MINISTERIO DE SALUD

Normativa 091

Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH

Managua, Julio 2012.

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N WC 39 0330 2011

Nicaragua. Gobierno de Reconciliacin y Unidad Nacional Ministerio de Salud. Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH / Direccin Superior del Ministerio de Salud. Managua: MINSA, Jun. 2011

62 p. (Normativa 091, contiene soporte jurdico; AM-585-18/06/2012. Anexos: Algoritmo de Pruebas Diagnsticas del VIH; Instructivos para el llenado de la Solicitud de la Prueba del VIH)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Virus de la Inmunodeficiencia Humana-diagnstico (descriptor local) Virus de la Inmunodeficiencia Humana-seguimiento (descriptor local) Sndrome de Inmunodeficiencia Humana-diagnstico Sndrome de Inmunodeficiencia Humana- seguimiento (descriptor local) Tcnicas de Laboratorios Clnico- utilizacin Prueba Elisa- utilizacin Vigilancia Epidemiolgica Monitoreo VIH/SIDA (descriptor local) Toma de Muestras por Puncin Venosas (descriptor Local

Ficha Bibliogrfica elaborada por la Biblioteca Nacional de Salud

MINSA- Junio 2011

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CRDITOS Direccin Superior del Ministerio de Salud Dra. Sonia Castro Gonzlez Ministra de Salud Dr. Elas Guevara Viceministro de Salud Dr. Enrique Beteta Secretario General Equipo Tcnico: Dr. Angel Balmaseda Director General Centro Nacional de Diagnstico y Referencia. TM. Justo Reyes Director Microbiologa Centro Nacional de Diagnstico y Referencia. Lic. Cristhiam Cerpas Cruz Centro Nacional de Diagnstico y Referencia Lic. Karla Gonzlez Centro Nacional de Diagnstico y Referencia Lic. Felipe Torres Centro Nacional de Diagnstico y Referencia Comisin Nacional de Normas, Guas Manuales y Protocolos del Sector Salud Lic. Mara del Rosario Sandino Montes Dra. Senobia Sequeira Sevilla Dra. Katya Jaens Ortiz Dra. Matilde Romn Lic. Ana Luisa Alvarado Lic. Luca Murillo Lic. Maritza de Jess Cceres Lic. Ana Moya Baltodano Lic. Mara Elsa Martnez Lic. Carolina Flores Hernndez Directora General de Regulacin Sanitaria. Departamento de Informacin Mdica Departamento de Informacin Mdica, Direccin General Vigilancia para la Salud.
Direccin General Extensin de la Calidad de la Atencin.

Asesora Legal. Direccin General de Planificacin y Desarrollo. Direccin General de Docencia e Investigacin. Componente VIH Divisin Insumos Mdicos

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INDICE Contenido
I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. Presentacin Introduccin Justificacin Soporte Jurdico Glosario Abreviaturas Objetivo General Objetivos Especfico Campo de Aplicacin Poblacin Meta Disposiciones 1. Descripcin del Algoritmo Diagnstico de VIH 2. Toma, Manejo y Envi de Muestras a. Procedimiento de toma de muestra por puncin venosa b. Procedimiento de toma de muestra por puncin capilar c. Procedimiento de toma de muestra con papel filtro para ADN Proviral d. Conservacin de la muestra en papel filtro 3. Obtencin y Preparacin de Muestras a. Obtencin de suero para el diagnstico serolgico de VIH: b. Obtencin de sangre total para el recuento de CD3/CD4/CD8 y ADN Proviral: c. Obtencin de plasma para anlisis de carga viral: 4. Envi y Transporte de Muestras de Sangre Total, Muestra Seca, Suero y Plasma a. Envo de muestras para confirmacin y control de calidad de VIH b. Procedimiento de embalaje de muestras: 5. Procedimientos Analticos a. b. c. d. e. f. XII. XIII. XIV. Prueba Rpida A1 Ensayo para la deteccin de antgenos y/o anticuerpos VIH1/2 Prueba Rpida A2 Ensayo para la deteccin de antgenos y anticuerpos VIH1/2 Ensayo para la deteccin de Ag p24 y Ac anti-VIH1/2 por ELISA 4ta generacin: Ensayo para la deteccin de anticuerpos VIH 1/2 por western Blot Ensayo para la deteccin de carga viral de VIH 1 por el mtodo de PCR en tiempo Real Ensayo para el recuento de linfocitos T CD3/CD4/CD8. Ensayo para la deteccin de ADN pro viral del VIH 1 Anexos Bibliografa

Pgina
08 09 10 11 14 17 19 19 19 19 20 20 21 23 24 24 25 27 27 27 27 28 29 31 32 33 34 36 37 39 41 43 46 65

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I.

PRESENTACIN

El Gobierno de reconciliacin y Unidad Nacional a travs del Ministerio de Salud de Nicaragua, pone a disposicin la Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH a ser utilizado en los distintos niveles de atencin a la poblacin Nicaragense. Este documento ha sido elaborado de manera prctica e incluye los ms recientes cambios tecnolgicos en los diferentes mtodos de laboratorio para el diagnstico y monitoreo de VIH/sida utilizados en Nicaragua, adems, contiene una detallada descripcin del algoritmo para el diagnstico de VIH en Nicaragua y los diferentes formatos establecidos por el Ministerio de Salud de Nicaragua para el diagnstico y monitoreo de VIH/sida. En su elaboracin han participado especialistas en laboratorio en salud coordinados por la direccin general del Centro Nacional de Diagnstico y Referencia. Con esta Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH el Ministerio de Salud contribuye al mejoramiento del servicio de los laboratorios del Pas orientando al personal de salud sobre los pasos que deben seguir para el adecuado diagnstico y seguimiento de VIH/sida y el uso correcto de los materiales para garantizar su seguridad y la de la poblacin en general.

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II.

INTRODUCCION

En Nicaragua el diagnstico de VIH se ha realizado desde los aos 90s, desde esa poca hasta la actual se han utilizado diferentes tcnicas diagnsticas, desde hemoaglutinacin hasta, Western Blot, pruebas de inmunocromatografa, ELISA de 4ta generacin y mtodos moleculares. Actualmente las personas con VIH son monitoreadas por medio de tcnicas de biologa molecular (carga viral) y tcnicas de citometra de flujo (CD3, CD4, CD8). A partir del ao 2007 el Ministerio de Salud conform la red de diagnstico de VIH en todo el pas, con el objetivo de permitir a todas las personas que tomen la decisin de realizarse la prueba de diagnstico de VIH, la tengan disponible de forma eficiente, gratuita y oportuna cerca de sus comunidades, adems, el Ministerio de Salud publica el primer manual de laboratorios para el diagnstico de VIH en Nicaragua como un esfuerzo para estandarizar la metodologa diagnstica de VIH en la red de laboratorios del pas. En el 2011 se elabor un proceso de actualizacin del mismo, plasmando lo ms actualizado dentro del Algoritmo para la realizacin de las pruebas de diagnstico del VIH en Nicaragua. Cabe mencionar que adems en este documento est reflejado todas las tcnicas as como insumos necesarios para un oportuno y rpido mtodo de diagnstico dirigido a toda la poblacin.

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III.

JUSTIFICACION

El principal inters del personal de salud y del especialista en laboratorio en salud es proporcionar a las personas la mejor atencin y el mejor resultado diagnstico posibles, sin embargo, pese a todas las ventajas que ofrecen los reactivos actuales y equipos automatizados, el personal de laboratorio debe ser correctamente instruido sobre el objeto de las pruebas, el aporte que brindan y tambin debe estar consiente y familiarizado con los pasos que debe seguir desde el momento en que se atiende al paciente hasta la entrega del resultado. Lo anterior es posible si utilizamos adecuadamente los recursos, si se realiza correctamente los procedimientos involucrados en el diagnstico y seguimiento de VIH. Esta gua rene todos los parmetros necesarios para el cumplimiento de lo expresado y est dirigida a todo el personal de salud para optimizar los recursos, realizar el correcto diagnstico y seguimiento de VIH y contribuir a la mejora continua de la salud de todos los nicaragenses.

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IV.

