En los últimos años el interés en el uso de microorganismos introducidos para el

control biológico de patógenos vegetales presentes en el suelo, ha sido estimulado

por las tendencias en la agricultura hacia una mayor sustentabilidad y la
preocupación pública creciente sobre los riesgos asociados al uso de pesticidas
sintéticos (Fujimoto et al., 1995; Thomashow y Weller, 1996).

Definido de forma clásica, el control biológico es una práctica agrícola en la cual

organismos vivos naturales son empleados para controlar o prevenir el
establecimiento de una enfermedad de los cultivos. Posteriormente la National
Academy of Sciences de los EE.UU. lo definió como "el uso de organismos
naturales o modificados, genes o productos de genes, para reducir los efectos
de organismos indeseables (pestes) y favorecer a organismos deseables como
cultivos vegetales, animales y microorganismos" (National Academy of Sciences,
1987).

La supresión exitosa de las enfermedades por microorganismos aplicados a

semillas es el resultado neto de las interacciones entre el agente de biocontrol y los
miembros de la comunidad presentes en la espermosfera, rizósfera o filosfera,
incluyendo el patógeno blanco y la planta hospedera. Dichas interacciones están
ampliamente influenciadas por el ambiente fisicoquímico en el cual el agente de
biocontrol es introducido. Estos agentes deben establecerse lo suficientemente
rápido y en poblaciones suficientemente grandes y metabólicamente activas como
para lograr una protección. Se han descripto varios mecanismos que explican el
control biológico de patógenos: exclusión de nicho y competencia, antagonismo
directo por antibiosis, parasitismo o predación, o inducción de respuestas de
defensa en la planta hospedera (Thomashow y Weller, 1996).

Las estrategias de investigación que combinan la tecnología molecular con

aproximaciones más tradicionales han aumentado significativamente la comprensión
de los mecanismos involucrados en la supresión de enfermedades por bacterias
beneficiosas, denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)
(Kloepper y Schroth, 1978). Se ha demostrado que algunos metabolitos microbianos,
incluyendo antibióticos, sideróforos y compuestos volátiles, tienen un rol clave en el
control de ciertos patógenos del suelo. Estos compuestos pueden funcionar no
sólo directamente contra los patógenos blanco a través del clásico mecanismo de
antibiosis, sino también aumentando la competitividad de las PGPR inhibiendo a otros
microorganismos no blanco. Por otro lado, se sabe que algunos de estos metabolitos
tienen un amplio espectro de actividad que se extiende incluso a
los tejidos de las plantas hospederas, donde sus efectos pueden ser beneficiosos o
deletéreos para la germinación, el crecimiento, el desarrollo o el rendimiento vegetal
(Fujimoto et al., 1995). Además, avances tecnológicos recientes han permitido evaluar
el comportamiento de los agentes de biocontrol en ambientes naturales. Estos
estudios han revelado dos fuentes fundamentales de inconsistencia en el
comportamiento de los organismos introducidos para el control biológico, que hasta
ahora han demorado su desarrollo comercial y su amplio uso: (a) la colonización
inadecuada del sitio blanco y (b) la variabilidad en la expresión o el nivel de
actividad de los mecanismos responsables de la supresión de patógenos
(Thomashow y Weller, 1996).

Los antibióticos comprenden un grupo químicamente heterogéneo de moléculas

orgánicas pequeñas (generalmente de PM<1000; Ryder y McClure, 1997) de
origen microbiano que, en bajas concentraciones, son deletéreas para el
crecimiento o las actividades metabólicas de otros microorganismos. En los
últimos años, aproximaciones complementarias que incluyen estudios genéticos y
moleculares, acompañadas por ensayos y sistemas de detección sensibles y
específicos, han mostrado de forma inequívoca que la supresión de al menos
algunas enfermedades radiculares está mediada por antibióticos producidos por
PGPR en la rizósfera (Thomashow y Mavrodi, 1997).

Entre los potenciales antagonistas bacterianos asociados con las raíces de las
plantas, las Peudomonas fluorescentes han recibido una atención especial debido
a su abundancia en la rizósfera y a su prolífica producción de metabolitos
secundarios que son tóxicos para bacterias y hongos fitopatógenos (Loper et
al., 1994). Dentro de este grupo de bacterias se encuentran las especies P.
aeruginosa, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fluorescens y P. putida (Palleroni,
1984). En estas bacterias varios mecanismos de biocontrol han sido elucidados,
particularmente la antibiosis. Se determinó que pueden producir uno o más
antibióticos, principalmente derivados de fenacina o floroglucinol, pirrolnitrina y
pioluteorina, entre otros (Thomashow y Weller, 1996; Thomashow y Mavrodi,
1997).
Referencias

Fujimoto, D.K., D.M. Weller y L.S. Thomashow. 1995. Role of secondary metabolites
in root disease suppression. En Allelopathy: Organisms, Processes, and
Applications. Eds. Inderjit, K.M.M. Dakshini and F.A. Einhellig. American Chemical
Society, Washington, D.C. Págs. 330-347.

Kloepper, J.W. y M.N. Schroth. 1978. Plant growth promoting rhizobacteria on

radishes. En Proceedings of the 4th International Conference on Plant Pathogenic
Bacteria. Ed. G. Clarey. Vol. 2. Station de Pathologie. INRA, Angers. Pág. 879.

