7.

Elabore la guía de práctica de la prueba de ELISA utilizada para el

diagnóstico de Fasciolosis Humana

ELISA INDIRECTO PARA EL DIAGNÓSTICO DE FASCIOLOSIS

HUMANA
El kit Fasciola hepatica ELISA está destinado a la detección cuantitativa de
anticuerpos IgG contra fasciola hepatica en suero humano. La serología constituye
una ayuda para el diagnóstico y no se puede utilizar como el único método de
diagnóstico

Principio:
Se realiza en pocillos separables de microtitulación sensibilizados con antígenos
recombinantes de Fasciola hepatica. Los anticuerpos específicos en la muestra se
unirán a estos antígenos y el lavado eliminará los anticuerpos inespecíficos. La
presencia de anticuerpos específicos contra el antígeno parasitario es detectada
mediante un conjugado proteína A - fosfatasa alcalina. Una segunda etapa de
lavado eliminará el conjugado no unido. El revelado de los anticuerpos unidos se
realiza mediante la adición de sustrato pNPP que se torna amarillo en presencia
de fosfatasa alcalina. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de
anticuerpos específicos de Fasciola hepatica en la muestra. El fosfato potásico se
añade para parar la reacción. La densidad óptica a 405 nm se lee con un lector de
microplacas ELISA.

Procedimiento:
Etapa 1: Bloqueo:
Llenar completamente los pocillos con la solución de tampón de dilución.
Incubar 5 a 15 minutos a temperatura ambiente (bloqueo de los pocillos).
Eliminar el tampón de dilución por aspiración o sacudiendo el soporte con los
pocillos en el lavabo.
Etapa 2: Incubación con las muestras a analizar:
Llenar el primer pocillo de la tira con 100 µl de tampón de dilución (Blanco sin
suero).
Llenar los 3 pocillos siguientes con 100 µl de suero negativo, débilmente positivo
(cut off) y suero positivo respectivamente.
Para el análisis de más de 25 muestras, recomendamos llenar los tres últimos
pocillos con suero de control como duplicado. Llenar los otros pocillos con las
muestras diluidas (100 µl).
Cubrir los pocillos con un film adhesivo e incubar 30 minutos a 37°C. Eliminar los
sueros y lavar 4 veces con ~ 250 µl de la solución de lavado.

Etapa 3: Incubación con el conjugado:

Distribuir 100 µl de conjugado diluido en cada pocillo (incluido el pocillo blanco, sin
suero).
Cubrir los pocillos con una lámina adhesiva e incubar 30 minutos a 37°C.
Eliminar el conjugado y lavar 4 veces con ~ 250 µl de la solución de lavado.
Etapa 4: Incubación con el sustrato:
Distribuir 100 µl de la solución del sustrato en cada pocillo.
Cubrir los pocillos con una lámina adhesiva e incubar 30 minutos a 37°C.
Parar la reacción en adicionando 100 µl de la solución de parada a cada pocillo.
Etapa 5: Medida de la densidad óptica:
Si fuera necesario, limpiar la parte inferior externa de los pocillos con un papel
absorbente y eliminar las burbujas de aire.
Proceder a la lectura de la densidad óptica (DO absorbencia) a una longitud de
onda de 405 nm 1 hora después de la adición de la solución de parada.

Interpretación:
Sustraer el valor obtenido del pocillo blanco sin suero de todos los otros valores
medidos. Cuando corresponda, calcule los valores medios de densidad óptica de
los sueros de control duplicados. La prueba es válida si los tres criterios siguientes
se cumplen:
- DO del control positivo > 1.200
- DO del control negativo < 9 % del control positivo
- DO del blanco < 0.350
La concentración en anticuerpos del suero débilmente positivo 9650-07 ha sido
ajustado para permitir una distinción óptima entre los sueros de casos clínicos de
distomatosis y los sueros de sujetos sanos. El índice límite de una muestra se
define, después de la sustracción del pocillo blanco sin suero, como:
densidad o ´ ptica de la muestra
Indice¿
densidad óptica del suero cut off
El resultado es negativo cuando el índice del suero a analizar es menor de 1,0. En
este caso la concentración de anticuerpos IgG dirigidos contra los antígenos
recombinantes de Fasciola hepatica no tiene una significación clínica. El resultado
es positivo cuando el índice del suero a analizar es mayor de 1,0. En este caso la
concentración de anticuerpos IgG dirigidos contra los antígenos recombinantes de
Fasciola hepatica es considerado como clínicamente significativo. Indica que el
paciente ha estado en contacto con el parásito. Cada laboratorio podría definir una
zona gris en función de su población de pacientes. En caso de resultados
ambiguos o dudosos, recomendamos repetir la prueba 2-4 semanas después con
una muestra fresca.