SOPORTE JURIDICO

La presente Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH se sustenta dentro del marco jurdico y regulatorio existente para el sector salud principalmente lo dispuesto en: 1. CONSTITUCIN POLTICA DE NICARAGUA Artculo 59.- [Derecho a la salud] Los nicaragenses tienen derecho, por igual, a la salud. El Estado establecer las condiciones bsicas para su promocin, proteccin, recuperacin y rehabilitacin. Corresponde al Estado dirigir y organizar los programas, servicios y acciones de salud y promover la participacin popular en defensa de la misma. Los ciudadanos tienen la obligacin de acatar las medidas sanitarias que se determinen. Artculo 105. [Servicios pblicos] (Prrafos segundo y tercero). Los servicios de educacin, salud y seguridad social, son deberes indeclinables del Estado, que est obligado a prestarlos sin exclusiones, a mejorarlos y ampliarlos. Las instalaciones e infraestructura de dichos servicios propiedad del Estado, no pueden ser enajenadas bajo ninguna modalidad. Se garantiza la gratuidad de la salud para los sectores vulnerables de la poblacin, priorizando el cumplimiento de los programas materno - infantil. Los servicios estatales de salud y educacin debern ser ampliados y fortalecidos. Se garantiza el derecho de establecer servicios privados en las reas de salud y educacin. 2. LEY No. 423, LEY GENERAL DE SALUD, PUBLICADA EN LA GACETA No. 91 DEL 17 DE MAYO DEL 2002. Artculo 1.- Objeto de la Ley: La presente Ley tiene por objeto tutelar el derecho que tiene toda persona de disfrutar, conservar y recuperar su salud, en armona con lo establecido en las disposiciones legales y normas especiales. Artculo 2.- rgano Competente: El Ministerio de Salud es el rgano competente para aplicar, supervisar, controlar y evaluar el cumplimiento de la presente Ley y su Reglamento; as como para elaborar, aprobar, aplicar, supervisar y evaluar normas tcnicas, formular polticas, planes, programas, proyectos, manuales e instructivos que sean necesarios para su aplicacin. Artculo 4.- Rectora: Corresponde al ministerio de Salud como ente rector del Sector, coordinar, organizar, supervisar, inspeccionar, controlar, regular, ordenar y vigilar las acciones en salud, sin perjuicio de las funciones que deba ejercer frente a las instituciones que 11

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conforman el sector salud, en concordancia con lo dispuesto en las disposiciones legales especiales. Artculo 5.- Principios Bsicos: Son principios de esta Ley: 7. Calidad: Se garantiza el mejoramiento continuo de la situacin de salud de la poblacin en sus diferentes fases y niveles de atencin conforme la disponibilidad de recursos y tecnologa existente, para brindar el mximo beneficio y satisfaccin con el menor costo y riesgo posible. 10. Responsabilidad de los Ciudadanos: Todos los habitantes de la Repblica estn obligado a velar, mejorar y conservar su salud personal, familiar y comunitaria, as como las condiciones de salubridad del medio ambiente en que viven y desarrollan sus actividades. Artculo 7.- Son Competencias y Atribuciones del Ministerio de Salud: 1.- Regular, Supervisar, e intervenir en el sector de Sector de Salud, y en particular ser la autoridad competente para la aplicacin y el control del cumplimiento de las disposiciones de la presente Ley, su reglamento o normas que de ella emanen, sin perjuicio de las facultades y obligaciones que leyes especiales otorguen a otros organismos pblicos dentro de sus respectivas competencias. Para estos efectos, se entiende como autoridades en salud, las personas o instituciones con funciones, facultades o competencias expresadas de expedir o aplicar la regulacin en materia de polticas en salud. 6.- Expedir las normas de organizacin y funcionamiento tcnico administrativo, operativo y cientfico de las Instituciones Proveedoras de Servicios de Salud de naturaleza pblica. 12.- Regular, cuando resulte necesario para los principios de esta Ley, las actividades con incidencia directa o indirecta sobre la salud de la poblacin, que realice o ejecute toda persona natural o jurdica, pblica o privada.

3. DECRETO No. 001-2003, REGLAMENTO DE LA LEY GENERAL DE SALUD, PUBLICADO EN LA GACETA No. 7 y No. 8 DEL 10 y 13 DE ENERO DEL 2003. Artculo 19.- Para ejercer sus funciones, el MINSA desarrollar las siguientes actividades: 1. Regular la provisin de los servicios de salud. 4. Orientar, regular y coordinar los integrantes del sector salud en la realizacin de acciones dirigidas a: 4.1- Promocin, prevencin, tratamiento y rehabilitacin.

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6. Liderar y desarrollar procesos de seguimiento, vigilancia, control y evaluacin sobre la aplicacin de polticas de salud, incluyendo acciones de vigilancia de la salud y metas de cobertura. 7. Promover la participacin de la comunidad del sector salud en el diseo de las polticas, planes y programas de salud necesarios para su implementacin. Artculo 73.- Son proveedores de servicios de salud, las personas naturales o jurdicas, pblicas, privadas o mixtas, que estando habilitados por el MINSA, tienen por objeto la provisin de servicios en sus fases de promocin, proteccin, recuperacin y rehabilitacin de la salud que requiera la poblacin. Se incluye cualquier otro establecimiento cuya actividad sea brindar servicios que incidan de manera directa o indirecta en la salud del usuario.

4. LEY NO. 238, LEY DE PROMOCION, PROTECCION Y DEFENSA DE LOS DERECHOS HUMANOS ANTE EL SIDA, PUBLICADA EN LA GACETA No. 232 DEL 06 DE DICIEMBRE DEL 1996. Articulo 1.- Garantizar el respeto, promocin, proteccin y defensa de los derechos humanos, en la prevencin de la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y en el tratamiento del sndrome de la inmunodeficiencia adquirida (sida). Artculo 3.- En la prevencin y control de VIH/sida se deben garantizar los derechos humanos, la no discriminacin, la confidencialidad y la autonoma personal. Artculo 5.- Nadie podr ser sometido a pruebas para detectar la presencia de anticuerpos al VIH sin su consentimiento. Las personas que soliciten dicha prueba darn su autorizacin por escrito. Artculo 7.- Los resultados de la prueba de anticuerpos al VIH deben comunicarse de manera confidencial, personal o mediante consejera de conformidad con las disposiciones dictada para tal efecto. Artculo 10.- Las entidades pblicas y privadas que por su naturaleza cumplan funciones de informacin, comunicacin o educacin formal, incorporaran en sus planes la prevencin del VIH/sida para toda la poblacin.

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V.

GLOSARIO
Acido nucleicos que forma parte de todas las clulas. Compuesto qumico del etanol. Puede mezclarse con agua. Conjunto pre escrito de instrucciones bien definidas, ordenadas y finitas que permite realizar una actividad mediante pasos sucesivos que no generen dudas a quien deba realizar dicha actividad. Parte que se toma de un volumen inicial para ser usada en una prueba del laboratorio cuyas propiedades fsicas y qumicas representa las de la sustancia original. Componente de inters analtico de una muestra. Sustancia endgena o exgena que interfiere o inhibe la coagulacin de la sangre. Glicoprotenas del tipo gamma globulina empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraos tales como virus o parsitos. Sustancia que desencadena la formacin de anticuerpos y puede

ADN Proviral: Alcohol etlico: Algoritmo:

Alcuotas:

Analito: Anticoagulante:

Anticuerpo:

Antgeno:

causar una respuesta inmunitaria.

Buffer: Tampn qumico que puede oponerse a grandes cambios de ph en una disolucin acuosa. Cuantificacin de la infeccin por virus que se calcula por estimacin de la cantidad de partculas virales en los fluidos corporales como por ejemplo ARN viral por milmetros de sangre. Mquina que pone en rotacin una muestra para acelerar por fuerza centrfuga la decantacin o sedimentacin de sus componentes o fases en funcin de su densidad.

Carga viral:

Centrifuga:

Citometra de flujo: Cut off: Valor de corte de la prueba, indica el valor en densidad ptica necesario para considerar una prueba como positiva o negativa. Diferencia, especialmente la existencia entre distintos datos, informaciones u opiniones.

