibridación = Tm_primer - 4 ºC

Si los primers son complementarios entre si, y se hibridan entre ellos en lugar del DNA
muestra, la eficiencia de la PCR se verá afectada drasticamente

La temperatura de hibridación debe ser mutuamente compatible. La máxima diferencia

permisible en la temperatura de los 2 primeros es de 3ºC.
 RESUMEN

ESPECIFICIDAD: Asegurar que a secuencia complementaria sea única

LONGITUD: 17-28 Bases

COMPOSICIÓN DE BASES: El contenido promedio (C+G) en el intervalo de 40-50% y evitar

regiones ricas en (A+T) y (G+C)

TM : intervalo de 55-70ºC

Minimizar la posibilidad de formación de estructuras secundarias, horquillas y dímeros

La muestra del DNA, Taq o Pfu, el tampón, los núcleotidos
trifosfato y los cebadores son vertido en tubos de paredes
delgados y estos puestos en un termociclador de PCR
CGTTGCGTGCTCGCCTTACCCTCTCAACTCAATTTCTTCAACCCAATTTCTTCG
M A F P I P A R Q L F I
CATTTAACCAAGAATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT CGT CAG CTA TTC ATC
D G E W R E P I K K N R U P V
GAC GGA GAG TGG AGA GAA CCC ATT AAA AAA AAT CGC ATA CCC GTC
I N P S T E E I I G D I P A A
ATC AAT CCG TCC ACT GAA GAA ATC ATC GGT GAT ATT CCG GCA GCC
T A E D V E V A V V A A R R A
ACG GCT GAA GAT GTG GAG GTT GCG GTG GTG GCA GCT CGA AGA GCC
F R R N N W S A T S G A H R A
TTT AGG AGG AAC AAT TGG TCA GCA ACA TCT GGG GCT CAT CGT GCC
T Y L R A I A A K I T E K K D
ACA TAC TTG CGT GCT ATT GCT GCT AAG ATA ACA GAA AAA AAA GAT
H F V K L E T I D S G K P F D
CAT TTC GTT AAA CTG GAA ACC ATT GAT TCT GGG AAA CCT TTT GAT
E A V L D I D D V A S C F E Y F
GAA GCA GTG CTG GAC ATT GAT GAC GTT GCT TCA TGT TTT GAA TAT TTT
A G Q A E A L D G K Q K A P V
GCC GGA CAA GCA GAA GCT CTT GAT GGT AAA CAA AAG GCT CCA GTC
T L P M E R F K S H V L R Q P
ACC CTG CCT ATG GAA AGG TTC AAA AGT CAT GTT CTC AGG CAG CCC
L G V V G L I S P W N Y P L L M
CTT GGT GTT GTT GGA TTA ATA TCC CCA TGG AAT TAC CCA CTT CTA ATG
A T W K I A P A L A A G C T A
GCT ACA TGG AAA ATT GCT CCA GCA CTT GCT GCT GGG TGT ACA GCT
V L K P S E L A S V T C L E F
GTA CTT AAG CCA TCC GAG TTG GCA TCT GTG ACT TGT CTA GAA TTC
G E V C N E V G L P P G V L N
GGT GAA GTT TGC AAC GAA GTG GGA CTT CCT CCA GGC GTG TTG AAT
I L T G L G P D A G A P L V S
ATC TTG ACA GGA TTA GGT CCA GAT GCT GGT GCA CCA TTA GTA TCA
H P D V D K I A F T G S S A T
CAC CCC GAT GTT GAC AAG ATT GCC TTT ACT GGG AGT AGT GCC ACT
G S K V M A S A A Q L V K P V
GGA AGC AAG GTT ATG GCT TCT GCT GCC CAA TTG GTT AAG CCT GTT
T L E L G G K S P I V V F E D
ACA TTA GAA CTT GGG GGT AAA AGT CCT ATT GTA GTG TTT GAA GAT
V D I D K V V E W T I F G C F W
CTA GAA GTT GGA GCT GTT TGG GTT AAT TGC TCA CAA CCA TGC TTT GTT
Q A P W G G I K R S G F G R E
CAA GCT CCT TGG GGA GGC ATC AAG CGT AGT GGT TTT GGA CGT GAA
L G E W G I Q N Y L N I K Q V
CTT GGA GAA TGG GGT ATC CAG AAT TAC TTG AAT ATC AAG CAG GTG
T Q D I S D E P W G W Y K S P
ACT CAA GAT ATT TCT GAT GAA CCA TGG GGA TGG TAC AAG TCT CCT

TGA
5`CATTTAACCAAGAATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT CGT CAG CTA TTC ATCGAC GGA GAG TGG AGA GAA CCC ATT AAA AAA AAT CGC ATA 3´

3’GTAAATTGGTTCTTACCGCAAGGGTTAA GGA CGA GCA GTC GAT AAGTAGCTG CCT CTC ACC TCA CTT GGG TAA TTT TTT TTA GCG TAT 5`

PRIMER FORWARD

ATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT CGT CAG CTA TTC ATCGA

5`TGG GGT ATC CAG AAT TAC TTG AAT ATC AAG CAG GTG ACT CAA GAT ATT TCT GAT GAA CCA TGG GGA TGG TAC AAG TCT CCT 3´

3´ACC CCA TAG GTC TTA ATG AAC TTA TAG TTC GTC CTC TGA GTT CTA TAA AGA CTA CTT GGT ACC CCT ACC ATG TTC AGA GGA 5´

PRIMER REVERSE

5´ AGG AGA CTT GRA CCA TCC CCA TGG CCA TTC ATC 3

 DNA POLIMERASA

Taq polimerasa
Comete un error por cada 10000 nucleótidos
Temperatura 72ºC
No posee actividad correctora
Necesita Mg2+ como cofactor

Mg2+ en altas concentraciones

afecta la especificidad,
amplificaciones inespecíficas,
forma complejos con los dNTP´s
 ¿CÓMO SE HACE?

Diseño del Primer

Extracción del DNA

PCR

DETECCIÓN
 ETAPAS

Alineamiento
Desnaturalización

Extensión
ELONGACIÓN FINAL
¿Cómo podríamos monitorear la PCR?
Electroforesis en geles de agarosa
 Microscopia
de polímero de
agarosa
Uso de “colorantes”
 1. BROMURO DE ETIDIO

2. SYBER SAFE
1. BROMURO DE ETIDIO
Es un agente intercalante
Bromuro de Etidio Syber Safe

 VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que
llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser
capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de
reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

PLÁSMIDOS
Son ampliamente usados, proceden de moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas
y se replican autonómamente dentro de la célula
pUC18

Es un plásmido muy usado, es derivado del pBR322, 10,000 pb

Bacteriofago
20, 000 pb
Cósmidos

Plásmido-lambda 50,000 bp

YAC
Son cromosomas de levadura 100 kb a 1000kb
 Plásmido

1. ORIGEN DE REPLICACIÓN
Capaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero

2. MARCADORES DE SELECCIÓN

Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un
antibiótico

3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM)

Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e
insertar DNA.
 Restricción

Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a

que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por
virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.
 Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan
los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias
que se leen igual en ambas direcciones)
Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:
E Escherichia Género de la bacteria
co coli Especie de la bacteria
R RY13 Cepa de la bacteria
I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima
Extremos romos
Extremos cohesivos
 Corte con HincII

https://www.youtube.com/watch?v=yDGA8n1oJ5Q