CHAGAS
8.¿Cuáles son las pruebas de laboratorio utilizadas para diagnosticar
enfermedad de Chagas en cada una de sus etapas clínicas?
Fase aguda: ELISA, hemaglutinación indirecta, PCR, Concentración de Strout
Fase crónica: frotis sanguíneo, IFI, xenodiagnóstico, hemocultivo, gota fresca

9.¿Qué es el Xenodiagnóstico y como se realiza?

Es un procedimiento de laboratorio en el que se utiliza al insecto vector como
medio biológico de cultivo para la detección de la infección por Trypanosoma cruzi
en el paciente. El Xenodiagnóstico está constituido por una caja cilíndrica de
madera cuyas medidas internas son 3 cm de diámetro por 3,5 cm de alto, cubierta
por un trozo de gasa que se sujeta con un elástico, en cuyo interior se depositan
7-10 ninfas de triatominos, las cuales no han sido alimentadas en las 3-4 semanas
previas. Dicha caja, afirmada por un brazaleta de género se aplica, durante 20-30
minutos sobre la piel de la extremidad superior, de preferencia en el brazo del
individuo que va a ser examinado. Transcurrido este lapso, las ninfas que han
aumentado significativamente de volumen, son transportadas, dentro de las cajas,
al laboratorio entomológico, con condiciones de temperatura y humedad relativa
ambiental adecuadas, donde se las mantiene. Después de 30 días, la obtención
de las muestras a examinar, en busca de formas móviles de T. infestans

10. ¿Cómo se diagnostica la enfermedad de Chagas congénita?

En el recién nacido, hijo de la gestante, proceder a examinar simultáneamente la
presencia del parásito por las técnicas de microconcentración o PCR y el nivel
basal de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi por ELISA e IFI. Antes de los
seis meses, no es posible distinguir si los anticuerpos (IgG) específicos detectados
son propios o adquiridos vía transplacentaria de la madre por lo que es de
importancia realizar el seguimiento de la evolución del título serológico al tercer
mes, a los seis meses y al año de vida. Si el examen parasitológico en el recién
nacido resulta negativo, la elevación o mantenimiento del título de anticuerpos con
relación al nivel basal certificaría la infección, y, por el contrario, si este disminuye
la descartaría. Por otro lado, si el examen parasitológico en el recién nacido
resulta positivo, el título de anticuerpos permitirá monitorizar el tratamiento.

11. Elabore la guía de práctica de las pruebas de Hemaglutinación

pasiva e inmunofluorescencia indirecta para el diagnóstico de la
enfermedad de Chagas.
HEMAGLUTINACIÓN PASIVA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA
ENFERMEDAD DE CHAGAS.

Principio:
La hemaglutinación indirecta (HAI) se basa en la propiedad que tienen los
anticuerpos (que en este caso son anti-T. cruzi) de producir aglutinación específica
en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con antígenos citoplasmáticos y de
membrana del Trypanosoma cruzi. utiliza glóbulos rojos de ave, que al ser de
mayor tamaño que los de carnero, aceleran la visualización de la reacción. Los
anticuerpos interferentes, que pueden causar aglutinación inespecífica, se
eliminan con el agregado de la solución proteica, la cual tiene inhibidores de los
mismos.
Procedimiento:
- PRUEBA CUALITATIVA
1- En un tubo de hemólisis colocar 400 ul de Diluyente de Sueros HAI A-V y
adicionar 10 ul de suero o controles (dilución 1/40).
2- Colocar 50 ul de la dilución 1/40 de suero o controles en un pocillo de la
policubeta y agregar 25 ul de Antígeno HAI A-V.
3- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante por lo
menos 30 segundos.
4- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos a temperatura
ambiente.
5- Leer a partir de los 60 minutos. Puede aumentarse la nitidez de la apreciación,
leyendo sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un
papel blanco traslúcido entre la policubeta y la fuente de luz.
II- PRUEBA CUANTITATIVA
1- En una misma serie de 6 pocillos colocar 50 ul de Diluyente de Sueros HAI A-V
en los pocillos 2, 3, 4, 5 y 6.
2- Pipetear 50 ul de la dilución 1/40 de suero o controles en los pocillos 1 y 2.
3- Transferir 50 ul del pocillo 2 al 3 y así sucesivamente, desechando 50 ul del
último pocillo, evitando la formación de burbujas.
4- Homogenizar por inversión el Antígeno HAI A-V.
5- Agregar a cada dilución 25 ul de Antígeno HAI A-V.
6- Agitar la policubeta aplicando suaves golpes en los laterales durante por lo
menos 30 segundos.
7- Dejar en reposo, protegido de vibraciones durante 60 minutos.
8- Leer a partir de los 60 minutos. El título del suero será el de la mayor dilución de
suero reactivo.