Discrepancia:

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Embalaje:

Recipiente o envoltura que contiene productos de manera temporal principalmente para agrupar unidades de un producto pensando en su manipulacin, transporte y almacenaje. Molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas, siempre se sean termodinmicamente posibles. Nombre de equipo para realizar citometra de flujo. Nombre de reactivo utilizado en equipo de citometra de flujo. Aglutinacin de hemates o glbulos rojos. La hemlisis (eritrocateresis) es el fenmeno de la desintegracin de los eritrocitos(glbulos rojos o hemates). Compuesto qumico, fuertemente oxidante, cuya disolucin en agua es conocida popularmente como agua lavandina, cloro, leja, agua de Javel, agua Jane o blanqueador. Proceso por el que se hace que una mezcla presente las mismas propiedades en toda la sustancia. Resultado no concluyente por Western Blot que requiere de una nueva muestra en los 3 meses posteriores a la emisin del resultado de VIH. Conjunto de tcnicas inmunoqumicas analticas de laboratorio que tienen en comn el usar complejos inmunes como referencias de cuantificacin de un analito determinado. Tipo de leucocito (glbulo blanco) comprendidos dentro de los agranulocitos. Definicin dada a una muestra a la que no se ha detectado antgeno p 24 y anticuerpos anti-VIH mediante la prueba de ELISA o anticuerpos antiVIH mediante la prueba de western Blot. Slido parecido al algodn, o un lquido gelatinoso ligeramente amarillo. Definicin dada a una muestra p r e s u n t a m e n t e negativa. No se han detectado anticuerpos anti- VIH mediante el uso de las pruebas rpidas A1 y A2 no confirmatorias. Componente lquido de la sangre. Enzima capaz de transcribir o replicar cidos nucleicos.

Enzimas:

Facs Count: Facs flow: Hemaglutinacin: Hemolisis:

Hipoclorito de sodio:

Homogenizar:

Indeterminado:

Inmunoensayo:

Linfocitos:

Negativo:

Nitrocelulosa: No Reactor:

Plasma: Polimerasa:

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Positivo:

Definicin dada a una muestra con evidente presencia de anticuerpos anti-VIH y antgeno p24 por la tcnica de ELSIA y/o presencia de anticuerpos anti-VIH por la tcnica de Western Blot. Es el acto de pinchar la punta de un dedo para obtener una muestra de sangre capilar. Es el acto de puncionar una vena para obtener una muestra de sangre venosa. Definicin dada a una muestra p r e s u n t a m e n t e Positiva. Se han detectado anticuerpos anti- VIH mediante el uso de las pruebas rpidas A1 y A2 no confirmatorias. Material o resto biolgico que se encuentra derivado de la accin de centrifugar una muestra. Sndrome de inmunodeficiencia adquirida. Enzima (nucleasa) que cataliza la hidrlisis de ARN en componentes ms pequeos. Componente de la sangre resultante tras permitir la coagulacin de sta y eliminar el coagulo resultante. Extraccin de sangre de una vena, generalmente tomada por un bioanalista, un laboratorista, un personal de enfermera, un paramdico o un estudiante de estas profesiones. Frasco pequeo para contener medicamentos inyectables. Equipo de laboratorio utilizado para la mezcla de sustancias liquidas. Tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada.

Puncin capilar:

Puncin venosa:

Reactor:

Sedimento:

sida: Solucin RNasa:

Suero:

Venopuncin:

Vial: Vortex: Western Blot:

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VI.
C: A1: A2:

ABREVIATURAS
Grado centgrado. Primer prueba rpida Segunda prueba rpida. Anticuerpo dirigido contra el virus de inmunodeficiencia humana. Anticuerpo. Acido desoxirribonucleico: Antgeno Linfocito tipo T con presencia de cluster de diferenciacin 3. Linfocito tipo T con presencia de cluster de diferenciacin 4. Linfocito tipo T con presencia de cluster de diferenciacin 8. Centmetro. Centro Nacional de Diagnstico y Referencia. Anticuagulante cido etilendiaminotetracetico Ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima. Protena de la envoltura del virus de inmunodeficiencia humana. Conjunto de las piezas de un objeto o reactivo que se venden con un folleto de instrucciones para montar con facilidad. Ministerio de Salud. Mililitro. Milmetro. Nanmetro. Protena del ncleo del virus de inmunodeficiencia humana. Protena de la capside del virus de inmunodeficiencia humana. Reaccin en cadena de la polimerasa. Medida de acidez o alcalinidad de una disolucin. Revoluciones por minuto.

Ac Anti-VIH: Ac: ADN: Ag: CD3: CD4: CD8: cm: CNDR: EDTA K2/K3: ELISA: gp 41: Kit:

MINSA: ml: mm: nm: p24: p31: PCR: ph: rpm:

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Sida: SILAIS: ul: VIH: VIH :

Sndrome de inmunodeficiencia adquirida. Sistema Local de Atencin en Salud. Microlitros. Virus de inmuno deficiencia humana. Virus de inmuno deficiencia humana tipo 1 y 2.

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VII.

OBJETIVO GENERAL:

Establecer los criterios para el diagnstico y seguimiento de VIH/sida en los laboratorios de los establecimientos proveedores de servicios de salud pblicos y privados. as como el uso correcto de los materiales e insumos que garanticen la seguridad del personal de salud y de la poblacin en general a travs de la aplicacin de lineamientos estandarizados.

VIII.

OBJETIVO ESPECFICO:

Asegurar el uso correcto de los materiales e insumos que garantizan la seguridad del personal de salud y poblacin en general.

Describir el flujo del algoritmo diagnstico de VIH utilizado a nivel nacional. Orientar en los procedimientos y metodologas que permitan la capacitacin e informacin del profesional de salud, que realiza anlisis de diagnstico y seguimiento de VIH/sida. Mejorar la eficacia en los laboratorios de la red nacional que realizan las pruebas de diagnstico y seguimiento de VIH/sida.

IX.

CAMPO DE APLICACIN:

El cumplimiento de esta gua es de carcter obligatorio y debe ser aplicada en todos los establecimientos proveedores de servicios de salud pblicos.

X.

POBLACIN META:

Todos los especialistas de laboratorio en salud de los establecimientos prestadores de servicios del Ministerio de Salud, profesionales y tcnicos que proveen atencin en salud y los funcionarios encargados del sistema de vigilancia epidemiolgica del VIH/sida.

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XI.
1.

DISPOSICIONES:
Descripcin del Algoritmo Diagnstico de VIH

El Personal que realiza la prueba de VIH en los diferentes establecimientos de salud, laboratorios de la red diagnstica de VIH e instituciones pblicas, privadas y ONGs que realizan el diagnstico del VIH/sida, deben conocer las pautas y orden de los pasos a seguir para realizar el correcto diagnstico de VIH. Responsable: Personal del Centro de Diagnstico y Referencia del Ministerio de Salud. Profesionales y tcnicos que trabajan en los establecimientos del Ministerio de Salud, e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida. Materiales: Gua de procedimientos de VIH. Flujo grama Algoritmo de Pruebas Diagnsticas de VIH. Explicacin del flujo: El diagnstico para VIH se realiza utilizando una combinacin de pruebas rpidas y pruebas confirmatorias de ELISA, segn se describe a continuacin (Anexo 1): Si la prueba rpida (A1) realizada en el tamizaje inicial tiene un resultado No Reactor, se entregar el resultado al mdico tratante. Si el resultado de la prueba rpida inicial fuera Reactor, se realiza inmediatamente una segunda prueba rpida (A2) de diferente marca o principio metodolgico. Si el resultado es No Reactor se notifica al mdico tratante la discrepancia de resultados y se remite la muestra al laboratorio de referencia del SILAIS correspondiente. Si el resultado es Reactor se notifica al mdico tratante el resultado preliminar y se remite la muestra al laboratorio de referencia del SILAIS que corresponde.

En el laboratorio de referencia del SILAIS (acreditado por el CNDR- MINSA) se utiliza la prueba de ELISA 4ta Generacin y se sigue el siguiente esquema: Si ambas pruebas rpidas son reportadas Reactor y el resultado de ELISA se reporta como: 20

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Positivo: se entrega el informe como positivo a vigilancia epidemiolgica del SILAIS y/o la unidad de salud que lo refiere y se enva la muestra junto con el historial de anlisis al CNDR para realizar el control de la red de laboratorios. Negativo: se solicita nueva muestra en un tiempo no mayor al de 3 semanas.

