Código:

Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

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TALLER “TINCIONES EN EL LABORATRIO DE MICROBIOLOGÍA”

1. IDENTIFICACIÓN DEL INSTRUMENTO:

Programa de Formación: Ficha de caracterización:
Tecnólogo en Química Aplicada a la Industria 1260032
Nombre de la Guía: Código de la Guía:
Determinación de las condiciones técnicas 9230-FP-O-314 V4
Nombre del Instructor: Marcelo Guancha
Ciudad y fecha:

2. PRESENTACIÓN E INSTRUCCIONES PARA EL DILIGENCIAMIENTO:

Señor/a Aprendiz:
♦ Resuelva los problemas o casos planteados.
♦ Al responder escriba con letra clara y sea conciso.
♦ Entregue los productos al Instructor y solicite retroalimentación del taller.

3. CUERPO DEL INSTRUMENTO:

3.1. INTRODUCCIÓN
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o
animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el
laboratorio. Todo colorante, se caracteriza por presentar un grupo cromóforo que tiene como función teñir
la estructura y un grupa auxocromo, el cual participa de la reacción, para que se dé la tinción. Los
colorantes se clasifican en catiónicos (básicos), aniónicos (ácidos); basados en la carga presente en el
grupo cromóforo.

Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio óptico, la
mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho más
fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas
técnicas, nos permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se
utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de
un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se
utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en
particular (inmunocitoquímico) o para identificar estructuras como flagelos, cápsulas y/o esporas.

Tinción Simple. Las tinciones se basan en la utilización de colorantes que pueden clasificarse como
naturales o sintéticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines histológicos. La mayor parte de
los colorantes que se utilizan para teñir bacterias son sintéticos, muchos de ellos son las anilinas y
derivados del benceno. Se habla de coloración simple cuando una muestra extendida se tiñe con un solo
colorante. Si la preparación se tiñe con safranina, las bacterias adquirirían un color rojo, si se utiliza azul
de metileno, se teñirán de azul, si por el contrario se tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán
teñidas de color violeta, es decir adquirirán el color del único colorante que se utilizó. Este procedimiento
permite distinguir la morfología y estructuras internas de la célula bacteriana, como por ejemplo, la
presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto
estructuras bacterianas como por ejemplo: flagelo, cápsula, endosporas, etc.

La tinción de Gram es una de las más importantes en microbiología porque permite diferenciar a las
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bacterias en Gram Negativas y Gram Positivas, con

relación a la diferencia en las paredes celulares. En ésta
coloración los reactivos actúan de la siguiente manera: el
cristal violeta, colorante primario, tiñe las bacterias y la
solución yodada hace de mordiente o fijador de color
haciendo que las bacterias se observen teñidas de un azul
mas fuerte. El solvente orgánico actuará como decolorante
al eliminar de la pared celular de las Gram Negativas la
capa lipídica, permitiendo que el colorante se libere. Las
Gram Positivas no se ven afectadas por el decolorante y en
consecuencia las Gram Negativas no se observan y las
Gram Positivas retienen el colorante. Por último, un
colorante secundario, la safranina, tendrá la función de
hacer el contraste al teñir las bacterias Gram Negativas
decoloradas en el paso anterior.

La morfología de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados frescos o fijos y
teñidos. Las tinciones junto con la microscopia de luz son una herramienta básica en microbiología,
permitiendo estudiar las propiedades de los microorganismos y su división en grupos específicos para
propósitos diagnósticos. De acuerdo a la disposición, forma y tamaño, las bacterias se clasifican en:

Formas y disposiciones representativas de las células bacterianas

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Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben diferencias en la apariencia
macroscópica de su crecimiento, estas diferencias llamadas características culturales, son la base para la
separación de ellas en grupos taxonómicos. La morfología colonial, es una característica indispensable a
tener en cuenta en el aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la
elevación de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y la textura de la masa
celular, también la pigmentación de la colonia. La descripción se realiza sobre las colonias formadas
(agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable macroscópicamente), de forma
aislada y se evalúa de la siguiente manera:

Descripción macroscópica realizada en colonias.