Loper, J.L., N. Corbell, J. Kraus, B. Nowak-Thompson, M.D. Henkels y S.

Carnegie. 1994. Contributions of molecular biology towards understanding
mechanisms by which rhizosphere pseudomonads effect biological control. En
Improving Plant Productivity with Rhizobacteria. Eds. M.H. Ryder, P.M. Stephens y
G.D. Bowen. CSIRO Division of Soils. Adelaide, Australia. Págs. 89-96.

National Academy of Sciences. 1987. Report of the Research Briefing Panel on

Biological Control in Managed Ecosystems. National Academy Press. Washington,
DC.

Palleroni, N.H. 1984. Pseudomonadaceae. En Bergey's Manual of Systematic

Bacteriology. Vol. 1. Eds. N.R. Krieg y J.G. Holt. Williams and Wilkins. Baltimore.
Pág. 141.

Ryder, M.H. y N.C. McClure. 1997. Antibiosis in relation to other mechanisms in

biocontrol by rhizobacteria. En Plant Growth Promoting Rhizobacteria: Present Status
and Future Prospects. Eds. A. Ogoshi, A. Kobayashi, Y. Homma, F. Kodama, N.
Kondo y S. Akino. Kakanishi Printing. Sapporo, Japón. Págs. 65-72.

Thomashow, L.S. y D.M. Weller. 1996. Current concepts in the use of introduced
bacteria for biological disease control: mechanisms and antifungal metabolites.
En Plant-Microbe Interactions. Vol. 1. Eds. G. Stacey y N. Keen. Chapman & Hall.
New York, USA. Págs. 187- 235.

Thomashow, L.S. y D.V. Mavrodi. 1997. The genetics and regulation of antibiotic
production by PGPR. En Plant Growth Promoting Rhizobacteria: Present Status and
Future Prospects. Eds. A. Ogoshi, A. Kobayashi, Y. Homma, F. Kodama, N.
Kondo y S. Akino. Kakanishi Printing. Sapporo, Japón. Págs. 108-115.
Si las rizobacterias promotoras del crecimiento y sintetizadoras de antibióticos (PGPR)
ejercen un papel como agentes de control biológico de manera individual, entonces la
acción conjunta incrementará su eficiencia, disminuyendo así la severidad de
patógenos que afecten a las plantas.

Pruebas para la selección de la mejor cepa de Pseudomonas fluorecentes

4.1.2.1. Antibiosis in vitro Pseudomonas fluorescentes Vs. Hongos

fitopatógenos

Para conocer la capacidad de antibiosis de las rizobacterias se

seleccionaron para este ensayo patógenos que dañaban las plantas d

tomate, los cuales fueron propagados en placas con medio adecuado,
incubándose tres placas (como repetición) por medio de cultivo durante 2
días a temperatura ambiente y en completa oscuridad, posteriormente se
estriaron las rizobacterias a una distancia de 2 cm de los patógenos,
nuevamente fueron incubadas en oscuridad durante 72 horas, la existencia
de halo de inhibición se cuantificó en milímetros (Axelrood et al., 1996; Sturz
et al., 1998; Cottyn et al., 2001).

4.1.2.2. Identificación de rizobacterias productoras de ácido cianhídrico

(HCN)

Para la realización de esta prueba se siguió la metodología propuesta por

Wei et al., (1991) y Mariano et al., (2000), la cual indica el estriado de la
rizobacteria en placas con medio AST suplementado con 4.4 g/L de glicina,
introduciendo al medio de cultivo tiras de papel filtro impregnadas
previamente con una solución de ácido pícrico (2.5 g/L) y carbonato de
sodio (12.5 g/L), haciendo que la tira se torne de color amarillo, la
producción de HCN esta indicada como; nula si la tira de papel no cambia
de color, moderadamente si se torna café y fuertemente si es roja.

4.1.2.3. Producción e identificación de sideróforos

En este experimento se seleccionó la rizobacteria que mayor halo de

inhibición tuvo en el ensayo de antibiosis, la cual fue sembrada en medio
líquido de Meyer y Abdallah (1978), agitándose a 200 r.p.m. durante 48
horas a una temperatura de 25 ºC, pasado este tiempo se centrífugo el
medio a 11,500 r.p.m. extrayendo el sobrenadante para ser determinado sus
propiedades espectrales mediante el método propuesto por Teintze et al.,
(1981), para la identificación del sideroforo.

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4.1.3. Selección e identificación de la especie de Pseudomonas que logró el
mayor rango de inhibición contra los agentes patógenos

Una vez realizada la prueba de antibiosis se eligió la rizobacteria que mayor halo
de inhibió logró contra los dos patógenos, identificando la especie según Klinge
(1960), Katoh y Itoh (1983), Fulghum (1994) y el manual de Bergey´s (1994), los
cuales toman como base para la identificación de las especies de
Pseudomonas caracteres morfológicos y bioquímicos muy específicos para
cada una de ellas.

4.1.4. Cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC)

Para la cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) se utilizó el

método de dilución para cuenta en placa realizando cinco repeticiones por
cada una de estas (Burr et al., 1978; Suslow y Schroth, 1982; Chiarini et al., 1998),
haciendo dos evaluaciones a las 24 y 48 horas posteriores a su incubación.