PRODUCCIÓN DE BIOPLÁSTICOS A PARTIR DE

BACTERIAS EMPLEANDO SUSTRATOS NO

CONVENCIONALES.

Autores
Mariana Cardona Betancur. Msc.
Lina María Agudelo Escobar MsC.

Grupo de Biotransformación
Escuela de Microbiología

10 de Septiembre de 2012
Contenido

 Introducción
 Planteamiento del Problema
 Producción de bioplásticos empleando
bacterias
 Objetivos
 Metodología
 Resultados y Discusión
 Conclusiones

2
 Planteamiento del Problema
…”El mayor porcentaje de este material se convierte directamente en
basura al usarse y ser desechado”…

LOS PLÁSTICOS

Su producción es de aprox. 260 millones

Hay más de 18.000 piezas de bolsas
de ton/año.
plásticas que flotan en cada kilómetro
cuadrado de los océanos del mundo.

El 11% de nuestra basura son desechos En su elaboración se consumen

plásticos, y esto aumenta un 1% desde anualmente cerca de 270 millones de
1960. toneladas de petróleo y gas.

Poseen tiempo de uso corto, por lo cual

No son degradados fácilmente por representan del 35-55% de los residuos
medio de procesos naturales y tardan en no biodegradables que van a los rellenos
descomponerse hasta 300 años.
sanitarios.

3
 Metodologías que permitan la degradabilidad de
los plásticos
Plásticos
oxo-degradables
Origen y Producción
Obtenidos naturalmente
Plásticos
bio-degradables Sintetizados a partir de fuentes
renovables.
Producidos por microorganismos
o modificados genéticamente.
Mezclas de polímeros
biodegradables.
Fuente: European Bioplastic, 2009,
Ejemplos
biomasa. Celulosa, Almidón,
Quitosan
Poli-ácido láctico(PLA), poli-
ácidos glicoles(PGA), poli-
caprolactonas(PCL)
Poli-hidroxialcanoatos(PHAs),
poli-3-hidroxibutarato (PHB)
Polivinilalcohol (PVOH) +
policaprolactonas (PCL)
4
 Polímeros Biodegradables

Producción mundial
de Bioplásticos

Biodegradable
No Biodegradable
Total

Fuente: European Bioplastic, Mayo 2011

5
 Polihidroxialcanoatos (PHAs)

Sustratos
agroindustriales
Agua

CO2
Agua

Oxígeno
Biodegradación Energía
(Compostaje) Fermentación

Moldeo Los PHAs son bioplásticos

producidos intracelularmente por
Productos Obtención,
Extracción y
bacterias, poseen propiedades
Bioplásticos purificación PHAs termoplásticas, son biodegradables,
biocompatibles, además, poseen un
alto grado de polimerización y de
Reciclaje cristalización.

6
 Microorganismos productores de PHAs

La síntesis bacterial de Polihidroxialcanoatos (PHAs) en diversas

especies, más de 300 en total, permite acumular intracelularmente
grandes cantidades de polímero (aproximadamente 90% del peso celular)
debido al metabolismo y a los requerimientos energéticos empleados por
éstas bacterias.

Bacterias que acumulan PHAs

Bacteria % peso seco
Ralstonia eutropha 96
Ralstonia eutropha ATCC 17699 80-90
Rhodobacter 80
Azospirillum 75
Azotobacter 73
Methylocystis 70
Leptothrix 67
Pseudomonas 67
Baggiatoa 57
Rhizobium 57

7
Fuente: http://www.biopolymer.net
 Ralstonia eutropha ATCC 17699

La bacteria Ralstonia eutropha ATCC 17699 es la más

estudiada para la producción de PHAs, debido a su
excelente capacidad para acumular una gran cantidad de
polímero como el ácido Polihidroxibutirato (PHB) a partir
de fuentes de carbono simples como fructosa, glucosa,
ácido acético y fuentes de carbono no convencionales como
almidones, melazas y suero de leche.

Material
celular

Ralstonia eutropha ATCC 17699

8
Ruta Metabólica de Ralstonia eutropha ATCC 17699
para la producción de PHAs

Azúcares
Ruta Metabólica I
Acetil-CoA
Ruta Metabólica III
PHAs scl: PHB
Malonil-CoA
PHA con 3HV

PHAs mcl: Poly(3HA) (R)-3-Hidroxiacil-CoA

Ácidos
Ruta Metabólica II
PHAs mcl: PHA con 4HB Grasos
PHA con HH

Otras Rutas Metabólicas
Dependiendo de la fuente de
carbono.
Los scl – PHA tiene propiedades cercanas a los
plásticos convencionales, mientras que los mcl –
PHA son considerados como elastómeros y
gomas.
9
 Polihidroxialcanoatos (PHAs)

O CH2 O (CH2)n O CH2

Todos los PHAs se caracterizan por
CH C CH C CH tener el mismo monómero con
CH3 O R O CH3
diferente radical alquilo que varía de 1
a 14 carbonos.

