Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
1407 - Biotecnologia y 2315 PDF
1407 - Biotecnologia y 2315 PDF
OBJETIVO
METODOLOGA
Construccin y clonado del fragmento de ADN codificante del scFv anti rhFSH.
Una vez definidas las secuencias VH y VL correspondientes al mAb P1E4, se
disearon 6 primers especficos para la construccin del scFv y el clonado del mismo en el
vector pET22b (Novagen). Este vector incorpora en la protena de inters, el pptido seal
pelB, que la direcciona al espacio periplsmico de las clulas, y una etiqueta constituida por
6 residuos de histidina, en el extremo C-terminal de las mismas. Se agregaron sitios de
restriccin en los primers 5 VH y 3 VL, mientras que en los 4 oligos restantes se anexaron
las secuencias correspondientes para permitir el solapamiento de los 3 fragmentos (VH,
linker y VL) mediante la tcnica de PCR-overlapping. La secuencia del linker se obtuvo a
partir del scFv anti-rhIFN-2b generado con anterioridad en nuestro laboratorio.
En un primer paso se amplificaron por PCR las tres secuencias VH, VL y linker.
Posteriormente, se procedi a solapar los fragmentos VH y linker, cuyas secuencias 3 y 5
son complementarias, respectivamente. De esta forma, primero se obtuvo el fragmento
[VH-linker] y luego, repitiendo dicho procedimiento con los primers correspondientes, el
fragmento [VH-linker-VL], el cual constituye el scFv. Para el clonado, se realiz una
digestin con enzimas de restriccin NcoI/HindIII, tanto del fragmento como del vector
pET22b, y se procedi a la ligacin y transformacin de clulas competentes E.coli Top10.
Los clones positivos fueron identificados mediante la amplificacin del fragmento VH-linker
por colony-PCR. Posteriormente, se prepar ADN plasmdico de estos clones y se digiri
con enzimas de restriccin para corroborar la identidad de los mismos.
RESULTADOS
A partir del anlisis bioinformtico de las secuencias obtenidas, se logr, por un lado,
descartar varios clones cuyas secuencias resultaron homlogas a otras protenas, y por el
otro, agrupar aquellas con elevado grado de homologa a secuencias de inmunoglobulinas
murinas, en 10 grupos: 5 grupos VH y 5 grupos VL. Mediante la traduccin y el alineamiento
de estos grupos se definieron 2 secuencias consenso VH (VH016 y VH058) y dos VL
(VL088 y VL101). Sin embargo, slo se logr la identificacin de los 3 CDRs en las
secuencias VH016, VH058 y VL088. La comparacin de las 4 secuencias con las
secuencias VH y VL publicadas por Ding et al. en su artculo del 2010, permiti identificar la
secuencia VL101 como un transcripto kappa aberrante derivado del propio hibridoma y la
secuencia VH058 como otra secuencia aberrante con un 99% de homologa a transcriptos
VH no funcionales. Mientras que, por otro lado, posibilit corroborar la identidad de las
secuencias VH016 y VL088.
CONCLUSIONES
En el transcurso de este trabajo se logr aislar las secuencias codificantes de las
regiones VH y VL del mAb P1E4 anti-rhFSH. Adems, se consigui diferenciar secuencias
aberrantes correspondientes a cada una de estas regiones. Se construyeron fragmentos de
anticuerpo scFv con las secuencias aisladas mediante la tcnica de PCR-overlapping.
Como perspectiva de trabajo, estos fragmentos scFv sern expresados en
citoplasma y en espacio periplsmico de las clulas E. coli SHuffle T7 pLys (NEB) y BL21
Rosetta (Novagen), respectivamente. Sern evaluados por su capacidad de reconocer
rhFSH, mediante la tcnica de ELISA especfico indirecto. Posteriormente sern purificados,
mediante cromatografa de afinidad a iones metlicos (IMAC), para ser utilizados como
ligando en una cromatografa de inmunoafinidad para la purificacin de dicha hormona.
BIBLIOGRAFA