Manual de Bacter I PDF

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
MANUAL DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGA I
AUTORES:
M.C. REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZN
M.C. GLORIA LEN TELLO
M.C. ALMA LPEZ GARCA
M.C. MARA SUSANA PERZ FERNNDEZ
M.C. PATRICIA GUADALUPE SUREZ ALBORES
D.C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO
M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA
NDICE
NMERO DE
PRCTICA
Prctica 1
TTULO
Aplicacin de los criterios de Cowan y Steel para
PGINA
la identificacin de bacterias
Prctica 2
Caracterizacin de bacterias no fermentadoras
Prctica 3
Caracterizacin del gnero Pseudomonas
13
Prctica 4
Caracterizacin del gnero Haemophilus
15
Prctica 5
Caracterizacin del gnero Brucella
17
Prctica 6
Caracterizacin de bacterias de los gneros

Neisseria y Moraxella
19
Prctica 7
Caracterizacin de enterobacterias: lactosa

positivas
21
Prctica 8
Caracterizacin de enterobacterias: lactosa

negativas
25
Prctica 9
Caracterizacin del gnero Vibrio
28
Prctica 10
Caracterizacin de bacterias de los gneros

Streptococcus y Enterococcus
30
Prctica 11
Caracterizacin de bacterias del gnero

Staphylococcus
Caracterizacin de bacilos Grampositivos: Bacillus
33
Prctica 12
Bibliografa
36
38

PRACTICA No.1
APLICACIN DE LOS CRITERIOS DE COWAN Y STEEL PARA LA
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
Introduccin
La identificacin de una bacteria es la asignacin a un taxn segn una clasificacin dada y
consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de
estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas
a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en
la identificacin.
Cowan y Steel establecen un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las
cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso, familia a la que
pertenece un aislamiento. Dichas pruebas son:
1.- Tincin de Gram.

2.- Tincin de Shaeffer-Fulton (slo en caso de tener bacilos Grampositivos (BGP)).
3.- Tincin de Ziehl-Neelsen (slo en caso de tener bacilos BGP).
4.- Metabolismo (Oxidativo/Fermentativo/Inerte).
5.- Produccin de catalasa.
6.- Produccin de oxidasa.
7.- Movilidad.
8.- Crecimiento de aerobios.
9.- Crecimiento de anaerobiosis.
10.- Produccin de cido a partir de glucosa.
Tambin se pueden incluir pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.

Estas dependern del gnero o familia determinado. (ejem. produccin de pigmentos, produccin
de indol a partir de triptfano, produccin de coagulasa, de fenilalanina desaminasa, etc.)
Objetivo
Realizar tomando como base los criterios establecidos por Cowan y Steel, las pruebas
bioqumicas fundamentales, que permiten la identificacin presuntiva de las bacterias de inters
mdico.
Material
Equipos de tincin de Gram
Tubos con O/F con glucosa
Sensidiscos de oxidasa
Placas con agar nutritivo o soya tripticasa
Reactivo para catalasa

Portaobjetos
Benzal
Algodn
Cepas de bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores
Metodologa
Tomar una cepa problema a la cual se le realizar lo siguiente:
1. Inocular por estra cruzada una placa de agar nutritivo, incubar a 37C durante 24 h.
2. De una colonia aislada realizar la tincin de Gram (ver figura 1)
Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una
pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un
portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.
Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.
Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante
y lavar con chorro suave de agua corriente.
Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un min. Escurrir y lavar.
Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 seg. Escurrir y lavar.
Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 seg. Escurrir y lavar.
Dejar secar al aire.
Observar el frote con objetivo de inmersin.
Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada

cepa empleada.
Figura 1.Esquema y fundamento de tincin de gram
3. De una colonia aislada hacer la tincin de Shaeffer-Fulton (slo en caso de tener BGP)
(ver Figura 2).
Cubrir el frote con verde de malaquita a emisin de vapores y dejarlo actuar por un
minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente.
Cubrir el frote con safranina, como colorante de contraste dejarlo actuar por 1 min.
Escurrir y lavar.
Observar el frote con objetivo de inmersin y dibjala
Figura 2.Esquema y fundamento de tincin de Shaeffer y Fulton
4. De una colonia aislada realizar la tincin de Ziehl-Neelsen (slo en caso de tener BGP)
(ver Figura 3).
Cubrir el frote con fucsina fenicada a emisin de vapores durante 5 min. Escurrir el
colorante y lavar con chorro suave de agua corriente, no permitir que se seque el
colorante
Decolorar con alcohol-cido durante 7 min. Enjuagar con agua el portaobjetos y