Si la muestra reportada por el nivel local presenta discrepancia en el resultado de ambas pruebas rpidas (A1 Reactor, A2 No Reactor) y el resultado de ELISA es: Positivo: s e entrega el informe como positivo a vigilancia epidemiolgica del SILAIS y/o la unidad de salud que lo refiere y se enva la muestra junto con el historial de anlisis al CNDR para realizar el control de la red de laboratorios. Negativo: se reporta resultado Negativo al SILAIS y/o la unidad de salud que lo refiere.

En el CNDR se realizar control de calidad externo a todas las muestras referidas por la red de laboratorios para el diagnstico del VIH, empresas mdicas previsionales, ONGs y laboratorios privados utilizando una combinacin de pruebas serolgicas, ELISA 4ta Generacin y Western Blot. Nota: Los centros que realizan la prueba de ELISA debern ser autorizados por el CNDR-MINSA para cumplir la funcin de laboratorio de referencia departamental para el diagnstico de VIH.

2.

Toma Manejo y Envi de Muestras

Es necesario realizar la toma de muestra venosa o capilar cumpliendo con las buenas prcticas de laboratorio para garantizar la correcta atencin y diagnstico de las personas que soliciten el servicio. El flebotomista debe informar al paciente acerca del procedimiento a realizar y solicitar su consentimiento verbal, adems, debe solicitar el consentimiento por escrito para su confirmacin visual. Todo el personal de laboratorios o de cualquier establecimiento de salud debe de cumplir con las normas bsicas de Bioseguridad. Alcance: 21

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Este procedimiento debe ser ejecutado por personal de toma de muestra de los diferentes establecimientos de salud, laboratorios de la red diagnstica de VIH e instituciones pblicas y privadas que trabajan en el diagnstico del VIH/sida. Responsable: Profesionales y tcnicos que trabajan en los establecimientos del Ministerio de Salud, e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida. Muestra: Sangre total. Suero. Plasma. Materiales: Jabn o gel anti bacterial. Toallas descartables. Guantes descartables. Gabachas. Bolgrafos. Marcadores permanentes. Torniquete. Algodn en motas. Recipiente con tapa (para motas de algodn). Camisas para agujas de extraccin de sangre. Agujas para extraccin de sangre de 21G x 1 (80x38 mm). Lancetas. Tubo de ensayo al vaco 16 x 100 mm sin anticoagulante. Tubos de ensayo al vacio con anticoagulante EDTA K2/K3 12 x 75 mm. Gradillas para tubos 16 mm. Tarjetas de Papel filtro. Gasa estril. Recipiente para descarte de agujas o material corto punzante. Curas. Soporte para secado de tarjetas de papel filtro. Formatos de registros. 22

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Reactivos: Alcohol etlico o isoproplico al 70%. Hipoclorito de sodio al 0.5%. Para garantizar un volumen adecuado de muestra para el envo al laboratorio de referencia correspondiente leer Anexo 2. Se recomienda de ser posible realizar siempre la toma por el mtodo de venopuncin. Si en la unidad de salud se realiza la toma de muestra capilar, debe considerar lo siguiente: Si al realizar la prueba se obtiene un resultado reactor, proceder a tomar la muestra por puncin venosa para asegurar el volumen adecuado y completar el proceso diagnstico. Por cada 10 tomas por el mtodo capilar se debe tomar una muestra por el mtodo de venopuncin para ser enviada como control de calidad al laboratorio de referencia correspondiente.

a. Procedimiento de toma de muestra por puncin venosa (Anexo 3): Verifique que cuenta con todos los materiales y reactivos necesarios para realizar la toma de muestra. Lvese las manos y squese con toallas descartables. Pngase guantes descartables ajustados al tamao de la mano. Verifique la identificacin del usuario, respetando la privacidad del paciente. Rotule los tubos y asegrese que correspondan con los datos de la orden mdica del usuario(a) antes de la toma de muestra. Revise que el rea de puncin no muestre lesiones ni signos de infeccin. Localice la vena que va a puncionar (preferiblemente que sea visible y fcilmente palpable). Si la vena no es muy visible ni palpable, realice un suave masaje en el antebrazo, con movimientos desde la mueca hacia el codo. Limpie un rea de 4 cm utilizando un algodn impregnado con alcohol etlico o isoproplico al 70 %. con movimientos circulares concntricos desde el centro a la periferia. Coloque la aguja en la camisa para agujas de toma de muestra. Coloque el torniquete con suficiente tensin a una distancia de 10 a 15 cm por encima del pliegue del codo, evitar que est muy apretado ya que puede producir hemlisis, colapso venoso, dolor, etc. Coloque la aguja sobre la vena, con el bisel hacia arriba formando un ngulo de 30C con la piel, e introduzca la aguja en la vena. Inserte el tubo en la parte posterior de la aguja, una vez lleno, retrelo e introduzca un nuevo tubo segn los anlisis a realizar (anexo 2). 23

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Retire el torniquete de 10 a 15 segundos despus de la puncin. Si el tubo contiene anticoagulante, homogenizar suavemente por inversin para evitar que la muestra se coagule, en caso contrario cuando el tubo no contiene anticoagulante inmediatamente colocarlo en reposo en posicin vertical para permitir la coagulacin. Retire la aguja y ponga una mota de algodn seco en el lugar de la puncin, Indique al paciente que debe permanecer sentado y ejercer presin en el lugar de la puncin al menos 5 minutos. Retire la mota de algodn y depostela en un recipiente para desechos de material biolgico. Coloque una cura sobre el sitio de la puncin. Si la persona pierde el conocimiento durante el procedimiento, retire inmediatamente la aguja del lugar de la puncin. Evite que la persona caiga y se golpee, solicite ayuda, coloque un apsito, algodn o gasa sobre la herida de la puncin y ejerza presin, para evitar que fluya la sangre. Acueste a la persona en el suelo o en una camilla con piernas levantadas. Coloque un algodn impregnado con alcohol frente a la nariz de la persona. Una vez recuperado, proporcinele un vaso con agua.

b. Procedimiento de toma de muestra por puncin capilar: Coloque el material a utilizar sobre una superficie limpia y plana. Escoja el rea donde se va realizar la puncin, se recomienda el dedo ndice o medio de la mano izquierda, en nios muy pequeos el dedo gordo del pie o el taln. Si se opta por el dedo ndice, la puncin se har en el costado del dedo en vez de la yema. Realice una limpieza del rea con algodn humedecido en alcohol. Dejar secar el rea e Introducir la lanceta hasta realizar una perforacin en la piel. Deseche la lanceta en un contenedor adecuado para objetos corto punzantes. Elimine la primera gota de sangre con un algodn seco estril. Mantenga el dedo por debajo de la altura del codo o el taln hacia abajo, presione suavemente varias veces en intervalos cortos. Toque con la punta del tubo capilar con anticoagulante la gota de sangre. Llene 1 tubo capilar hasta que el nivel de sangre se site entre las 2 lneas marcadas del capilar. (evite la formacin de burbujas de aire) Seque el rea de la puncin con algodn seco. Una vez que deje de sangrar retire el algodn y coloque una curita.

c. Procedimiento de toma de muestra con papel filtro para ADN Proviral (Anexo 4): 24

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Coloque el material utilizado para toma de muestra capilar y una tarjeta de papel filtro sobre una superficie limpia, plana y seca. Antes de tomar la muestra escriba claramente en la tarjeta el cdigo del paciente, edad, sexo, procedencia (SILAIS) y fecha de recoleccin. Siga el procedimiento de toma de muestra capilar descrito anteriormente para obtener la muestra. Una vez realizada la puncin, presione suavemente varias veces hasta que se acumule una gota grande de sangre (aproximadamente 50ul). Sin tocarlo con el dedo coloque la gota sobre el primer crculo del papel filtro, dejar absorber la gota de sangre hasta quedar impregnada totalmente en el interior del circulo. Mantener el dedo/pie presionado a intervalos hasta completar los 5 crculos de la tarjeta (en casos difciles llenar al menos 3 crculos). La muestra debe cubrir completamente el rea delimitada del papel filtro (aproximadamente 6mm de dimetro) Limpie el rea de puncin con un algodn seco o gasa estril Coloque la tarjeta de papel filtro en posicin horizontal en el soporte de secado sin tocar el rea donde est la muestra.

d. Conservacin de la muestra en papel filtro (Anexo 5): Deje secar las tarjetas de papel filtro en el soporte por 24 horas a temperatura ambiente y en un rea seca, limpia, libre de polvo u otros contaminantes, sin exponerlas al sol. No coloque una muestra encima de otra. No deje que la muestra se ponga en contacto con ningn objeto mientras se est secando. Almacenar las tarjetas despus de haber sido debidamente secadas en bolsas con desecantes y con la solicitud de la prueba correspondiente.

3. Obtencin y Preparacin de Muestras Una vez realizada la toma de muestra es indispensable garantizar las condiciones y volmenes adecuados para su anlisis. Para ello el personal a cargo debe conocer los requerimientos de muestra segn el tipo de anlisis (Anexo 2). Alcance: Este procedimiento debe ser ejecutado por personal capacitado de los diferentes 25

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establecimientos de salud, laboratorios de la red diagnstica de VIH e instituciones pblicas y privadas que trabajan en el diagnstico del VIH/sida. Responsable: Profesionales y tcnicos que trabajan en los establecimientos del Ministerio de Salud, e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida. Muestra: Sangre total. Suero. Plasma. Formularios y Registros: Libro de registro. Solicitud de prueba de ADN Proviral, Carga viral, CD3, CD4, CD8 (Formularios 4,5 en Anexos). Solicitud de prueba de VIH (Formulario 6 en Anexos). Equipos: Centrifuga de tubos de ensayo 16x100 y 12x75 mm. Pipetas automticas 200-1000 l. Materiales: Puntas para pipetas automticas 200-1000 l. Viales 1.5 2 ml. Gradillas para tubos 16 mm. Bolgrafos. Marcadores permanentes. Guantes descartables. Reactivos: Alcohol etlico o isoproplico al 70%. Hipoclorito de sodio al 0.5%.

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Formularios y Registros: Libro de registro. Solicitud de prueba de ADN Proviral, Carga viral, CD3, CD4, CD8 (Formularios 4,5 Anexos). Solicitud de prueba de VIH (Formulario 6 en Anexos). a. Obtencin de suero para el diagnstico serolgico de VIH: Rotule el tubo con el cdigo del paciente que aparece en la solicitud de la prueba. Realice el procedimiento de toma de muestra siguiendo los pasos indicados en el captulo II de esta gua, segn el mtodo de toma de muestra utilizado para la extraccin de sangre garantice el correcto llenado de los tubos de ensayo al vaco (plstico o de vidrio) de 16 x 100 mm sin anticoagulante o tubos capilares, para obtener el volumen de sangre deseado leer Anexo 3. Si la tcnica de extraccin de sangre utilizada es venosa, mantenga el tubo a temperatura ambiente y en posicin vertical hasta que se retraiga el coagulo (aproximadamente 30 minutos). Centrifugue a 3000 rpm durante 5 minutos. Distribuya el volumen de suero obtenidos tras la centrifugacin, en tubos o viales limpios, siguiendo las indicaciones de distribucin de volumen segn anexo 2. Asegrese de tapar y rotular adecuadamente los tubos o viales con el cdigo del paciente. en

Nota: En la toma de sangre por puncin venosa se debe tomar aproximadamente 5 a 6 ml de muestra para garantizar el volumen de suero indicado en el anexo 3. b. Obtencin de sangre total para el recuento de CD3/CD4/CD8 y ADN Proviral: Rotule el(los) tubo(s) con el cdigo del paciente que aparece en la solicitud de la prueba correspondiente. Realice el procedimiento de toma de muestra por venopuncin utilizando tubos de ensayo al vaco con anticoagulante EDTA K2/K3 de 12 x 75 mm, segn se indica en el captulo II de esta gua. El volumen de sangre requerido es indicado en el anexo 2. Mezcle los tubos por inversin para evitar formacin de cogulo.

c. Obtencin de plasma para anlisis de carga viral: Rotule el(los) tubo(s) con el cdigo del paciente que aparece en la solicitud de la 27

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prueba correspondiente. Realice el procedimiento de toma de muestra por venopuncin utilizando tubos de ensayo al vaco con anticoagulante EDTA K2/K3 de 12 x 75 mm, segn se indica en el captulo II de esta gua. El volumen de sangre requerido es indicado en el anexo 2. Mezcle los tubos por inversin para evitar formacin de coagulo. Centrifugue a 2500 rpm durante 20 minutos. Utilice puntas nuevas estriles para pasar el plasma a 2 viales estriles debidamente rotulados con el cdigo de la muestra. Cada vial debe contener al menos 1.5 ml de plasma.

4.

Envi y Transporte de Muestras de Sangre Total, Muestra Seca, Suero y Plasma.

La calidad de los resultados de los anlisis del laboratorio est ntimamente relacionada con la calidad de la toma, manejo y envi de la muestra hasta llegar a las instalaciones del laboratorio donde sern analizadas. El envi de muestras debe realizarse tomando en cuenta todas las indicaciones de seguridad biolgica, manejo y envi de muestras lo que garantiza el correcto anlisis de las mismas. Alcance: Este procedimiento debe ser ejecutado por personal capacitado de los diferentes establecimientos de salud, laboratorios de la red diagnstica de VIH e instituciones pblicas y privadas que trabajan en el diagnstico del VIH/sida. Responsable: Profesionales, tcnicos, personal del componente de VIH y/o vigilancia epidemiolgica de los diferentes establecimientos del Ministerio de Salud, e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida. Muestra: Sangre total. Suero. Plasma. Formularios y Registros:

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Libro de registro. Formulario de Solicitud de pruebas. Solicitud de prueba de VIH (Anexos). Formato de envo de muestras para control de calidad y confirma del diagnstico Serolgico de VIH (Formato 7 en Anexos.

Equipos: Frezeer -20C. Refrigeradora 2-8C. Materiales: Guantes descartables. Bolgrafos. Marcadores permanentes. Recipientes de envos de muestras, primarios y secundarios. Papel absorbente. Termo. Refrigerante. Termmetro de 1 a 25 C. Bolsas con cierre hermtico impermeables. Sobres de papel cera. Tarjetas indicadoras de humedad. Paquetes de slica gel. Sobres tamao carta. Bolsas plsticas. Engrapadora.

a. Envo de muestras para confirmacin y control de calidad de VIH Muestras reactivas por pruebas rpidas (confirmacin en SILAIS): Anexo 6
:

Siga los pasos indicados para la toma de muestra de sangre en el captulo 2 de la presente gua de procedimientos. Si tiene centrifuga de laboratorio, centrifugue a 3000 rpm durante 5 minutos, si no la tiene deje en reposo al menos por 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la separacin del cogulo. Separe 3 alcuotas (viales) de las muestras de suero o plasma que resulten 29

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reactivas. Distribuya de la siguiente manera; 2 alcuotas con 0,5 ml de suero o plasma cada una y una con 1 ml de suero o plasma con las siglas CNDR en la tapa del vial. Escriba el cdigo del usuario(a) en el costado a los tres tubos o viales. Enviar dos alcuotas, la primera de 0.5 ml de suero o plasma y la segunda de 1 ml de suero o plasma, con el cdigo del usuario al laboratorio del SILAIS para realizar las pruebas de confirmacin. La alcuota de 1 ml debe almacenarse en el SILAIS y de ser necesario se enviar al CNDR para su respectiva confirmacin. Guarde el tercer tubo o vial d e 0 . 5 ml en su laboratorio a -20C al menos durante 2 meses, (o hasta obtener el resultado del laboratorio de referencia correspondiente) si no cuenta con freezer, almacene la muestra a 4C al menos 1 semana.

