LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA-UNI

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA Y TEXTIL

LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y
MICROBIOLOGIA

MEDIOS DE CULTIVO

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Un Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar
los microorganismos, as como efectuar pruebas de susceptibilidad, proporcionndoles las
condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo, estos requieren elementos que se
encuentran en su composicin qumica. Los factores que se deben regular durante el
crecimiento son los nutrientes, pH, temperatura, aireacin, concentracin de sales, y potencia
inica del medio.
Los componentes necesarios que debe contener un medio de cultivo deben ser:
a.- Fuente de carbono
Los microorganismos obtienen su energa a travs de la fotosntesis o de la oxidacin de
compuestos orgnicos, son capaces de utilizar el CO2 como fuente principal de carbono. El
carbono se suministra generalmente en forma de carbohidratos
b.- Fuente de nitrgeno
El nitrgeno es un componente de primer orden de las protenas y cidos nucleicos, las fuentes
pueden ser los nitratos, nitritos, nitrgeno, amonio y aminocidos.
c.- Fuentes de azufre
El azufre es uno de los constituyentes orgnicas de la clula, constituye parte de la estructura
de diversas coenzimas y se encuentra formando parte de la metionina y cistena, la mayora de
las bacterias toman el azufre del in sulfato, otros ms lo pueden obtener a partir del H2S.
d.- Fuente de fsforo
Se requiere fosfato como componente de ATP, cidos nucleicos y coenzimas como el NAD,
NADH y flavinas. El fosfato se asimila como fosfato inorgnico.
e.- Fuentes minerales
Algunos microorganismos requieren de iones Mg2+ y ferroso Fe2+, el magnesio es un
componente de la molcula de clorofila y el hierro es parte de las coenzimas de los citocromos
y las peroxidasas. El potasio se requiere para la funcin de los ribosomas y el calcio es un
constituyente de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas
f.- Factores de crecimiento
Se llama factor de crecimiento a la sustancia que favorece el crecimiento pero que el
microorganismo es incapaz de sintetizar. Los factores de crecimiento pueden ser vitaminas del
complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, biotina), algunas de estas sustancias se
pueden obtener del suero, yema de huevo o sangre.

g.- Agar
El agar utilizado en bacteriologa es un medio que est libre de metales txicos, compuestos
nitrogenados, sales insolubles, azcares libres, microorganismos muertos, bacterias termfilas
y pigmentos.
El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas
rojas, particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis,
qumicamente el agar es una mezcla de dos polisacridos: agarosa y la agaropectina, cuyas
estructuras se revelan como polmeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporcin
de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de
agaropectina, segn la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fra tiene un poder
de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente
en pocos minutos. La tendencia a la unin de sus partculas, que en fro se mantienen

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independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso
de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la solucin
disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 40 C.

Preparacin de medios de cultivos

Las bacterias son organismos supremamente adaptables a diferentes sustratos. De acuerdo

con sus requerimientos nutricionales se consideran como exigentes y no exigentes. Su estudio
se ha hecho posible gracias a la implementacin delos medios de cultivos que le suministran al
organismo los elementos necesarios para su crecimiento. Los medios de cultivo son
preparaciones utilizadas para diferentes propsitos tales como: aislamiento e identificacin de
microorganismos, prueba de esterilidad, anlisis de agua, ambientales, alimentos y productos
bacteriolgicos, prueba de sensibilidad a los antibiticos.
Las bacterias auttrofas pueden utilizar el nitrgeno libre, amoniaco o nitrato, de tal manera
que los medios pueden ser muy simples. Los hetertrofos con una capacidad sinttica ms
limitada requieren compuestos ms complejos debido a que las clulas no pueden obtener sus
requerimientos de nitrgeno directamente de las protenas, stas deben estar hidrolizadas en
compuestos nitrogenados ms disponibles conocidos como peptonas, las cuales son derivados
de las protenas por medio de cidos, lcalis o enzimas y son solubles en agua.

Composicin de los medios de cultivos

Aunque los diferentes medios contienen gran cantidad de sustancias dependiendo del
microorganismo a aislar, bsicamente estn compuestos de:

Peptonas.- Varan en pureza y calidad dependiendo del tipo de hidrlisis realizada. Los lcalis
tienden a destruir el contenido vitamnico de la protena y tambin hacen perder parte de los
aminocidos, la hidrlisis conserva las vitaminas y aminocidos. La casena pura no contiene
carbohidrato, pero si contenido vitamnico y de triptfano.

Infusin y extractos.- Son de carne y otros tejidos, se trata de material de origen proteico,
soluble en agua, sin accin enzimtica. Las protenas mismas se coagulan por accin del calor.
Afortunadamente, la accin enzimtica microbiana y el tiempo de incubacin aumentan la
facilidad de utilizacin.

Agentes solidificantes: agar, gelatina, agarosa, agar noble.

Colorantes: cristal violeta o verde brillante, inhiben Gram positivos
Otros componentes:
Indicadores de pH.
Indicadores de oxido-reduccin: azul de metileno.

Cuidados y recomendaciones

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Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus componentes o segn las
recomendaciones del fabricante, cuando este se consigue comercialmente hay varias reglas
que se deben guardar para asegurar la buena calidad del medio preparado.
El agua utilizada debe ser destilada o desmineralizada, proveniente de un sistema adecuado
de destilacin, su medida debe ser exacta y en ningn momento con aproximaciones que
generalmente se traducen en una alteracin de la consistencia del medio, especialmente
cuando se trata de agares.
Si los ingredientes necesarios para preparar el medio de cultivo son deshidratados estos
deben permanecer en remojo durante 15 minutos, con la finalidad de permitir una hidratacin
total de las molculas, lo cual evita el calentamiento excesivo que conduce generalmente a
evaporacin y descomposicin del medio.
Antes de someterse a la accin de la autoclave, el medio debe estar completamente disuelto.
No se debe disolver con la temperatura de la autoclave, generalmente el exceso de calor
produce un medio con grumos debido a una deficiente disolucin.
Los medios de cultivo con yema de huevo, carbohidratos, urea o cualquier nutriente, no
pueden ser esterilizados en autoclave. Estos medios se preparan esterilizando por separado lo
que conocemos como base (se esteriliza en autoclave) y los suplementos por filtracin o vapor
fluente; la mezcla de los componentes se realiza cuando la base se ha enfriado entre 45 y 50
C.
Los medios de agar SS, Bismuto de sulfito y otros no pueden ser esterilizados en autoclave.
Todos los medios de cultivo despus de prepararlos y vertidos en la caja de
Petri, deben ser secados, con la finalidad de eliminar el exceso de agua. Para evitar la
coalescencia y mezcla de las colonias cuando se hace la siembra.

Clasificacin de los medios de cultivos

Slidos: Contienen agar, gelatina o huevo coagulado.
Lquidos: Son los tambin llamados caldos de cultivo.
Selectivos: Poseen sustancias que favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos, ejemplo agar McConkey.
Diferenciales: Son aquellos donde el metabolismo bacteriano produce cambios en el
medio, lo cual permite identificar la bacteria.
Mantenimiento: Son preparaciones utilizadas para conservar cepas de bacterias.
Ejemplo. BAB y agar blanco para enterobacterias.
Medios no selectivos: Permite el desarrollo de diversos tipos de bacterias.
o Ejemplo: caldo nutritivo y agar nutritivo.
Enriquecidos: Contienen sangre, leche, suero, extracto de animales o vegetales. Lo
cual incrementa el nmero de bacterias deseadas. Estos medios de cultivo y su
utilizacin se basan en el aprovechamiento ptimo de nutrientes combinados con
temperatura y pH adecuados. Ejemplo: agar san

Objetivo

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Aplicar tcnicas para la preparacin de los medios de cultivo y reconocer la importancia de sus
componentes para el crecimiento bacteriano.

Materiales y mtodos
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y
nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. Un microorganismo
necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de
sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los
microorganismos se pueden clasificar en auttrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos
que fotosintetizan) y hetertrofos si utilizan carbono orgnico. La frmula elemental de un
microorganismo es, aproximadamente:

C4H7O2N
Lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del
50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (entorno al 1%) y
otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.

1. Preparacin de medios de cultivo caseros: las formulas son las siguientes:

a. Caldo de infusin de carne:
Carne fresca 500 g.
Agua destilada 1L.
Peptona 10 g.
NaCl 5 g.
Coloque la carne en agua destilada toda la noche, luego hierva por media hora, manteniendo
el volumen durante el proceso (adicionando ms agua si es necesario). Enfri, filtre y adicione
la peptona y la sal, caliente para disolver, ajuste pH entre 7.4 y 7.6; esterilice por 15 minutos a
15 libras de presin y 121 C.
b. Caldo nutritivo y Agar nutritivo:
Extracto de carne 3 g.
Peptona 5 g.
Disolver los ingredientes en un litro de agua, calentar hasta ebullicin, luego esterilizar a 121
C durante 15 minutos; en el caso de agar se le adiciona 15 g de agar-agar y se procede de la
misma forma.

c. Preparacin de medios de cultivos vegetales

a. PDA (Papa, dextrosa, agar):
Este medio favorece el crecimiento de hongos, utilizado en el aislamiento de hongos
patgenos y no patgenos de plantas y animales. Contiene:
Caldo de papa 1L.
Dextrosa 20 g.

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Agar 15 g.
Coloque 200 g de papa en 800 ml de agua y lleve hasta ebullicin, filtre mediante una gasa
delgada y posteriormente agregue la dextrosa y el agar, enrase a 1 litro.
b. Agar zanahoria:
Este puede ser preparado de igual forma que la papa. El jugo de zanahoria se usa a menudo en
las mismas proporciones como el extracto de carne y se ha encontrado que es un medio para
el crecimiento y la esporulacin de hongos.
Tome 40-50 g de zanahoria fresca picada en trozos, agregue 800 ml de agua destilada, cocine
la zanahoria hasta que se ablande, decante el lquido y complete hasta 1 litro, agregue 15 g de
agar, caliente y agite constantemente, esterilice en autoclave.
2. Preparacin de medios de cultivos comerciales
Observacin de medios de cultivos deshidratados: Para cada uno de los medios de cultivos
deshidratados o de otros componentes que estn dispuestos en exhibicin, anote los
siguientes datos: Nombre, composicin, usos, preparacin, destape el envase y determine (sin
tocar su contenido): color, olor, textura (cristales, grnulos, polvo).
Prepare 100 ml de agar nutritivo comercial, Siga las instrucciones de la etiqueta del frasco.
Despus de sacarlos de la autoclave deje enfriar hasta 50 C y vierta en caja de Petri cerca de
20 ml, deje enfriar, rotule y guarde en la nevera.
Efectu los clculos para preparar 30 ml de caldo nutritivo, siga las instrucciones de la
etiqueta, vierta porciones de 5ml en tubos de ensayo, rotule esterilice y deje enfriar, luego
guarde en la nevera.
Estos medios se guardarn para ser empleados en la siguiente prctica.

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CUESTIONARIO
1. Para un microorganismo foto auttrofo mencione qu componentes tendra en cuenta para
disear un medio de cultivo qumicamente definido o sinttico que incluye:
Fuente de carbono:
Fuente de energa:
Fuente de nitrgeno:

2. Para un microrganismo quimioorganotrofo qu componentes tendra en cuenta para

disear un medio de cultivo complejo o qumicamente indefinido que incluye:
Fuente de carbono:
Fuente de nitrgeno:
Fuente de energa:

3. Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de cultivo comn para convertirlo
en un medio enriquecido?
- agua destilada
- penicilina
- colorantes
- sangre de oveja
- extracto proteico de cianobacterias
- antispticos
- yema de huevo

- suero fetal bovino

- leche
- sales biliares
- agar

4. Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos quimioorganotrofos,

acidfilos y resistentes a penicilina, incluidos en una poblacin mixta formada por los
grupos A, B y C. Los grupos B y C pertenecen a flora acompaante:
a. Qu medio de cultivo sera ms adecuado para lograr ese propsito? Explique su
respuesta
- un medio de transporte
- un medio enriquecido
- un medio de enriquecimiento
- un medio selectivo
- un medio slo diferencial

b. Disee un medio de cultivo complejo semislido que incluya una fuente de C, una fuente
de energa, una fuente de N y factores fsicos y/o qumicos que favorezcan slo el desarrollo
del grupo A.

Bibliografa:
Madigan, M. T.; Martinko G. M. ; Parker J. Brock, Biologa de los Microorganismos. Ed. Pretice
Hall. 8 edicin. 2004.
Cuervo, R. Manual de protocolos de microbiologa general. Ed Buenaventura 2010. Colombia