Interpretación de resultados
Reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón, nítido y de bordes netos
en el fondo del pocillo.
Reactivo Débil: manto pequeño sobre el fondo del pocillo con botón más o menos
definido en el centro.
Fuertemente Reactivo: formación de una película o manto a veces de bordes
irregulares en el fondo del pocillo.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA EL DIAGNÓSTICO

DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS.
Principio:
La técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), emplea como antígeno
epimastigotes de Trypanosoma, obtenidos de cultivo y fijados en láminas sobre las
que se realiza la reacción antígeno-anticuerpo. La formación de este complejo es
evidenciada por una antiglobulina humana marcada con fluoresceína
Procedimiento:
Elaborar el protocolo de trabajo
En cada corrida se debe incluir el control positivo (CP), control negativo (CN),
control interno para IFI (CI) y control de reactivos o blanco (B).
a) Retirar del congelador las láminas IFI fijadas con Trypanosomas y dejarlas
secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador.
b) En una placa para microtitulación, realizar la dilución 1/32 de cada suero y de
los controles. Para ello, dispensar en cada pozo 155 µL de buffer diluyente y 5 µL
de cada suero por evaluar.
c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la micropipeta
varias veces, luego siguiendo el protocolo elaborado, dispensar 15 uL de la
dilución 1/32 de cada suero sobre el área del círculo correspondiente en la lámina
IFI.
d) Colocar la lámina en una cámara húmeda y llevarla a incubar a la estufa 37 °C
durante 30 minutos.
e) Retirar la lámina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con PBS-
Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la ayuda de una pizeta
retirar los sueros de la lámina, la segunda y tercera vez en un frasco Coplin
mantenido en agitación suave durante ocho minutos cada vez.
f) Colocar la lámina sobre papel secante y dejar secar a temperatura ambiente o
con la ayuda de un ventilador o secador.
g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína
(titulado), en cada área circular e incubar a 37 °C por 30 minutos.
h) Retirar la lámina de la estufa y lavar al igual que en el ítem e, después del
último lavado, enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual que en el ítem f.
i) Agregar 15 uL de la solución diluida de azul de Evans en cada pocillo y dejar
durante cinco minutos a temperatura ambiente.
j) Enjuagar la lámina con agua destilada, empleando una pizeta. Luego, dejarla
secar a temperatura ambiente.
k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla
cubreobjetos
l) Conservar la lámina en oscuridad hasta la lectura, se recomienda que sea el
mismo día del procesamiento para evitar la pérdida de fluorescencia.
Interpretación de resultados:
El título de valor diagnóstico en el laboratorio es 1/32
REACTIVO: Se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi.
NO REACTIVO: No se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi.
INDETERMINADO: No concluyente. Es necesario repetir el ensayo y de persistir
el resultado se debe evaluar una nueva muestra, obtenida tres semanas después
de la primera, tiempo necesario para que el nivel de anticuerpos sea mayor y
detectable en caso la infección sea reciente.

12. ¿Cómo se diagnostica la Toxoplasmosis congénita?

En un madre gestante, en su control prenatal se le realiza la
hemaglutinación indirecta o ELISA indirecto para el diagnóstico de
toxoplasmosis congénita, resulta positivo y luego al recién nacido se le
realiza un seguimiento hasta el año de vida con pruebas serológicas
como la PCR, ELISA e IFI.