quitar el exceso.
Aplicar azul de metileno durante 1 min, volver a enjuagar con un leve chorro de agua
e inclinar el portaobjetos hasta drenar el exceso de agua y secar al aire.
Colocar una pequea gota de aceite de inmersin y observar al microscopio con 100x
Figura 3.Esquema y fundamento de tincin de Gram
5. Inocular por picadura el medio O/F e incubar a 37C por 24 h (ver figura 4)
Figura 4. Metabolismo bacteriano en medio O/F
6. Inocular por picadura el medio MIO e incubar a 37C por 24 h, si se observa turbidez en
el tubo ser movilidad positiva y movilidad negativa cuando crece nicamente en la estra
7. Inocular por picadura una base de CTA con un carbohidrato e incubar a 37C por 24 h, si
se observa vire a color amarillo ser positivo a formacin de cido a partir de glucosa.
8. Del crecimiento en placa realizar las pruebas de oxidasa y catalasa.
9. Comparar los resultados en la tabla 1 e identificar familia o gnero.
Tabla 1. Identificacin de bacterias hetertrofas segn Cowan y Steel

Tincin de Gram
(cultivo fresco)
Forma
Agrupacin
coco
Coco
coco
coco
bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco
racimos Racimos cadenas tetradas
pares
Crecimiento
aerobio
Crecimiento
anaerobio
Esporas
Movilidad
+o
+o
+o
+o
+o
+o-
Catalasa
Oxidase
Fermentacin de
glucosa a acido
o a acido+gas
+ (o )
O/F
Micrococcus
Staphylococcus
Streptococcus
Lactococcus
Enterococcus
Leuconostoc
Pediococcus
Aerococcus
Lactobacillus
Clostridium
Bacillus
X
X
X
X
X
Alcaligenes
Pseudomonas
X
X
Enterobacterias
Aeromonas
Chromobacterium
Neisseria
Fuente: 3
Cuestionario:
1. Cul es la importancia de los criterios de Cowan y Steel?
2. Para qu sirve la tincin de Ziehl-Neelsen y cul es su fundamento?
3. Cul es el fundamento de la prueba de oxidasa y de catalasa y cmo se realiza en el
laboratorio?
4. En qu medios se puede realizar la prueba de movilidad y cmo se interpreta?

5. D cada uno de los criterios de Cowan y Steel efectuados a la cepa de estudio durante la
prctica, realiza dibujos y menciona tus resultados.

PRACTICA No. 2
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS NO FERMENTADORAS
Introduccin
Este grupo abarca microorganismos aerobios, no esporulados, que no utilizan a los carbohidratos
como fuente de energa o los utilizan a travs de vas metablicas diferentes a la fermentacin.
La importancia de estas bacterias radica fundamentalmente en su capacidad para infectar

hospederos inmunocomprometidos, por lo que cobran especial inters a nivel intrahospitalario,
donde adems es comn la presencia de cepas con marcadas caractersticas de resistencia a los
antimicrobianos de uso convencional. Dentro de este grupo se encuentran los siguientes gneros:
Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Flavobacterium, Agrobacterium, entre
otros.
Algunos de los indicios tempranos para detectar a un microorganismo no fermentador

seran los siguientes:
1. Falta de evidencias de fermentacin de la glucosa.

2. Positiva la prueba de oxidasa.
3. Carencia de crecimiento en el agar de Mac Conkey.
En la rutina bacteriolgica es necesario rapidez y bajo costo en la identificacin de este

grupo de bacterias, por lo que se sugiere se siga el esquema de King-Weaver para su
identificacin, el cual se basa en 4 pruebas (ver tabla 2):
10
1. Utilizacin de glucosa (fermentador (F), oxidador (O) o no sacaroltico (NS)).

2. Capacidad de crecer en Mac Conkey.
3. Produccin de citocromo oxidasa.
4. Movilidad.
Tabla 2. Caractersticas de algunos gneros gramnegativos no fermentadores

GNERO
METABOLISMO
MOVILIDAD
OXIDASA
CREC
MAC
CONKEY
OTRAS
CARACTERSTICAS
Pseudomonas
+
flagelos polares
Desnitrifican nitratos
a N2
Acinetobacter
O NS
Parecen diplococos
Flavobacterium
V
algunos
presentan
flagelos
pertricos
Escaso o
negativo
Requieren complejo B
Bordetella
Escaso o
negativo
Requiere factores de
crecimiento
Moraxella
O NS
Escaso o
negativo
Stenotrophomonas
+
un solo flagelo
Cocobacilar, difcil de
crecer.
Prueba de DNasa +
Produccin de cido a
partir de O/F con
maltosa
Alcaligenes
O NS
+
flagelos
pertricos
Aerobio estricto
Fuente: 3
Objetivo
Comprobar por medio de anlisis de laboratorio, el comportamiento caracterstico de cepas
bacterianas no fermentadoras de carbohidratos.
Material
Placas con agar sangre de carnero
Placas con agar Mac Conkey
Portaobjetos
Tubos con Medio MIO
11
Benzal
Algodn
Caldos con BGNnF
Metodologa
1.- Sembrar por estra cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte del
estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero.
2.- Sembrar por picadura los medios O/F y MIO.
3.- Incubar 24 h a 37 C.
4.- Leer morfologa colonial.
5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram.
6.- Leer pruebas bioqumicas.
Cuestionario:
1. Por qu es importante identificar a los BGNnF y qu gneros conforman dicho grupo?
2. Cules son las pruebas claves para sospechar de un BGNnF?
3. Mencione un esquema diferente al de King-Weaver para identificar a los BGNnF
4. De los BGNnF que gneros dan la prueba de oxidasa negativa, quines movilidad
negativa y quines son capaces de crecer en Mac Conkey?
5. De la cepa problema responde lo siguiente con ayuda de dibujos:
a) Morfologa colonial
b) Tincin de Gram
c) Pruebas de catalasa y oxidasa
d) Pruebas bioqumicas
e) Establecer si la cepa pertenece al grupo de BGNnF
12

PRCTICA No.3
CARACTERIZACIN DEL GNERO Pseudomonas
Introduccin
Este gnero se encuentra ubicado dentro del grupo de BGNnF y ocupa dentro de stos, el primer
lugar como agente causal de infecciones intrahospitalarias, resaltando la capacidad de resistencia
presente en algunas cepas a desinfectantes elaborados a partir de sales cuaternarias de amonio.
De las especies que integran este gnero destacan: Pseudomonas aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps.
alcaligenes, Burkholderia cepacia (anteriormente llamada Pseudomonas cepacia). Siendo en el
ambiente clnico P. aeruginosa la especie aislada con mayor frecuencia (ver tabla 3).
Tabla 3. Caractersticas importantes del grupo fluorescente
Prueba
Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas
putida
Piocianina
Pioverdina
V (74 %)
V (19 %)
Reduccin de nitratos
Desarrollo a 42 C
Objetivo
Demostrar las particularidades bioqumicas y de cultivo del gnero Pseudomonas.
Material
13
Placas con agar Mac Conkey
Portaobjetos
Tubos con agar MIO
Benzal
Tubos con agar Sellers
Algodn
Cepas con diferentes especies de Pseudomonas
Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada los medios en placa, procurando perforar el medio en la parte
del estriado masivo, en el caso del agar sangre carnero.
2. Sembrar por picadura los medios O/F y MIO.
3. Sembrar por picadura y estra el medio Sellers.
4. Incubar 24 h a 37 C.
5. Leer morfologa colonial.
6. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de
Gram.
7. Leer pruebas bioqumicas e identificar especie utilizando la tabla 3.
Cuestionario
1. Cul es la importancia del gnero Pseudomonas?
2. Qu pruebas de laboratorio permiten diferenciar una enterobacteria del gnero
Pseudomonas?
3. Para qu es til el medio O/F y cul es su fundamento?
4. Por qu es importante utilizar el medio Sellers, en la identificacin de Pseudomonas?
5. Qu pruebas de laboratorio son tiles para diferenciar especies de Pseudomonas?
14

PRCTICA No. 4
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Haemophilus
Introduccin
Los miembros del gnero Haemophilus son bacilos gramnegativos pequeos, inmviles, que
requieren de factores de crecimiento presentes en la sangre como el factor X, que es un grupo de
compuestos tetrapirrlicos termoestables, como la hemina. Mientras que el factor V, es el
dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). Estos dos factores estn contenidos en los
eritrocitos, por lo tanto el agar chocolate es un buen medio de cultivo para la recuperacin de
Haemophilus. Las especies de Haemophilus humanos, estn vinculadas en su mayora con
infecciones del tracto respiratorio superior a excepcin de H. ducreyi que es un patgeno de
tracto genital.
Objetivo
Identificar el gnero Haemophilus
Material
Placas de agar chocolate
Placas con agar soya tripticasa
Sensidiscos con factores V y X
Portaobjetos
Benzal
Algodn
Cepas de Haemophilus spp

Tubos con medio urea
15
Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar chocolate.
2. Incubar 48-72 h a 37 C.
Gram.
5. Realizar pruebas de identificacin de especie en agar soya tripticasa con sensidiscos
impregnados de los factores V y X.
Cuestionario:
1. Cul es la importancia clnica de Haemophilus?
2. Existe algn agar comercial para el aislamiento de Haemophilus?
3. Menciona la(s) especies de Haemophilus que requieran el factor V, la(s) que requiera el
factor X y la(s) que requiera ambos factores.
4. Cmo definen Cowan y Steel a ste gnero?
5. Existe otras pruebas en la actualidad ms rpidas que el cultivo convencional para el
diagnstico de Haemophilus?
16

PRCTICA No. 5
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Brucella
Introduccin
El gnero Brucella abarca un grupo de microorganismos que son cocobacilos diminutos de
tincin dbil, considerados como parsitos intracelulares facultativos y desarrollo lento en agar
sangre. Son responsables de la brucelosis, considerada enfermedad zoontica, que se adquiere por
estar en contacto con animales infectados o por la ingesta de productos lcteos no pasteurizados,
la cual es difcil de diagnosticar, debido al amplio espectro de manifestaciones clnicas asociadas.
Se conocen
pocas especies de Brucella, con ligera especificidad del husped: B.
melitensis infecta cabras y ovejas, B. abortus infecta vacas, B. suis infecta cerdos, B. ovis infecta
ovejas y B. neotomae infecta cerdos.
Objetivo
Identificar al gnero Brucella.
Material
Equipos de tincin de Gram.
Sensidiscos de oxidasa .
Reactivo para catalasa.
Cepas de Brucella spp.
Botellas para hemocultivo
Placas de agar sangre
17
Tubos para prueba de urea

Colorantes fucsina bsica, tionina y azul de tionina.
Metodologa
1. Sembrar en botellas para hemocultivo.
2. Incubar a 35 C durante 4-6 semanas.
3. Hacer subcultivos en agar sangre y chocolate.
4. Identificar especies, mediante pruebas bioqumicas como necesidad de CO2, produccin
de ureasa y sensibilidad a los colorantes fucsina bsica, tionina y azul de tionina.
Cuestionario:
1 Cul es la importancia clnica del gnero Brucella?
2 Qu especies de Brucella requieren CO2 para crecer, cuales producen H2S y cuales
ureasa?
3 Cul es la dosis infectiva de Brucella?
4 Qu dao les puede causar Brucella a las vacas?

5 En qu consiste la prueba de Rosa de Bengala?
18

PRCTICA No.6
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DE LOS GNEROS Neisseria y
Moraxella
Introduccin
Los miembros del gnero Neisseria son microorganismos gramnegativos cocoides o baciliares
que pueden encontrarse en pares o en cadenas cortas. Son inmviles, no forman esporas y
producen cido a partir de carbohidratos lo que permite identificar especies. Neisseria
gonorrhoeae es la especie de importancia en salud publica ya que se adquiere por transmisin
sexual.
Neisseria catarrhalis ahora conocida como Moraxella catarrhalis, puede ser responsable
de infecciones respiratorias principalmente en nios y ancianos, crece en agar chocolate y agar
nutritivo, no produce cido a partir de glucosa, maltosa, fructosa, sacarosa no lactosa.
Objetivo
Identificar los gneros Neisseria y Moraxella.
Material
Placas de agar Thayer-Martin
Placas con agar chocolate
Placas con agar nutritivo
Portaobjetos
Benzal
Algodn
Placas con agar DNAsa
Cepas de Neisseria spp
19
Cepas de Moraxella spp.

Tubos con CTA con diferentes carbohidratos
Metodologa
Para Neisseria
1. Sembrar una placa de Thayer-Martin en forma de Z y luego estriar.
2. Incubar 24-48 horas a 37 C.
Gram.
5. Realizar pruebas de identificacin de especie en bases de CTA con diferentes
carbohidratos.
Para Moraxella
1. Sembrar en agar chocolate y agar nutritivo.
2. Incubar 24-48 horas a 37 C.
4. Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa, tincin de Gram
y DNAsa.
Cuestionario:
1. Cul es la importancia clnica de Neisseria gonorrhoeae?
2. Qu tipo de medio es el Thayer-Martin?
3. Menciona las especies de Neisseria y su comportamiento frente a los diferentes
carbohidratos.
4. Cul es la importancia clnica de Moraxella catarrhalis?
5. Qu tipo de muestra debe utilizarse para la bsqueda de Neisseria gonorrhoeae y cual
para Moraxella catarrhalis?
20

PRCTICA No.7
CARACTERIZACIN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA POSITIVAS
Introduccin
La familia Enterobacteriaceae est conformada por un nmero importante de especies, que
incluyen bacilos gramnegativos, con metabolismo fermentador, anaerobios facultativos, catalasa
positivos, oxidasa negativos, la mayora son mviles, reducen los nitratos a nitritos, y no
presentan condiciones nutritivas exigentes, crecen muy bien en agar Mac Conkey.
La familia Enterobacteriaceae tiene como nicho ecolgico el tracto intestinal de gran

variedad de seres vivos, incluyendo al hombre, lo cual facilita su presencia prcticamente en todo
lugar. La mayora de las enterobacterias son parte importante de la microbiota intestinal,
comportndose como patgenos solo en el caso de pacientes inmunocomprometidos (patgenos
oportunistas).
Con el objeto de facilitar la caracterizacin de esta familia se ha dividido con base a la

capacidad de fermentar lactosa en dos grupos: lactosa positivos, los que la fermentan y los lactosa
negativos los que no poseen el sistema enzimtico que les permite llevar a cabo el proceso.
Tambin es necesario el empleo de pruebas bioqumicas y fisiolgicas para establecer el grupo
bacteriano.
La fermentacin bacteriana de la lactosa es ms compleja que la de la glucosa. La lactosa

es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa, unidas entre si por un enlace glucosdico.
Para que una bacteria pueda metabolizar a la lactosa debe tener a la enzima beta-galactsido
21
permeasa, que transporta a la lactosa al interior de la bacteria y la beta-galactosidasa, necesaria

para hidrolizar el enlace glucosdico y liberar a la glucosa y galactosa, finalmente la glucosa entra
a la ruta de Embden-Meyerhof para la formacin de cidos mixtos los cuales pueden ser
detectados en un medio de cultivo con un indicador de pH (ver tabla 4).
Objetivo
Determinar por medio de ensayos de laboratorio las caractersticas bioqumicas que definen a la
familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa positivas.
Material
Placas de agar Mac Conkey
Placas con agar EMB
Benzal
Portaobjetos
Algodn
Cepas de Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter.
Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas.
Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada placas de Mac Conkey y EMB.
2. Inocular pruebas bioqumicas.
3. Inocular galeras.
4. Incubar.
5. Leer morfologa colonial, pruebas bioqumicas, realizar tincin de Gram, catalasa,
oxidasa.
6. Comparar resultados en la tabla 4 y establecer gnero y especie.
22
Tabla 4. Diferenciacin de enterobacterias mediante pruebas bioqumicas
Fuente: Seccin Entrica y Rama de Entrenamiento Bacteriolgico. CDC
23
Cuestionario:
1. Cul es la importancia mdica de esta familia?
2. Las enterobacterias se han clasificado en dos grupos: lactosas (+) y lactosas (-), qu
gneros de importancia mdica se encuentran en cada uno de estos grupos?
3. De las bacterias lactosa positivas menciona a las inmviles y a las que son capaces de
producir H2S?
4. Cules son las pruebas bioqumicas que permiten identificar a las enterobacterias y
menciona el fundamento bioqumico de cada una de ellas?
a) Morfologa colonial.
b) Tincin de Gram.
c) Pruebas de catalasa y oxidasa.
d) Pruebas bioqumicas.
e) Establecer gnero y especie de la cepa problema.
24

PRCTICA No. 8
CARACTERIZACIN DE ENTEROBACTERIAS: LACTOSA
NEGATIVAS
Introduccin
Dentro de las bacterias lactosa negativas se encuentran los patgenos primarios como es el caso
de Salmonella spp, Shigella spp y Yersinia spp.
La tribu Salmonelleae contiene un nico gnero Salmonella y reciben el nombre del

bilogo estadounidense Salmon. Esta tribu est relacionada con la salmonelosis que es una causa
importante de enfermedad entrica bacteriana en seres humanos y animales. Se estima que
ocurren 1.4 millones de casos anuales de salmonelosis en seres humanos en los Estados Unidos.
Estas infecciones son causadas por ingesta de alimentos, agua o leche contaminados con
excremento de animales o humanos. Las salmonelas son patgenos primarios de los animales
inferiores como vacas, cerdos, mascotas, etc. que constituyen la fuente principal de salmonelosis
no tifoidea en los humanos. Mientras que Salmonella typhi es especfico del humano y causa
fiebre tifoidea.
La shigelosis es la ms contagiosa de las diarreas causada por Shigella, la enfermedad es

transmitida por va fecal-oral y se requieren tan solo 200 bacterias viables para producir la
enfermedad.
25
Se conocen 3 especies del gnero Yersinia: Y. pestis, Y, pseudotuberculosis y Y.

enterocolitica. La peste bubnica es causada por Y. pestis, es una enfermedad de la antigedad
que persiste en los tiempos modernos, es una enfermedad zoontica, transmitida por un roedor a
otro o del roedor al hombre a travs de las pulgas (ver tabla 4).
Objetivo
Determinar por medio de ensayos de laboratorio las caractersticas bioqumicas que definen a la
familia Enterobacteriaceae y a las enterobacterias lactosa negativas.
Material
Placas con agar Salmonella-Shigellla (SS)
Benzal
Portaobjetos
Cepas de Salmonella sp, Shigella sp, Proteus sp
Algodn
Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas
Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada placas de Mac Conkey y SS.
2. Inocular pruebas bioqumicas.
3. Inocular galeras.
5. Leer morfologa colonial, pruebas bioqumicas, realizar tincin de Gram, catalasa,
oxidasa.
6. Comparar resultados con ayuda de la tabla 4 y establecer gnero y especie.
Cuestionario:
1. Qu gneros son lactosa negativa?
2. Cul es la importancia de las enterobacterias lactosa negativas?
3. De las lactosas negativas, menciona a las enterobacterias inmviles y a las que son
capaces de producir H2S?
26
4. Cul es una caracterstica importante de la tribu Proteae y porqu?

b) Tincin de Gram
e) Establecer gnero y especie de la cepa problema
27

PRCTICA No. 9
CARACTERIZACIN DEL GNERO Vibrio
Introduccin
Este gnero se define como bacilos gramnegativos, fermentadores, mviles, catalasa y oxidasa
positivas. Algunas especies se caracterizan por ser haloflicas. Todos los gneros se consideran
patgenos, resaltando en
particular Vibrio cholerae
por ser el agente causal del clera,
enfermedad que se presenta comnmente en forma epidmica, sobre todo en pases en vas de
desarrollo (ver tabla 5).
Tabla 5. Diferenciacin entre biotipos de Vibrio cholerae
Prueba
Clsica El Tor
Prueba del filamento
+
+
+
-hemlisis en agar sangre de carnero
Prueba de CAMP
+
Prueba de Voges-Poskauer
+
Aglutinacin de eritrocitos de pollo
+
Sensibilidad a 50 U de polimixina B
S
R
Susceptibilidad al fago IV
S
R
Objetivo
Determinar con base a las pruebas de laboratorio correspondientes, las caractersticas
bioqumicas ms relevantes de este gnero.
Material
28
Placas de agar TCBS
Benzal
Portaobjetos
Cepas de Vibrio cholerae y V. parahaemolyticus.
Algodn
Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CITRATO Y UREA para pruebas bioqumicas
Metodologa
1.- Sembrar por estra cruzada los medios en placa.
2.- Sembrar las pruebas bioqumicas convencionales.
3.- Incubar 24 horas a 37 C.
4.- Leer morfologa colonial.
5.- Realizar a partir de una colonia aislada, las pruebas de catalasa, oxidasa y tincin de Gram.
6.- Leer pruebas bioqumicas.
Cuestionario:
1. Qu gneros conforman a la familia Vibrionaceae?
2. Cul es la importancia clnica del gnero Vibrio?
3. Indique el mecanismo de patogenicidad de Vibrio cholerae.
4. Qu pruebas permiten diferenciar entre las especies de Vibrio?
b) Tincin de Gram
e) Establecer gnero y especie de la cepa problema
29

PRCTICA No.10
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DE LOS GNEROS Streptococcus y
Enterococcus
Introduccin
Estos gneros se caracterizan por ser cocos Grampositivos agrupados en pares o cadenas,
generalmente inmviles, catalasa negativos en general, no esporulados, aerobios y anaerobios
facultativos con metabolismo fermentativo en el que producen cido lctico, frmico, etanol y
CO2, crecen ptimamente a 37 C.
Enterococcus se encuentran de manera natural en muchos organismos, incluidos los
humanos, como parte de su flora intestinal. Son microorganismos muy resistentes, capaces de
tolerar concentraciones relativamente altas de sales y cidos.
El gnero de mayor inters mdico son los Streptococcus. Algunas especies forman parte
de la flora normal del hombre y otras estn relacionadas con cuadros clnicos de amigdalitis,
celulitis, erisipela, faringitis, rinitis, fiebre escarlatina, sepsis puerperal, neumona, endocarditis
bacteriana, caries, meningitis, infecciones en vas urinarias y heridas, fiebre reumtica, glomrulo
nefritis y conjuntivitis purulenta.
Objetivo
Caracterizar bioqumicamente a las especies ms importantes de ambos gneros.
Material
30
Caldos BHI con Streptococcus pyogenes
Caldos BHI con Streptococcus agalactiae
Portaobjetos
Caldos con Staphylococcus aureus
Algodn
Caldos BHI con Enterococcus sp
Benzal
Caldos con BHI con 6.5 % de NaCl
Placas con agar bilis-esculina
Sensidiscos con bacitracina (0.04 UI)
Sensidiscos con optoquina
Metodologa
HEMLISIS
ALFA
BETA
NO HEMLISIS
(GAMA)
Crece en 6.5% NaCl
Soluble en bilis
Sensible a bacitracina: S. pyogenes
Sensible a optoquina
Ennegrece la bilis
esculina
CAMP +
Hidrlisis del hipurato +: S. agalactiae
S. pneumoniae
Enterococcus
1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar sangre carnero.

2. Realizar pruebas de CAMP.
3. Realizar pruebas de sensibilidad a bacitracina.
4. Realizar pruebas de sensibilidad a optoquina.
5. Realizar tincin de Gram y observar al microscopio.
6. Incubar 24 horas a 37 C.
31

8. Interpretar resultados.
Cuestionario
1. Cul es la definicin del gnero Streptococcus?
2. Cul es el fundamento de la prueba de CAMP?
3. Para qu se utiliza la prueba de sensibilidad a bacitracina y optoquina?
b) Tincin de Gram
d) Otras pruebas
e) Establecer si la cepa en estudio pertenece al gnero de Streptococcus, de ser positiva la
respuesta, menciona la especie.
5. Menciona las especies ms importantes de Streptococcus y qu enfermedad producen.
32

PRCTICA No.11
CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Staphylococcus
Introduccin
Este gnero est constituido por cocos grampositivos, agrupados en racimos, catalasa positiva
con metabolismo fermentativo. Son responsables principalmente de infecciones supurativas de la
piel y tejidos blandos. As como de infecciones oportunistas. Se reconocen 3 especies de
importancia mdica: Sta. aureus, Sta. epidermidis, Sta. saprophyticus (ver tabla 6).
Tabla 6. Diferenciacin de las especies de Staphylococcus

PRUEBAS DE
S. aureus
S. epidermidis S. saprophyticus
LABORATORIO
Color de las colonias
Amarillo-
Blanco
Blanco
blanco
Hemlisis en agar sangre
+/-
Crecimiento anaerobio
+/-
Coagulasa y DNasa
Fermentacin de la glucosa
Fermentacin del manitol
-/+
Sensible
Sensible
Resistente
Novobiocina
Objetivo
33
Observar las caractersticas ms relevantes del gnero, resaltando aquellas que permiten su
diferenciacin con otros cocos grampositivos de cercana filiacin.
Material
Cepas de Staphylococcus aureus
Cepas de Staphylococcus epidermidis
Portaobjetos
Cepas de Staphylococcus saprophyticus
Algodn
Placas con agar DNasa
Benzal
Plasma de conejo
Sensidiscos con novobiocina

Placas con agar sal y manitol
Metodologa
1. Sembrar por estra cruzada una placa de agar sangre y una de agar sal y manitol.
3. Leer morfologa colonial y microscpica.
4. Realizar pruebas de identificacin de especie.
Cuestionario:
1. Cul es la definicin e importancia del gnero Staphylococcus?
2. Qu prueba permite diferenciar entre el gnero Streptococcus y Staphylococcus?
3. Cul es el fundamento de la prueba de coagulasa y cmo se realiza en el laboratorio?
4. Cules son los ingredientes del agar de sal y manitol y por qu es importante utilizarlo
para la identificacin de este gnero y no de otros?
6. Morfologa colonial
7. Tincin de Gram
8. Pruebas de catalasa y oxidasa.
9. Otras pruebas
34
10. Establecer si la cepa en estudio pertenece al gnero de Staphylococcus, de ser positiva la

respuesta, menciona la especie.
35

PRCTICA 12
CARACTERIZACIN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS: Bacillus
Introduccin
Los microorganismos del gnero Bacillus son bacilos Grampositivos, formadores de endosporas,
catalasa positivos, son mviles excepto B. anthracis y -hemolticos excepto B. anthracis. Este
gnero es ubicuo en la naturaleza ya que posee endosporas y stas pueden permanecer en campos
contaminados por periodos de 10 hasta 30 aos. B. anthracis es el agente causal de ntrax en
animales, principalmente vacas y ovejas, as como en el humano (ver tabla 7).
Tabla 7. Caracteres mnimos para diferenciar Bacillus anthracis de Bacillus cereus

Bacillus anthracis
Bacillus cereus
Lecitinasa
Colonias rugosas
Morfologa
Bacilar; extremos
rectangulares
bacilar; extremos
redondeados
Movilidad
Cpsula
Hemlisis
Colonias lisas (capsulacin en agar
bicarbonato de sodio 0.7%)
Sensibilidad a penicilina
+
+
+
+
-
36
Objetivo
Identificar por pruebas de laboratorio al gnero Bacillus.
Material
Placas con agar nutritivo
Equipo para tincin de Shaeffer-Fulton
Cepas de Bacillus sp
Portaobjetos
Algodn
Caldo nutritivo
Benzal
Tubos con gelatina
Metodologa
1. Inocular una placa de agar sangre carnero.
2. Inocular un tubo de caldo nutritivo e incubarlo a 42 C.
3. Inocular un tubo con gelatina e incubarlo a 4 C por 7 das.
4. Leer morfologa colonial, buscar hemlisis, hacer tincin de Gram y Shaeffer-Fulton
Cuestionario
1. Cul es el fundamento de la tincin de Shaeffer-Fulton y cmo se realiza en el
laboratorio?
2. Menciona otras pruebas para diferenciar especies de Bacillus.
3. Menciona medios de cultivo para el aislamiento de Bacillus.
4. Menciona las medidas de seguridad que debe tener el laboratorio para poder trabajar con
Bacillus anthracis.
a) Morfologa colonial.
b) Tincin de Gram.
c) Pruebas de catalasa y oxidasa.
d) Otras pruebas.
37
Bibliografa
1. Bailey and Scott. 2009. Diagnstico Microbiolgico. 12. edicin. Ed Mdica
Panamericana.
2. Bergeys 1994. Manual. Determinative bacteriology. 9a. edicin. Williams & Wilkins.
3. Cowan y Steel.1988. Manual para la identificacin de bacterias de inters mdico. Ed.
Panamericana.
4. HernndezMndez, J.T y cols. 2003. Bacteriologa Mdica Diagnstica. Instituto
Politcnico Nacional. 2. edicin. Ed. Cullar.
5. Jawetz, Melnick y Adelberg. 2001. Microbiologa Mdica. 25. edicin. Ed. Mc Graw Hill
6. Koneman. 2003. Diagnstico Microbiolgico. 5. Edicin. Ed. Mdica Panamericana.
7. Mc Faddin 1998. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Inters
Mdico. Ed. Panamericana.
8. NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
38

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BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

MANUAL DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGA I

Aplicacin de los criterios de Cowan y Steel para

Caracterizacin de bacterias no fermentadoras

Caracterizacin del gnero Pseudomonas

Caracterizacin del gnero Haemophilus

Caracterizacin del gnero Brucella

Caracterizacin de bacterias de los gneros

Caracterizacin de enterobacterias: lactosa

Caracterizacin de enterobacterias: lactosa

Caracterizacin del gnero Vibrio

Caracterizacin de bacterias de los gneros

Caracterizacin de bacterias del gnero

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

1.- Tincin de Gram.

10.- Produccin de cido a partir de glucosa.

Tambin se pueden incluir pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.

Tubos con O/F con glucosa

Placas con agar nutritivo o soya tripticasa

Reactivo para catalasa

Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 seg. Escurrir y lavar.

Dejar secar al aire.

Observar el frote con objetivo de inmersin.

Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada

Figura 1.Esquema y fundamento de tincin de gram

Observar el frote con objetivo de inmersin y dibjala

Figura 2.Esquema y fundamento de tincin de Shaeffer y Fulton

Decolorar con alcohol-cido durante 7 min. Enjuagar con agua el portaobjetos y

Figura 3.Esquema y fundamento de tincin de Gram

Figura 4. Metabolismo bacteriano en medio O/F

Tabla 1. Identificacin de bacterias hetertrofas segn Cowan y Steel

bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco

racimos Racimos cadenas tetradas

4. En qu medios se puede realizar la prueba de movilidad y cmo se interpreta?

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

La importancia de estas bacterias radica fundamentalmente en su capacidad para infectar

Algunos de los indicios tempranos para detectar a un microorganismo no fermentador

1. Falta de evidencias de fermentacin de la glucosa.

En la rutina bacteriolgica es necesario rapidez y bajo costo en la identificacin de este

1. Utilizacin de glucosa (fermentador (F), oxidador (O) o no sacaroltico (NS)).

Tabla 2. Caractersticas de algunos gneros gramnegativos no fermentadores

Tubos con O/F con glucosa

Placas con agar sangre de carnero

Reactivo para catalasa

Placas con agar Mac Conkey

Tubos con Medio MIO

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

Tubos con O/F con glucosa

Placas con agar sangre de carnero

Reactivo para catalasa

Placas con agar Mac Conkey

Tubos con agar MIO

Tubos con agar Sellers

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

Placas de agar chocolate

Placas con agar soya tripticasa

Reactivo para catalasa

Sensidiscos con factores V y X

Cepas de Haemophilus spp

Placas con agar sangre de carnero

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

pocas especies de Brucella, con ligera especificidad del husped: B.