MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA NÚMERO 5
“DETECCION DE ANTICUERPOS ANTI-M2 MEDIANTE TECNICAS
INMUNOLOGICAS: ELISA”

1. OBJETIVOS

Que el alumno determine la presencia de anticuerpos IgG antimitocondriales en

suero humano.

2. PRELABORATORIO

A. ¿Cuál es la importancia de utilizar controles positivos y negativos durante el

ensayo ELISA?
B. ¿Cuáles son algunas de las posibles limitaciones o fuentes de error que pueden
afectar los resultados de un ensayo ELISA para la detección de anticuerpos anti-M2 y
cómo se pueden mitigar?
C. ¿Cuál es la diferencia entre un ensayo ELISA directo y uno indirecto?

3. INTRODUCCION
La técnica de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, por sus siglas en inglés) es
una técnica inmunológica fundamental para detectar antígenos y anticuerpos en muestras
biológicas. Esta técnica se basa en la unión específica de anticuerpos a antígenos,
utilizando reacciones enzimáticas para generar señales detectables. Con diferentes
presentaciones como el ELISA directo, indirecto, de competición y de captura, se adapta a
diversas aplicaciones, desde investigación básica hasta diagnóstico clínico. Su
automatización permite análisis eficientes de numerosas muestras. Esta metodología sigue
siendo esencial en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico, impulsando avances
en salud. Mediante esta técnica, es posible detectar la tiroglobulina, una proteína producida
por la glándula tiroides. En el contexto de enfermedades tiroideas, como el cáncer de
tiroides, el ELISA anti-tiroglobulina es una herramienta esencial para monitorear los niveles
de esta proteína en suero o plasma. La detección de anticuerpos contra la tiroglobulina
mediante ELISA puede indicar la presencia de enfermedad tiroidea autoinmune o
recurrencia de cáncer de tiroides. Por lo tanto, el ELISA se convierte en una técnica crucial
en el diagnóstico y seguimiento de pacientes con trastornos tiroideos, contribuyendo
significativamente a la gestión clínica y el tratamiento adecuado.

Fundamento de la técnica:
Los anticuerpos anti-M2 (subtipo mitocondrial) presentes en el suero se unen al antígeno
adsorbido a la superficie de los pocillos de la microplaca. A continuación, se incuba con
anticuerpos anti-IgG humana conjugados con peroxidasa. Finalmente, se añade el sustrato
(3,3,5,5´- tetrametilbencidina (TMB) en presencia de H 2O2, que al ser degradado por la
peroxidasa da lugar a un producto de color azul. La reacción enzimática se detiene con una

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solución de ácido y la formación de producto amarillo se mide a 450 nm. La concentración
de anticuerpos en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto de la reacción.
Características diagnosticas:
Los anticuerpos anti-mitocondriales están fuertemente asociados con la cirrosis biliar
primaria y se hallan presentes en el suero de aproximadamente el 90-95% de los pacientes.
Hasta la fecha se han descrito nueve subtipos de anticuerpos mitocondriales, aunque
solamente 4 guardan relación con la cirrosis biliar primaria: M2, M4, M8 y M9. Sin embargo,
esta bien establecido que solo los ac anti-M2 son específicos de cirrosis biliar primaria.
Estos anticuerpos pueden ser detectados años, incluso décadas, antes de la aparición
síntomas clínicos e histológicos. Para el diagnóstico diferencial de cirrosis biliar primaria se
recomienda la determinación de anticuerpos anti-M2 mediante ELISA por su elevada
sensibilidad y especificidad.
La sensibilidad y especificidad para cirrosis biliar primaria del kit de anticuerpos Anti-M2 de
BioSystems fue del 97.2% y 94.2%, respectivamente, en un estudio con 470 muestras
clínicas.
El diagnóstico clínico debe complementarse con datos clínicos y otras pruebas
determinantes.
4. MATERIALES Y METODOS

Material requerido por equipo:

• Proporcionado por la Institución:

Sustancias Materiales

Tampón de lavado concentrado Microplaca 96 pocillos

Diluyente para muestra
Control positivo Equipo
Control negativo Lector de placas
Conjugado
Solución de paro
Patrones S1-S6

• Proporcionado por el alumno:

Muestra de sangre en tubo con anticoagulante (EDTA, tapa lila)

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de los reactivos:

• Tampón de Lavado concentrado: 50 mL tampón fosfatos, azida de sodio

15mmol/L.
• Diluyente de muestra. 100 mL Tampón Tris, azida de sodio 15 mmol/L

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 • Control positivo. 1.5 mL. Listo para su uso. Suero humano con anticuerpos anti-
Tg, azida de sodio 15 mmol/L
• Control negativo 1.5. Listo para su uso. Suero humano negativo para
anticuerpos anti-Tg, azida de sodio 15 mmol/L
• Conjugado. 15 mL. Inmunoglobulinas policlonales de conejo anti-IgG humana
conjugadas con peroxidasa.
• Sustrato. 15 mL 3,3,5,5´- tetrametilbencidina (TMB).
• Solución de paro. 15mL Ácido fosfórico 4,5%

*PELIGRO el ácido fosfórico puede causar quemaduras. EN CASO DE

CONTACTO CON LA PIEL. Retirar inmediatamente las prendas
contaminadas, y enjuagar con abundante agua.

• Microplaca: 12 módulos de 8 pocillos cada uno sensibilizados Tg humana

altamente purificada.
• S1-S6 patrones. 1.5 mL listo para su uso. Suero con anti-Tg, azida de sodio
15mmol/L. Las concentraciones de anticuerpos anti-Tg son 0, 100,
300,1000,3000 y 9000 IU/mL.

2. Preparación de la muestra:

• Suero recogido mediante procedimiento estándar.

• Diluir las muestras 1/100 con diluyente de muestra antes del ensayo

3. Atemperar los componentes del kit a temperatura ambiente (TA).

4. Abrir la bolsa de la microplaca y retirar la cantidad necesaria de pocillos.
5. Determinación cuantitativa:
• Pipetear 100 μL en distintos pocillos de:
▪ Cada uno de los patrones (S1-S6)
▪ Control positivo (C+)
▪ Control negativo (C-)
▪ Muestra (s) diluida (s) previamente1/100
6. Determinación cualitativa:
• Pipetear 100 μL en distintos pocillos. de:
▪ Patrón S3
▪ Control positivo (C+)
▪ Control negativo (C-)
▪ Muestra (s) diluida (s)
▪ Diluyente de muestra para el blanco

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7. Incubar los pocillos durante 30 minutos (15 min) en cámara húmeda a TA
8. Decantar el líquido y lavar los pocillos con 300 μL de Tampón de lavado durante
unos 10 segundos 3 veces

9. Pipetear 100 μL de conjugado (D) en cada uno de los pocillos.

10. Incubar los pocillos durante 15 min en cámara húmeda a TA.
11. Lavar como el paso 8.
12. Pipetear 100 μL de sustrato (E) en cada uno de los pocillos

13. Incubar los pocillos durante 15 min en cámara húmeda a TA.

14. Pipetear 100 μL de solución de paro (F) en cada uno de los pocillos e incubar durante
5 min a temperatura ambiente.

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15. Medir la absorbancia del contenido de cada pocillo a 450 nm usando el patrón
S1 o el blanco para el ajuste a 0. El color es estable durante 30 min.

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RESULTADOS

5. ANALISIS DE LOS RESULTADOS

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 6. CONCLUSIONES

7. BIBLIOGRAFIA

Mandal, S.M., Paul, D. (2022). Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). In:

Automation and Basic Techniques in Medical Microbiology. Springer, New York, NY.
Abbas, A. K., Lichtman, A. H., y Pillai, S. (2020). Inmunología celular y molecular. Elsevier
Health Sciences.
Owen, J. A.; et al. Kuby immunology (p. 692). New York: WH Freeman. 2013.