Los PHAs pueden ser divididos en

R = hidrógeno Poly(3-hidroxipropionato)
R = metil Poly(3-hidroxibutirato)
tres extensos grupos:
n=1 R = etil Poly(3-hidroxivalerato)
R = propil Poly(3-hidroxihexanoato)  Short chain length (scl - PHA)
R = pentil Poly(3-hidroxioctanoato)
R = nonil Poly(3-hidroxidodecanoato)
 Medium chain length (mcl - PHA)
 Long chain length (lcl – PHA).
n=2 R = hidrógeno Poly(4-hidroxibutirato)
R = metil Poly(4-hidroxivalerato)

n=3 R = hidrógeno Poly(5-hidroxivalerato)

R = metil Poly(5-hidroxihexanoato)

10
 Objetivos

Objetivo Evaluar la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs)

empleando sustratos no convencionales.
General

Evaluar los sustratos harina de yuca y banano de rechazo

para la producción de PHAs a nivel de erlenmeyer y a
Objetivos nivel de 5L.

Específicos Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el

biopolímero obtenido.

11
 Metodología

Activación y
Conservación del
microorganismo.

Obtención y
estandarizació
n del inóculo.
Determinación de
la relación C/N
mínima para el
microorganismo.
Extracción Caracterización
Producción de y Cuantificación estructural y termo-
PHAs en Purificación del PHA. mecánica del polímero.
sustratos del PHA.
convencionales
. Producción de
PHAs empleando
banano de
rechazo a Separación y
diferentes C/N.
Obtención del Caracterización del
Metabolito PHA

Producción de
PHAs

12
Análisis macroscópico de la colonia y microscópico de la bacteria y la formación
intracelular del polímero.

Metodología Resultados
Análisis Macroscópico de la
Se realizó un análisis Colonia PHB patrَ n
cualitativo de la acumulación
del polímero por medio de Bacteria 0 h
Se hizó con
tinciones el Negro
análisis de la
Sudán
formación y polimerización Bacteria 3 h

Intensidad (u.a)
Por medio del
intracelular cultivo enencaja
del polímero el Petri se
realizó
tiempo,un poranálisismedio
Macroscópico
de de la Bacteria 6 h

colonia bacteriana
Espectroscopía y por medio del método
Raman. Bacteria 12 h
de siembra en superficie de la caja se
realizó un análisis Microscópico del Bacteria 24 h
microorganismo para determinar la Análisis Microscópico del
morfología de la colonia . Se realizó microorganismo Bacteria 32 h

tinción Gram 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200
-1
Nْ mero de onda  (cm )

LB TSB TFY

13
 Determinación de los requerimientos nutricionales mínimos para el microorganismo

Resultados
Balance Global:
CH2O + oO2 + aNH3 = Yx/s CH1.77O0,5N0,248 + wH2O + cCO2
 Balance de Carbono:
1 = Yx/s + c 1
Luego:
 Balance de Nitrógeno:
De 4: o = 0,4781
a = 0,248Yx/s 2
De 1: c = 0,5
 Balance de Oxígeno:
De 2: a = 0,124
1 + o = 0,5Yx/s + w + c 3
De 3: w = 0,7276
 Electrones disponibles:

Гs + o ГO2 = ГxYx/sc 4

De este modo la ecuación de crecimiento para Ralstonia eutropha ATCC 17699 será:
CH2O + 0,4781O2 + 0,124NH3 = 0,5CH1.77O0,5N0,248 + 0,7276H2O + 0,5CO2
C6H12O6 + 2,87O2 + 0,744NH3 = 3CH1.77O0,5N0,248 + 4,366H2O + 3CO2

Con base en está ecuación la relación Carbono/Nitrógeno para no limitar el crecimiento celular será:
6,91gC/gN. Al emplear Glucosa como fuente de carbono y Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno la
relación C/N determinada fue 3,4562 g C/g N.

14
Evaluación de diferentes relaciones C/N para la producción de PHAs

Metodología
Se realizó un diseño experimental multifactorial categórico, empleando el paquete
estadístico Statgraphics centurión XVI.I, se evaluaron cinco relaciones
Carbono/Nitrógeno (5; 6,9; 10; 20; 40) para dos medios de cultivo empleando
fuentes de carbono convencionales como la glucosa y la fructosa.

Los treinta experimentos que arrojó el diseño de experimentos fueron llevados a cabo bajo
las mismas condiciones operacionales establecidas, 30oC, 150 rpm y 36 horas. La
extracción y purificación del polímero, se realizó empleando la metodología descrita. Las
variable respuesta fue la concentración de PHA en (g/L).

Resultados
Producción
Producciónde
dePHAs
PHAsempleando
empleandoFructosa
Glucosa y Sulfato de Amonio
a diferentes relaciones C/N.