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3.2. OBJETIVOS
● Reconocer la morfología celular bacteriana y otros aspectos morfológicos.
● Conocer los fundamentos, utilidades y procedimientos aplicados a las tinciones bacterianas, para
la observación de las principales estructuras.
● Desarrollar las metodologías de tinción simple y Gram aplicadas a las bacterias.

3.3. ACTIVIDADES PRELABORATORIO

Consultar sobre:
● Morfología de las bacterias
● Tinción microbiológica
● Bacterias Gram positivas y Gram negativas
● Estructura de las paredes celulares

3.4. MATERIALES DEL APRENDIZ

Cada Aprendiz debe contar con los siguientes implementos de trabajo y seguridad
● Guía de laboratorio.
● Cuaderno exclusivo para el laboratorio.
● Blusa blanca de laboratorio que cubra hasta las rodillas de manga larga.
● Gafas de seguridad, tapabocas, cofia y guantes,
● Calculadora, regla, cinta de enmascarar, tijeras, toalla pequeña.
● Papel kraft, viniplast, papel aluminio, algodón y gasa

3.5. REACTIVOS
Etanol
Cultivo Agar nutritivo
Cultivo Agar PDA
Azul de metileno.
Agua destilada.
Lugol de Gram
Safranina
Cristal Violeta de gram
Alcohol – acetona
Verde malaquita
KOH 3%

3.6. MATERIALES QUE SUMINISTRA EL LABORATORIO (POR GRUPO)

● Lamina Portaobjetos
● Lamina Cubreobjetos
● Microscopio óptico
● Asa microbiológica.
● Mecheros.
● Goteros
● Servilletas de papel

3.7. ACTIVIDAD EXPERIMENTAL

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MORFOLOGÍA BACTERIANA
1. Con los cultivos bacterianos suministrados, realice la descripción morfológica de la colonia o tipo de
crecimiento observado; defina los siguientes conceptos: forma, elevación, borde, tamaño, superficie,
consistencia, aspecto y pigmentación.
2. Tabule los datos.

TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

Procedimiento para tinciones simples

1. Limpies las láminas con agua y jabón. Séquelas y posteriormente desengrase con alcohol y deje
evaporar.
2. Identifique cada lámina con el número o nombre de la muestra.
3. Coloque una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y extienda la muestra de las bacterias con
el asa bacteriológica estéril.
4. Pase la muestra dos o tres veces sobre la llama del mechero para fijar la muestra.
5. Vierta sobre el frotis el colorante azul de metileno y deje actuar por 2 minutos.
6. Pasado el tiempo, lave cuidadosamente el exceso de colorante con agua.
7. Deje secar al aire con la placa de tinción inclinada.
8. Lleve la muestra al microscopio y observe con los diferentes objetivos.

Procedimiento para tinción de Gram

1. Limpies las láminas con agua y jabón. Séquelas y posteriormente desengrase con alcohol y deje
evaporar.
2. Identifique cada lámina con el número o nombre de la muestra.
3. Coloque una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y extienda la muestra de las bacterias con
el asa bacteriológica estéril.
4. Dejar que la muestra seque al aire.
5. Después de seco, pase la muestra dos o tres veces sobre la llama del mechero para fijar la muestra.
6. Vierta sobre el frotis el colorante cristal violeta y deje actuar por 1 minuto.
7. Lave con agua y escurra el exceso.
8. Seguidamente cubra el frotis con lugol y deje actuar por 1 minuto.
9. Lave con agua y escurra el exceso.
10. Ahora cubra el frotis con solución decolorante, por 30 segundos.
11. Lave con agua y escurra el exceso.
12. Seguido, cubra la muestra con colorante de contraste (Safranina o fuschina) y deje actuar por 1
minuto.
13. Lave con agua y escurra el exceso.
14. Dejar que la preparación se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada.
15. Observe en el microscopio con todos los objetivos.

BIBLIOGRAFÍA
Rojas-triviño, A. (2011). Conceptos y prácticas de microbiología general. Universidad Nacional de
Colombia - Sede Palmira.
Montoya Campuzano, O. (1999). Manual de Microbiología. Universidad Nacional de Colombia – Sede
Medellin.

López Jácome, L. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en discapacidad.

2014, 3, 10-18.
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4. PRODUCTO (S):
1. Preinforme en la bitácora de laboratorio
2. Informe de la práctica.

Observaciones y/o recomendaciones: