Universidad cristiana

evangélica nuevo
Milenio

Asignatura
Bacteriología

Docente
Dra. Aura Hernández

Estudiantes
Jesus lopez
Nohelia Alberto

Lugar
Tegucigalpa D. C
08/04/2021
 Introducción
Cocos Gram positivos catalasa y coagulasa positiva
A este grupo de bacterias pertenecen a los géneros Staphylococcus y
Micrococcus ubicados tradicionalmente dentro de la familia Micrococcaceae,
junto con Stomatococcus y Planococcus. En La actualidad, por estudios de 16s
rARN esta clasificación ya no se encuentra en vigencia, aunque por razones
prácticas se les sigue estudiando juntos, especialmente los dos primeros
géneros, de los cuales únicamente Staphylococcus és de importancia clínica
primaria Además, recientes cambios en la nomenclatura han dado lugar a
nuevos géneros como Macrococcus, Rothia y Kocuria, entre otros. Las bacterias
descritas en esta práctica son todos cocos Gram positivos, catalasa positiva que
pueden pbservar al microscopio como racimos, cadenas pequeñas, en pares o
tétradas, según el género. Las especies del genero StaphylocoCCUs tienen
coma caracteristicas principales el ser anaerobios facultativos (con
excepciones). fermentadores (no producen gas), no esporulados, no
encapsulados e inmóviles, cuyo hábitat principal es la piel y mucosas de Jos
mamíferos y las aves.

OBJETIVO GENERAL
Conocer las características macroscópicas, microscópicas, fisiopatológicas e
inmunológicas de los diferentes grupos bacterianos frecuentes en nuestro medio,
así como las técnicas y procedimientos para identificarlos y caracterizarlos en el
laboratorio
Objetivos
Aprender a diferenciar entre la familia Micrococcaceae y Streptococcus.
Identificar cuáles de dicha familia son de importancia clínica
Reconocer los diferentes tipos de bacterias, que proporcionan elementos que
facilitan el diagnóstico de la bacteria en una muestra clínica
MATERIAL
1. Cultivos de 24 horas en gelosa simple inclinada de las diferentes especies
de Staphylococcus y Micrococcus disponibles en el cepario departamento
d Microbiologia.
2. 2, Placas de gelosa sangre.
3. 3. Placas de agar Mueller-Hinton.
4. 4. Tubos de caldo simple con
5. 3 mL cada uno.
6. 5. Tubos de caldo glucosa con indicador de rojo de
7. 6. Tubos con caldo manosa, maltosa, manitol, xilosa, sacarosa
8. 7. Tubo con caldo nitrato
9. 9. Tubo con caldo VP Produceion de acetorna.
10. 10. Tubos cor el medio de MiIO,
11. 8. Tubo con urea de Christensen
12. 11. Solución salina estéril: frasco con 50 ml, tubos con 3 ml
13. 12. Discos de bacilracina de 0.04 ug
14. 13. Discos de novobiocina de 5 ug.
15. 14. Peroxido de hidrogeno al 3%.
16. 15. Hisopos estériles. 16 Tubos de ensayo de 13 x 1D0 mm estériles:
17. 17. Portaobjetos de 3 x1 pulgada.
18. 18.Plasma humano fresco, preferiblemente oxaiatado. (19 Escala de
McFarland 0.5

MÉTODO

AISLAMIENTO Y REALIZACIÓN DE PRUEBAS REQUERIDAS PARA

LA IDENTIFICACIÓN
1. Sembrar cada cultivo en una placa de gelosa sangre por la técnica de
Frobisher.
2. Sembrar cada cultivo en:
Caldo simple
• Caldo glucosa
Medio de MIO

Altenativamente también sembrar cada cultivo en los medios de caldo

manosa, maltosa, manitol, xilosa, sacarosa, urea de Christensen y caldo
VP.

3. Preparar una suspensión de cada cultivo en un tubo con solución salina

a una turbidez de 0.5 con el estándar de opacidad de McFarland.
.Con hisopo estéril sembrar por extensión en superficie (3 direcciones)
sobre una placa de Mueller-Hinton.
. Colocar un disco de bacitracina y uno de novobiocina con pinza (estéril).
4. Incubar todas las siembras anteriores a 37 C por 48 horas.

B. LEER E INTERPRETAR LOS RESULTADOS DE LAS PRUEBAS

ANTERIORES
1. Describir morfología colonial de los cultivos en
gelosa sangre.
2. Describir morfología celular, para lo cual hacer uh
frotis de una colonia aislada en gelosa sangre y
colorearlo por Gram.
3. Determinar el tipo de crecimiento en caldo simple.
4. Observar el medio de MIO y determinar:
Movilidad
Decarboxilación de la ornitina
5. Del cultivo en caldo simple separar 1 mL, colocarlo en otro tubo de 13
x 100 mm para la prueba de coagulasa.
6. Hacer la PRUEBA DE CATALASA EN TUBO.
A lo quedó del caldo simple agregar 2 a 5 gotas de peroxido de hidrogeno
al 3% y observar:
La formación de burbujas indica un resultado positivo.
 La no formación de burbujas Indica un resultado negativo.

EN LÁMINA
En un portaobjetos colocar dos gotas de H2O2 al 3% separadamente.
Probar en una de las gotas del H2O2, que el asa no haga burbujas.
Colocar una asada de la colonia en la otra gota con cuidado de no tacar el medio
de cultivo.
PRESENCIA DE BURBUJAS indica un resultado POSITIVO

7. Observar los resultados de la susceptibilidad a:

BACITRACINA:
La presencia de un halo de inhibición de cualquier diármetro alrededor de la
colonia indica susceptibilidad
La ausencia de halo, indica resistencia.
NOVOBIOCINA:
La formación de un halo de inhibición <16 mm de diámetro indica resistencia
La formación de un halo 2 16 mim de diámetro indica susceptibilidad.
8. Realizar la PRUEBA DE COAGULASA
Diluir plasma humano 1: 4 con solución salina.
• Agregar al tubo que contiene 1 ml de cultivo bacteriano de Staphylococcus
(catalasa + y resistente a bacitracina) un volumen igual del plasma diluido.
La presencia de un coagulo de fibrina indica un resultado positivo.
Si el cultivo permanece con turbidez homogénea, indica un resultado negativo,
en este caso, reincubar y'observar hasta las 24 horas.Si el resultado permanece
negativo descartar.
NOTA: una forma práctica de hacer la prueba de coagulasa es la siguiente:
Dividir en forma cualitativa el cultivo de Staphylococcus en calda simple en tres
partes y agregar a este una parte del plasma sin diluir, homogenizar e incubar a
37 ° C y observar en la forma anterior.
9. Realizar la PRUEBA DE AGLUTINACIÓN POR PLASMA EN LÁMINA.
En un portaobjetos colocar una gota de solución salina estéril.
• Con el asa previamente flameada y enfriada colocar unas dos colonias de la
placa de gelosa sangre.
• Mezclar la suspensión (observar si no hay autoaglutinación). Agregar una
asada de plasma sin diluir.
Mezclar la suspensión bacteriana.
La formación de grumos antes de 20 "indica un resultado positivo.
10. Leer el resto de las pruebas bioquímicas
Cocos Gram positivos catalasa negativa( streptococcus)
INTRODUCCION
Los miembros de este grupo tienen en común la reacción negativa a la prueba
de catalasa, lo que la diferencia del genero Staphylococcus. Aunque algunas
cepas de Enterococcus faecalis pueden producir una pseudocatalasa,
especialmente si se cultivan en medios que contienen sangre, por lo cual pueden
dar una reacción de catalasa débil. También otros géneros dan la prueba de
catalasa bajo condiciones especiales (Alloiococcus solo lo hace cuando se
prueba en medios sin sangre completa). Otra característica importante
especialmente para el género Streptococcus, son los patrones de hemolisis
característicos, alfa, beta y gamma. Asimismo, la morfología celular típica varía
entre especies; cocos en cadena principalmente pero también en pares. En
general los géneros de este grupo son anaerobios facultativos, que forman parte
de la flora normal del ser humano y de los animales, especialmente en el tracto
su identificación, respiratorio. Destacan como patógenos para el ser humano,
Streptococcus y en menor medida los Enterococcus, igualmente se puede
mencionar como géneros relacionados; Leuconostoc, Lactococcus
(anteriormente estreptococos grupo N), Aerococcus y Pediococcus, entre otros.
MATERIAL
1. Cultivo de 24 horas, en gelosa sangre inclinada en tubo con tapón de
rosca de las diferentes especies de Streptococcus y Enterococcus
disponibles en el cepario del Departamento de Microbiología.
2. Placas de gelosa sangre con base de Cassman.
3. Placas de gelosa sangre, con base de Cassman y Azida de Sodio al
0.02%.
4. Placas de agar Mueller-Hinton o gelosa soya tripticasa. 5. Tubos de
13x100 mm con los siguientes medios de cultivo:
. Caldo simple 3 ml.
. Caldo cloruro de sodio al 6.5% 3ml.
. Caldo hipurato de sodio al 1% 2m.
. Agar Bilis Esculina inclinada
. Gelosa simple inclinada.
.Desoxicolato de Sodio al 10%
. Solución de rojo de fenol al 1%.
Carbonato de sodio al 1%
. Discos de Bacitracina de 0.04 pg ..
Discos de Optoquina (Clorhidrato de etil hidrocupreina) de 10 ug.
. Discos de Septram (Trimetroprim 1.25 ug. + sulfametroxazole 23.75 ug.)
. Peróxido de hidrógeno al 3% misA 14. Cloruro Férrco ácido (Cloruro
Férrico 1% en Ácido Clorhídrico al 0.25%).
. Recipientes para incubar en atmósfera parcial de CO2 . Candelas
blancas.

METODO

A. AISLAMIENTO Y REALIZACIÓN DE PRUEBAS REQUERIDAS

PARA LA IDENTIFICACIÓN

1. Sembrar cada cultivo por Frobisher en una placa de:

• Gelosa sangre con base de Cassman Gelosa sangre con base de
Cassman + azida de sodio (0.02%)
• Incubar a 37C / CO2 / 24-48 horas

2 Sembrar cada cultivo por extensión superficial en una placa de

Mueller Hinton o gelosa soya tripticasa y colocar un disco de:
Bacitracina
Optoquina
Septran
3. Incubar a 37 °C / 24- 48 horas.
4. Sembrar en forma habitual cada cultivo en los siguientes medios de
Cultivo:
• Caldo simple
Caldo Todd Hewitt
Caldo cloruro de sodio al 6.5%
Caldo hipurato de sodio al 1%
• Billis esculina inclinada
Gelosa simple inclinada

5. Incubar a 37 ° C / 24-48 horas.

B . LEER E INTERPRETAR LOS RESULTADOS DE LAS

PRUEBAS,

1. Describir morfología colonial en los medios de A.1. 2. Describir

tipo de crecimiento en los medios de caldo simple y Todd

2. Describir morfología celular:

Medio sólido: En un portaobjetos hacer un frotis de una colonia
aislada de Gelosa sangre.
Medio líquido: Descartar el sobrenadante del cultivo en Todd
Hewitt a otro tubo (guardar para prueba de catalasa)
Hacer frotis del sedimento.

NOTA: Estos dos frotis se pueden hacer en el mismo porta

objetos.
Colorearlos por Gram
Comparar la agrupación

3. Hacer la PRUEBA DE CATALASA

En tubo:
Al cultivo de Todd Hewitt: agregar 2-5 gotas de peróxido de
hidrógeno al 3%.
La formación de burbujas, indica resultado positivo.
En lámina:
En un portaobjetos, colocar 2 gotas de peróxido de hidrógeno al
3% separadamente.
En una de las gotas probar el asa, no debe formar burbujas.
En la otra gota colocar una colonia aislada de gelosa sangre, con
cuidado de no el medio de cultivo.
La formación de burbujas indica resultado positivo.
4. Observar si hay crecimiento en:
Caldo cloruro de sodio 6.5%
Gelosa simple inclinada

5. Interpretar la prueba de Hidrólisis de la Bilis Esculina:

Color negro en el bisel o en todo el tubo indica resultado positivo.

Ausencia de color negro indica resultados negativos.

6. Interpretar la prueba de Hidrólisis del Hipurato de Sodio.

En un tubo marcado P (problema) colocar 0.8 ml, del medio
bacteriano en caldo Hipurato de Sodio.
En otro tubo marcado C (control) colocar 0.8 ml. del medio de
cultivo de Hipurato de coo olo Oah Sodio sin sembrar.
Agregar a ambos tubos, 0.2 ml. de reactivo de Cloruro Férrico
ácido.
Observar:
- Precipitado blanco que persiste por más de 15 min. indica:
Resultado Positivo.
- Si no se forma precipitado o éste desaparece antes de los 15
au en vi min. Indica: Resultado Negativo.

7. Determinar la respuesta a los siguientes antibióticos:

Bacitracina: Cualquier halo de inhibición indica susceptibilidad.
Septran: Ausencia de halo, indica resistencia.
Optoquina: Halo de inhibición de 2 16 mm indica susceptibilidad.
Halo de inhibición de <16 mm Se recomienda hacer la prueba de
solubilidad en Bilis o Desoxicolato de Sodio al 10%.

8. Para deteminar solubilidad:

En un tubo marcado problema (P) hacer una suspensión de las
colonias de los estreptococos alfa hemolíticos en un medio de
cultivo en caldo a que quede ligeramente turbia.
Transferir la mitad a otro tubo marcado control (C)
Agregar al tubo marcado (P) 2 a 5 gotas de Desoxicolato de Sodio
al 10%. Agregar al tubo marcado (C) 2 a 5 gotas de solución
salina 0.85%.

La ciarificación de la suspensión en el tubo marcado (P) en 5-15

minutos indica resultado positivo.
B. En Bacto Blls de Buey al 10%
A un cultivo de estreptococos alfa hemolíticos en caldo Todd
Hewitt agregar una de rojo de fenol, medir el pH.
Si está ácido neutralizar con carbonato de sodio al 1%. (S.
Agregar 0.5 ml.
Del reactivo de Bacto Bilis de Buey al 10%
• Agitar, incubar a 37 °C y Observar a los 15-30 minutos.
Si el cultivo aparece transparente, la bacteria es soluble:
Resultado Positivo.

NOTA: La solubilidad también se puede hacer agregando

directamente sobre las colonias una gota de reactivo. Si después
de incubación de 15-30 minutos, se disuelve la colonia el resultado
es positivo, si no se disuelve el resultado es negativo. Utilizando
las tablas de diagnóstico, tratar de identificar las cepas en estudio.

Conclusión
En esta práctica se identificaron algunas de las bacterias
pertenecientes a lafamilia Streptococcaceae y Micrococcaceae
como fueron
Staphylococcus aureus

Estableciendo y afirmando sus características microscópicas y

bioquímicas de cada una de ellas, diferenciándolas una de la otra.
Por ello, se realizaron las siguientes pruebas: Tinción Gram,
Prueba de Catalasa, Fermentación de la Glucosa en condiciones
aerobias y anaerobias, Fermentación del Manitol en condiciones
aerobias y anaerobias, y Prueba de Coagulasa (prueba de
mostrativa).
Los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas indican que
corresponde a Staphylococcus aureus, por ser: cocos Gram
positivos (en racimo), catalasa positiva, produce ácido a partir de
glucosa y manitol bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.