15
Composición y Preparación del medio de cultivo de Producción empleando
sustratos no convencionales

Determinación de Azucares reductores y glucosa

Harina de Banano de
yuca Rechazo
Azucares Reductores (g/L) 259,16±0,001 50,16±0,4
Glucosa (g/L) 248,29±0,001 31,98±0,02

Análisis de Absorción atómica

Análisis Bromatológico Jarabe Glucosado
Metal Harina de Banano de
Banano yuca Rechazo
Harina de
Metal de Potasio (% de K) 0,15±0,001 775,6±10,1
yuca
Rechazo Sodio (mg de Na/kg) 18,0±0,2 1,73±0,08
% Humedad 79,26 79,20 Calcio (mg de Ca/kg) 16,1±0,8 8,03±0,9
% cenizas 0,44 0,80 Hierro (mg de Fe/kg) 6,14±0,09 0,0643±0,003
% proteínas 0,95 1,35 Manganeso (mg de Mn/kg) 0,605±0,006 1,84±0,01
% Grasa total 0,04 0,03 Cobre (mg deCu/kg) Menor de Menor de 0,0045
% Carbohidratos 19,31 18,62 0,0045
Calorías Kcal/100g 81,4 80,15 Magnesio (mg de Mg/kg) 84,3±1,1 41,4±0,1
Niquel (mg de Ni/kg) 0,0254±0,002 Menor de 0,008
Cobalto (mg de Co/kg) 0,0854±0,0013 Menor de 0,01
Zinc (mg de Zn/kg) 0,428±0,008 0,279±0,001
16
Obtención y caracterización del jarabe glucosado obtenido a partir de Banano de
Rechazo y harina de yuca.

Producción de PHAs en el medio de cultivo suplementado con

macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de banano de rechazo a
diferentes relaciones C/N.

Producción de PHAs en el medio de cultivo suplementado con

macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de harina de yuca y
sulfato de amonio a diferentes relaciones C/N.

17
Obtención y caracterización del jarabe glucosado obtenido a partir de Banano de
Rechazo y harina de yuca.

Producción de PHAs en el medio de cultivo sin suplementación con

macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de banano de rechazo a
diferentes relaciones C/N.

Producción de PHAs en el medio de cultivo sin suplementación con

macroelementos y empleando jarabe glucosado a partir de harina de yuca y
sulfato de amonio a diferentes relaciones C/N.

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 Evaluar la producción de PHA en reactor de 5L empleando
2. Objetivo el mejor medio no convencional.

Metodología

Se empleó un biorreactor Bioengineering RALF plus® con un volumen útil de 3 litros,

agitado mecánicamente con control de pH y Temperatura. Al reactor se le adicionó agua
destilada con la fuente de carbono en una concentración de 20g/L y se esterilizó. Todos
los macroelementos y microelementos fueron preparados y suministrados al reactor uno
a uno. El reactor se inoculó con un cultivo previamente activado en medio de cultivo TSB.

El proceso fermentativo se llevó a cabo a 30oC y 150 rpm durante 36 horas. Para el
análisis de los resultados se tomaron 50 mL de muestra cada 6 horas. A cada muestra se
le evaluó la concentración de biomasa en g/L, la concentración de biopolímero en g/L y el
consumo de sustrato .

Resultados

19
 Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el
3. Objetivo biopolímero obtenido.

Resultados

Análisis Infrarrojos Análisis Raman

1,0

0,5
PHA empleando
PHB comercial harina de yuca
0,0

1,0
PHA empleando

Intensidad (u.a)
Banano glucosa
0,5

0,0 PHA empleando

Banano de rechazo
1,0

0,5
Fructosa
PHA empleando
fructosa
0,0

1,0 PHB patrَ n

0,5 Harina
400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200
0,0 -1
Nùmero de onda  (cm )
1,0

0,5
Glucosa

0,0 Compatibilidad con el patrón y según base de

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 datos del FTIR del 98%.
Numero de Onda (cm-1)

20
 Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el
3. Objetivo biopolímero obtenido.

Resultados

Análisis Raman
Variación en la cantidad de sustrato

21
 Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el
3. Objetivo biopolímero obtenido.

Resultados
Análisis DSC
Propiedades térmicas de los polímeros sintetizados por R. eutropha empleando
diferentes sustratos.

Comparación de las propiedades físicas de algunos PHAs y

algunos polímeros convencionales

22
 Caracterizar estructural y termo-mecánicamente el
3. Objetivo biopolímero obtenido.

Resultados
Análisis DSC
Propiedades térmicas de los polímeros sintetizados por R. eutropha empleando
diferentes sustratos.

Tm2
Tm1
0
Tg
Heat Flow (W/g)

-1
Tcc

-2

-3
––––––– Banano
––––––– Fructosa
––––––– Glucosa
––––––– Harina
––––––– PHB comercial
-4
-20 30 80 130 180
Exo Up Temperature (°C) Universal V4.2E TA Instruments

23
 Algunas Referencias Bibliográficas
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21.2007.
[2] Informe de European Bioplastics. Disponible en: http://www.european-bioplastics.org/com. Acceso el 20 de
junio de 2007.
[3] LEIA, Centro de desarrollo tecnológico. Bioplásticos. 2009.
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Progress Polimers in polymer science. 2000; 25:1503-1555.

24
GRACIAS