Muestras no reactivas por pruebas rpidas (control de calidad en el SILAIS): Anexo 7 Enve mensualmente al laboratorio de referencia del SILAIS, el 10 % de las muestras no reactivas para su control de calidad, es decir: por cada 10 muestras no reactivas por prueba rpida A1 seleccione una al azar, separe la m u es t r a e n 3 alcuotas. Enve 1 alcuota con 0.5 ml de suero o plasma y otra con 1ml de suero o plasma con las siglas CNDR al laboratorio de referencia del SILAIS para realizar el control de calidad. Guarde la tercer alcuota con 0.5 ml de suero o plasma en su laboratorio a 4C. Si el resultado del control de calidad es NEGATIVO descarte la muestra del tubo nmero 3.

Muestras positivas por ELISA o discrepantes en alguna de las pruebas (Confirmacin en CNDR): Anexo 8 Enve todas las muestras Positivas por ELISA o aquellas que tengan alguna discrepancia diagnstica entre las pruebas rpidas y la prueba ELISA VIH en un trmino no mayor a de tres das hbiles. Separe 2 alcuotas en viales o tubos, de las muestras que resulten positivas a ELISA VIH. Almacene una alcuota con 0,5 ml de suero y plasma en su laboratorio, enve la segunda alcuota con 1 ml de suero o plasma al CNDR para realizar confirmacin de resultado Guarde la alcuota de 0.5 ml en su laboratorio a -20C al menos durante 2 meses, si no cuenta con freezer almacene la muestra a 4C por al menos 1 semana.

Muestras negativas por ELISA (Control de calidad en CNDR): Anexo 9 30

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Seleccione 1 de cada 10 muestras negativas y realice 2 alcuotas por muestra, enve una al CNDR de 1 ml de suero o plasma y guarde la otra con 0.5 ml de suero o plasma como respaldo, en caso de proceder de los Centro de Salud enve la muestra marcada como CNDR. Descarte las muestras cuando obtenga los resultados.

Envo de muestra para la cuantificacin de linfocitos T CD3, CD4, CD8: Para la toma de muestra proceda acorde a los pasos indicados en el captulo II de la presente gua de procedimiento. En el tubo escriba el cdigo tal como aparece en la solicitud de prueba con marcador 3 permanente y con letra legible. Tome la muestra en un tubo que contenga EDTA K2/K3. Obtenga el volumen de muestra tal y como lo indica en el anexo 2. Mezcle inmediatamente la muestra para evitar la formacin de fibrina o cogulo invirtiendo de 8 a 10 veces el tubo. Realice embalaje de la muestra en un recipiente primario y despus en uno secundario como se describi anteriormente. Coloque las muestras en un termo que c o nt e ng a r ef r i g er a n t e q u e alcance temperaturas entre 15-20C. Enve la muestra con su respectiva ficha al CNDR - MINSA por la maana en un lapso no mayor de 6 horas despus de la extraccin de la muestra. Transporte las muestras protegidas del sol. Coloque el material contaminado en hipoclorito de sodio al 0.5%. No congelar las muestras, ni someterlas a altas temperaturas.

Envo de muestra para la cuantificacin de carga viral: Para la toma de muestra proceda acorde a los pasos indicados en el captulo II de la presente gua de procedimiento. Codifique el tubo y la orden mdica con cdigo de barra o marcador indeleble. Obtenga el volumen de muestra tal y como lo indica en el anexo 2. Mezcle inmediatamente la muestra para evitar la formacin de fibrina y/o coagulo, invirtiendo el tubo 8 a 10 veces. Centrifugue la muestra a 2500 rpm durante 20 minutos. Transfiera el plasma obtenido a 2 viales de 1.5 ml cada uno. Realice embalaje de dos alcuotas por muestra como se describe en el tema b. del presente capitulo.

Nota: Asegrese de realizar cada uno de los envos de muestras a los diferentes laboratorios de referencia acompaados con el formulario de Envo de muestras para control de calidad y confirma del diagnstico Serolgico de VIH (anexo 19). 31

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b. Procedimiento de embalaje de muestras

Plasma, Suero y/o Sangre Total: Coloque la muestra en un recipiente primario a prueba de agua, bien cerrado (tubo pequeo vial). Antes de embalarlo para su envo, la parte externa del recipiente debe ser examinada cuidadosamente y limpiarse en caso de que haya sangre u otros contaminantes. Introduzca el recipiente primario con la muestra en un recipiente secundario, el cual debe ser a prueba de agua y de material resistente. Llene el espacio entre los recipientes primario y secundario con material absorbente (papel toalla o algodn), para absorber el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una prdida durante el transporte. Luego, el recipiente secundario debe taparse bien y fijarse con cinta. Coloque refrigerantes dentro de un termo y espere aproximadamente 30 minutos que alcance la temperatura adecuada para el transporte de muestras. Introduzca el recipiente secundario previamente empacado con las muestras en el termo. Asegrese de colocar los formatos de solicitud de prueba y el formulario de e nvo de muestras para control de calidad y confirma del diagnstico Serolgico de VIH (anexo 19) con la informacin completa y con la codificacin correspondiente a cada una de las muestras a ser enviadas, insrtelas en un sobre identificado con el nombre del destinario y remitente, este debe colocarse, dentro de una bolsa de plstico y pegarse con cinta adhesiva en el exterior del termo. Cierre el termo hermticamente. Al transportar las muestras en el termo, debe evitar que este entre en contacto con el sol, de lo contrario puede afectar la calidad de las muestras.

Muestra de sangre seca en papel filtro: Anexo 10 Una vez seca la muestra (inciso c y d captulo II) coloque la tarjeta de papel filtro dentro de un sobre de papel de cera. Coloque el sobre de papel de cera doblado dentro de una bolsa plstica de cierre hermtico (Se pueden guardar hasta 5 muestras en una misma bolsa). Inserte de 3-5 desecantes dentro de la bolsa y una tarjeta para medir la humedad. Presione la bolsa para sacar todo el aire y cirrela. Asegrese que la bolsa este bien cerrada. Mantenga las tarjetas de muestras en la bolsa plstica cerrada, en un lugar fresco y seco a temperatura ambiente hasta ser enviadas al laboratorio. 32

Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH

5.

Coloque la bolsa que contiene las muestras dentro de un sobre de manila protector para evitar que sufra maltrato en el envo. Coloque las fichas de solicitud en el sobre. Engrape el sobre para que se mantenga cerrado y enve al CNDR. Evite dejarlo en el vehculo a plena luz del sol. Procedimientos Analticos

No existe ninguna manifestacin clnica que sea caracterstica de la infeccin VIH o del sida y aunque la presencia de alguna de ellas pueda sugerir en un contexto determinado la presencia de la infeccin, no es posible establecer un diagnstico clnico de la enfermedad por lo que ste solo se puede establecer de un modo definitivo por tcnicas de laboratorio. Por medio de ellas es posible detectar al propio virus o algunos de sus componentes. La prctica habitual es detectar el antgeno p24 y los anticuerpos especficos que el organismo produce como respuesta a la presencia del virus (mtodos serolgicos indirectos) o la amplificacin de una parte del material gentico del virus, por ejemplo cuantificacin de la carga viral por PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) y el ADN pro viral en el caso de los recin nacidos (mtodos directos). a. Prueba Rpida A1 Ensayo para la deteccin de antgenos o anticuerpos VIH1/2: El uso de de esta tcnica permite detectar Ag p24 y/o Ac anti-VIH 1/2 en suero, plasma y sangre total (muestra capilar) del paciente mediante inmunoensayo rpido basado en un principio de reaccin tipo sndwich inmunocromatogrfico. Alcance: Personal de laboratorio en los diferentes establecimientos de salud e instituciones pblicas y privadas que trabajan en el diagnstico del VIH/sida. Personal capacitado para realizar pruebas rpidas de laboratorio. Responsable: Profesionales y tcnicos de los diferentes establecimientos del Ministerio de Salud, e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida. Muestra: Sangre total. Suero. 33

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Plasma. Formularios y Registros: Libro de registro. Formulario de Solicitud de pruebas (anexo 18). Formato de resultado (anexo 13). Materiales: Pipetas descartables. Cronmetros. Marcadores permanentes. Bolgrafo. Tubos capilares o tubos de ensayo Instructivos del ensayo. Dispositivo de ensayo Reactivos: Buffer de corrida. Controles internos (Positivo y Negativo). Hipoclorito de sodio al 0.5%. Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Ensayo 4ta generacin. Combo Ag/ Ac. Leer instructivo del Kit. Ensayo 3ra generacin. Deteccin de Ac. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura estable de 2-8C protegidos de la luz y de la humedad. Una vez abierto el kit mantener las pruebas restantes en su bolsa de cierre hermtico, con el desecante del kit, cerrar la bolsa inmediatamente despus de que se saca la prueba a utilizar. Para una rpida vista de la interpretacin de la prueba leer anexo 11.

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b. Prueba Rpida A2 Ensayo para la deteccin de antgenos y anticuerpos VIH1/2: El uso de de esta tcnica permite detectar Ac anti-VIH 1/2 en suero, plasma y sangre total (muestra capilar) del paciente mediante inmunoensayo rpido basado en un principio de reaccin tipo sndwich inmunocromatogrfico. Alcance: Personal de laboratorio en los diferentes establecimientos de salud e instituciones pblicas y privadas que trabajan en el diagnstico del VIH/sida. Personal capacitado para realizar pruebas rpidas de laboratorio. Responsable: Profesionales y tcnicos de los diferentes establecimientos del Ministerio de Salud, e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida. Muestra: Sangre total Suero Plasma Formularios y Registros: Libro de registro Formulario de solicitud de prueba de VIH (anexo 18) Formato de resultado (anexo 13) Materiales: Cronmetros Marcadores permanentes Bolgrafo Tubos capilares o tubos de ensayo Instructivos del ensayo Dispositivo de ensayo Reactivos:

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Buffer de corrida. Controles internos (Positivo y Negativo) Hipoclorito de sodio al 0.5% Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura estable de 2-8C protegidos de la luz y de la humedad. Para una rpida vista de la interpretacin de la prueba leer anexo 12. c. Ensayo para la deteccin de Antgeno p24 y anticuerpos anti-VIH1/2 por ELISA 4ta generacin: El uso de de esta tcnica permite detectar Ag p24 y Ac anti-VIH 1/2 en suero y plasma del paciente mediante inmunoensayo de tipo ELISA de 4ta generacin de principio de reaccin tipo sndwich. Alcance: Personal de laboratorio clnico de los diferentes establecimientos que funcionan como centros de referencia regional o nacional para el diagnstico de VIH/sida del MINSA y personal de las instituciones pblicas o privadas que trabajan en el diagnstico del VIH/sida realizando la tcnica de ELISA. Responsable: Profesionales y tcnicos de los establecimientos del Ministerio de Salud que funcionan como centro de referencia regional o nacional para el diagnstico de VIH/sida e instituciones pblicas y privadas que realizan el diagnstico del VIH/sida utilizando la tcnica de ELISA. Muestra: Suero Plasma Formularios y Registros: 36

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Libro de registro Formulario de solicitud de prueba de VIH (anexo 18) Formato de resultado (anexo 14) Equipos: Lector ELISA, longitud de onda nica 450+ 5nm y 620-7000nm. Incubadora Mezclador vortex Micro agitador, velocidad aproximada 900 rpm. Lavador ELISA con sistema de aspiracin y lavado de micro pozos. Recipiente para almacenar los desechos aspirados por el lavador ELISA. Pipeta multicanal 5-50l Pipeta automtica 10-100l Pipeta automtica 1000l Materiales: Marcadores permanentes Bolgrafo Recipiente de desechos biolgicos peligrosos Papel absorbente Guantes desechables Cronmetro Recipientes desechables para la preparacin de sustrato Punta de pipeta automtica de 5-100l Punta de pipeta automtica de 50-200l Punta de pipeta automtica de 100-1000l Reactivos: Kit ELISA de trabajo Alcohol isopropilico al 70% Agua destilada o des ionizada Hipoclorito de sodio al 0.5% Controles internos (Positivo y Negativo) 37

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Hipoclorito de sodio al 0.5% Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura estable de 2-8C protegidos de la luz y de la humedad. d. Ensayo para la deteccin de anticuerpos VIH 1/2 por western Blot El uso de de esta tcnica permite detectar Ac anti-VIH 1/2 en suero y plasma del paciente mediante inmunoensayo cualitativo. Alcance: Al personal del Departamento de Virologa del CNDR que realiza la prueba de Western blot de VIH. Responsable: Coordinador del departamento de virologa del CNDR y personal que realiza la tcnica. Muestra: Suero Plasma Formularios y Registros: Libro de registro Formulario de solicitud de prueba de VIH (anexo 18) Formato de resultado (anexo 15) Equipos: Pipetas de transferencia Pipeta automtica de 50-200l 38

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Pipeta automtica de 1-5ml Rotador serolgico Materiales: Marcadores permanentes Bolgrafo Recipiente de desechos biolgicos peligrosos Papel absorbente Guantes desechables Cronmetro Recipientes desechables para la preparacin de sustrato Punta de pipeta automtica de 1-5 ml Viales de 1.5ml Beakers Erlenmeyer Probetas Pipeta automtica de 1 a 5 ml Reactivos: Tiras de nitrocelulosa Kit de western blot Agua destilada o desionizada Hipoclorito de sodio al 0.5% Guantes descartables Bandeja de incubacin Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura estable de 2-8C protegidos de la luz y de la humedad. Nota: 39

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Un resultado Negativo no constituye una garanta de la ausencia del agente causal del Sida. Se recomienda repetir la muestra indeterminada (Dudosa) del tubo original y de una nueva muestra seriada. Se debe repetir la toma de muestras 3 meses despus de emitido el resultado. Los anticuerpos frente a la p24 y la p31 disminuyen durante el curso del Sida lo que provoca un desplazamiento de la interpretacin de positiva a dudosa por consiguiente, en tales circunstancias, la interpretacin de los resultados debe basarse en las transferencias posteriores y en las evaluaciones clnicas.

e. Ensayo para la deteccin de carga viral de VIH 1 por el mtodo de PCR en tiempo Real El uso de esta tcnica en el diagnstico y tratamiento del sida permite la cuantificacin de VIH1 que se encuentra en el plasma. El mtodo empleado consiste en tcnicas de biologa molecular usando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La carga viral resulta un marcador de la actividad del VIH-1 y junto con la determinacin de linfocitos CD4 miden la competencia del sistema inmune del paciente. La determinacin de la carga viral plasmtica del VIH es el marcador de respuesta al tratamiento antirretroviral ms sensible, rpido y fiable. La carga viral se correlaciona directamente con el pronstico clnico, el riesgo de transmisin viral y el recuento de CD4. Es una herramienta bsica en el manejo clnico del paciente seropositivo. Alcance: Al personal del Departamento de Virologa del CNDR que realiza la prueba de carga viral de VIH. Responsable: Coordinador del departamento de virologa del CNDR y personal que realiza la tcnica. Muestra: Plasma Formularios y Registros: Libro de registro Formulario de solicitud de prueba de VIH (anexo 16) Equipos: 40

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Equipo de extraccin de ARN/ARN automatizado Equipo de cuantificacin de ARN/ADN en tiempo real Cabina para PCR tipo II Refrigerador 2 8C Freezer 80 C Pipeta automtica de 50-200l Pipeta automtica de 100-1000l Materiales: Guantes sin talco Guantes para almacenamiento en fro (-80C) Bolgrafos Marcadores permanentes Formatos de registros Viales 1.5 ml Papel absorbente Pipetas de transferencia Puntas para micropipeta con filtro de 50-200l Puntas para micropipeta con filtro de 100-1000l Campos de trabajo desechables Bolsas de descarte (riesgo biolgico) 8x12 Bolsas de descarte (riesgo biolgico) 25x35 Cajas almacenadoras de 81 posiciones Racks de almacenamiento

Reactivos: Kit de carga viral Alcohol al 70% solucin RNAsa Hipoclorito de sodio al 0.5% Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de 41

Gua de Procedimientos para el Diagnstico y Seguimiento de VIH

las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura estable de 2-8C protegidos de la luz y de la humedad. Nota: Rango de referencia del mtodo es de 20 - 10, 000,000 cp/ml HIV ARN.

f.

Ensayo para el recuento de linfocitos T CD3/CD4/CD8

Esta tcnica realizada por el principio de citometra de flujo, permite conocer el nmero absoluto de sub poblaciones de linfocitos T por ml de sangre perifrica. Es importante para el estudio del estado del sistema inmunolgico de pacientes infectados con el virus del VIH. La reduccin progresiva de Linfocitos T est altamente asociada con la severidad del VIH y un pronstico desfavorable. Alcance: Personal de laboratorio clnico de los diferentes establecimientos que funcionan como centros de referencia regional o nacional del MINSA para el monitoreo de VIH/sida mediante el recuento de CD3/CD4/. Responsable: Profesionales y tcnicos de los establecimientos del Ministerio de Salud que funcionan como centro de referencia regional o nacional. Muestra: Sangre total con anticoagulante EDTA K2/K3 Formularios y Registros: Libro de registro Formulario de solicitud de prueba de VIH (anexo 16) Equipos: Clitmetro de flujo Mezclador de sangre tipo vortex 42

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Refrigeradora 2-8 C Pipeta automtica de 50-200l Pipeta automtica de 100-1000l Materiales: Guantes descartables Contenedor de desechos Papel trmico Viales 1.5ml Marcadores permanentes Bolgrafos Formatos de registros Termo Puntas para micropipeta con filtro de 50-200l Puntas para micropipeta con filtro de 100-1000l Papel absorbente Campos de trabajo desechables Bolsas de descarte (riesgo biolgico) 8x12 Bolsas de descarte (riesgo biolgico) 25x35

Reactivos: Reactivos del Kit Controles internos Solucin lquida Alcohol isopropilico al 70% Agua destilada Hipoclorito de sodio al 0.5%

Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. 43

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Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura estable de 2-8C protegidos de la luz y de la humedad.
g. Ensayo para la deteccin de ADN pro viral del VIH 1

Desde el nacimiento y aproximadamente hasta los 18 meses de edad los hijos de madres seropositivas al VIH pueden presentar pruebas serolgicas (deteccin de Ac) positivas, lo cual no es necesariamente indicativo de infeccin ya que dichos Ac pueden ser inmunoglobulinas G de origen materno que cruzaron la placenta durante el embarazo. La amplificacin del ADN proviral del VIH-1, constituye un mtodo preferencial para el diagnstico perinatal, es un ensayo cualitativo in vitro para la deteccin del ADN proviral de VIH-1 en sangre total y/o muestra seca. Alcance: Al personal del Departamento de Virologa del CNDR que realiza la prueba de carga viral de VIH. Responsable: Coordinador del departamento de virologa del CNDR y personal que realiza la tcnica. Muestra: Sangre total con EDTA K2/K3 Muestra seca en papel filtro Formularios y Registros: Libro de registro Formulario de solicitud de prueba de VIH (anexo 17) Equipos: Equipo de extraccin de ARN/ARN automatizado Equipo de cuantificacin de ARN/ADN en tiempo real Cabina para PCR tipo II Refrigerador 2 8C 44

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Freezer 80 C Pipeta automtica de 50-200l Pipeta automtica de 100-1000l Materiales: Guantes sin talco Guantes para almacenamiento en fro (-80C) Bolgrafos Marcadores permanentes Formatos de registros Viales 1.5 ml Papel absorbente Pipetas de transferencia Puntas para micropipeta con filtro de 50-200l Puntas para micropipeta con filtro de 100-1000l Campos de trabajo desechables Bolsas de descarte (riesgo biolgico) 8x12 Bolsas de descarte (riesgo biolgico) 25x35 Cajas almacenadoras de 81 posiciones Racks de almacenamiento

Reactivos: Kit de ADN Proviral Alcohol al 70% solucin RNAsa Hipoclorito de sodio al 0.5% Procedimiento: Leer instructivo del Kit. Debe seguirse estrictamente los procedimientos detallados en los instructivos de las casas comerciales autorizadas por el CNDR-MINSA. Respetar tiempos y temperaturas de almacenamiento del kit. Mantener el kit a una temperatura la humedad. estable de 2-8C protegidos de la luz y de

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XII. Anexo

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Anexo 1 REPUBLICA DE NICARAGUA MINISTERIO DE SALUD ALGORITMO DE PRUEBAS DIAGNOSTICAS DE VIH PERSONA
Establecimiento de Salud Primer Prueba Rpida (A1)

Realizar inmediatamente segunda prueba rpida A2

Reactor

A1

No reactor

Reportar Resultado No Reactor

Reportar Resultado Preliminar Reactivo Realiar ELISA

Reactor

A2

No reactor

Realizar ELISA

Reportar Resultado Positivo

Positivo

ELISA

Negativo

Solicitar Nueva Muestra en 3 Semanas

Reportar Resultado Positivo

ELISA

Negativo
Reportar Resultado Negativo

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Enviar Muestra al CNDR con historial de anlisis para el control de calidad de la red de laboratorios Enviar Muestra al CNDR con historial de anlisis para el control de calidad de la red de laboratorios

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Anexo 2 Distribucin del Volumen de Muestra Requerido Segn Tipo de Anlisis

Propsito Tipo de Muestra Volumen

Diagnstico Serolgico de VIH por Suero venopuncin (Prueba Rpida, ELISA, Western Blot) Plasma Sangre total ADN Proviral Sangre seca en papel filtro Sangre total Plasma Sangre total

2 ml 2 ml 5 ml 2-3ml en nios 5 crculos completos (mnimo 3) 5 ml 2 viales de 1 .5 ml cada uno 5 ml en adultos 2-3 ml en nios

Carga viral Recuento de linfocitos T CD3, CD4, CD8

Anexo 3 Toma de muestra venosa

Fuente: Material didctico CNDR-MINSA

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Anexo 4 Toma y recoleccin de muestra en papel filtro

Fuente: Material didctico departamento de virologa CNDR MINSA.

Anexo 5 Secado de muestra en el soporte para papel filtro

Fuente: Material didctico departamento de virologa CNDR MINSA.

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Anexo 6 Muestras Reactivas por Pruebas Rpidas (Confirmacin en SILAIS)

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Anexo7 Muestras no reactivas por pruebas rpidas Control de calidad en SILAIS)

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Anexo 8 Muestras positivas por ELISA (Confirmacin en CNDR)

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Anexo 9 Muestras negativas por ELISA (Control de calidad en CNDR)

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Anexo 10 Embalaje de sangre seca en papel filtro

Fuente: Material didctico departamento de virologa CNDR MINSA.

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Anexo 11 Interpretacin de resultados prueba rpida A1 Prueba rpida 4ta Generacin Prueba rpida 4ta Generacin

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Anexo 12 Interpretacin de Resultados Prueba Rpida A

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Anexo 13

Resultado de Prueba Rpida

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Anexo 14 Resultado de ELISA

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Anexo 15 Resultado de Western Blot

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Anexo 16 Solicitud de Prueba de Carga Viral y Recuento de CD3, CD4 y CD8

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Anexo 17 Solicitud de Prueba de ADN Proviral

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Anexo 18 Hoja de consentimiento y Solicitud de Prueba de Diagnstico Serolgico de VIH

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Anexo 19 Formato de Envo de muestras para control de calidad y confirma del diagnstico Serolgico de VIH

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BIBLIOGRADFIA:

Gua para la toma, identificacin, manejo, conservacin y transporte de muestras para laboratorios de Salud. Edicin 2010, CNDR/MINSA, Managua, Nicaragua. Manual Para el Control de Calidad de las pruebas de VIH. 2da Edicin, 2010, Ministerio de Salud, El Salvador. Manual de procedimientos para la deteccin y diagnstico de la infeccin por VIH. Edicin 2009, Ministerio de Salud, Santiago de Chile. Manual de procedimientos para el diagnstico de VIH. Edicin 2007, CNDR/MINSA, Managua, Nicaragua. Manual de procedimientos para el diagnstico de VIH. Edicin 2005, CNDR/MINSA, Managua, Nicaragua. Manual de procedimientos de bioseguridad. Edicin 2007, Laboratorio Regional de Referencia VIH/Sida Centroamrica, LRR-VIH/Sida. Manual de bioseguridad en el laboratorio. 3ra edicin, 2005. Organizacin Mundial de la Salud (OMS). ISBN 92 4 354650 3. Safety in health-care laboratories. Geneva, World Health Organization, 1997, (http://whqlibdoc.who.int/hq/1997/WHO_LAB_97.1.pdf).

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