Practica N6 Aislamiento Y Purificacin De cido Ribonucleico

Propsito
Desarrollar la habilidad para extraer ARN de hgado de rata.

Marco Terico
Los cidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se encuentran en las clulas,
asociados con protenas forman nucleoprotenas, las cuales pueden separarse al ser tratados con cidos o con
concentraciones altas de sales. Los nucletidos estn unidos por enlaces fosfodister entre las posiciones 3 y 5 de los
azucares.
Se conocen dos grupos principales de los cidos nucleicos: el cido ribonucleico (ARN) y el cido desoxirribonucleicos
(ADN). El ARN tiene una composicin similar al ADN, excepto que tiene una ribosa en lugar de la desoxirribosa y uracilo
en lugar de la timina.
Papel Biolgico De Los cidos Nucleicos
ADN. ntimamente asociado con el material gentico de las clulas, en organismos superiores el
ADN se encuentra formando parte de la nucleoprotena de los cromosomas. Se encuentra casi
exclusivamente en el ncleo y solo en muy copa cantidad en las mitocondrias y los cloroplastos.
La funcin del ADN es almacenar informacin gentica y servir de molde a travs del ARN, para el
ordenamiento de los aminocidos en las protenas.
Replicacin celular. Las caractersticas hereditarias son transmitidas a las clulas hijas a
travs de la replicacin del ADN.
Control de la sntesis de protenas. La secuencia de las bases en el AND nuclear determina
las protenas que se sintetizan en el citoplasma de las clulas (est involucrado en ARN
M
).
ARN. Se distribuye por toda la clula, la mayora del ARN se encuentra en el citoplasma como
ARN
SOLUBLE
y ARN
RIBOSOMAL
, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el ncleo y una poca
cantidad se encuentra en las mitocondrias. Hay tres tipos, participan activamente en la sntesis de
protenas.
ARN Mensajero (ARN
M
). Transcripcin: transferencia del mensaje gentico del ADN al ARN
M
.
Traduccin: con participacin de ARN
T
y ribosomas, las 4 bases nucleotdicas se convierten
en un cdigo de 20 tripletas que llevan la clave del ordenamiento de los aminocidos en las
protenas. Representa el 3% en las clulas eucariotas.
ARN Ribosomal (ARN
R
). Los ribosomas son partculas microscpicas de la clula con una
composicin aproximada de 60% de protenas y 40% de ARN, cuando estas se unen con una
cinta de ARN
M
forma liposomas. Representa el 80% de las clulas eucariotas.
ARN de Transferencia (ARN
T
). Existe un ARN
T
especfico para cada aminocido cuya funcin
es transportar el aminocido activado al lugar de sntesis de la protena. Representa el 15%
en clulas eucariotas.
Universidad Autnoma Del Estado De Mxico
Facultad de Qumica
Bioqumica Metablica
Cynthia E. Enrquez Garca
Reporte 6 Equipo 6
Integrantes:
Raquel Jocelyn Guzmn Rosas
Araceli Denisse Contreras Marmolejo
Alexa Adrian Aguilar
Grupo 52
cidos Nucleicos de Virus. Todos los virus poseen cidos nucleicos, los cuales pueden constituir hasta el 50% de la
partcula. Puede ser ADN o ARN. El cido nucleico est rodeado de una envoltura proteica, responsable de la
especificidad inmunolgica del virus, mientras que el cido nucleico constituye la parte infectante.
Aislamiento de ARN
A diferencia del ADN, el ARN es muy inestable una vez obtenido el tejido, por la presencia de RNasas celulares. Por ello
resulta crtica la congelacin del tejido o su rpida homogeneizacin en la solucin desnaturalizante. Es de fundamental
importancia para una extraccin adecuada, realizar todas las fases rpidamente y evitar la contaminacin por RNasas y
ribonucleasas. Esto se logra tratando las soluciones con agentes alquilantes como el dietil pirocarbonato (DEPC) el cual
inactiva a las RNasas eficaz, pero no absolutamente, puede reaccionar con el ARN, por ello es importante autoclavar las
soluciones para descomponer el DEPC. Para eliminar la degradacin de ARN, hay que desnaturalizar las protenas
celulares con agentes captrpicos, como las sales de guanidio. O bien trabajando con soluciones fras.
Tras el homogeneizado del tejido y la desnaturalizacin del ARN hay que aislar fsicamente el ARN del resto de
componentes celulares. Existen dos procesos fundamentales para realizar esta separacin.
1. Ultracentrifugacin en gradiente de densidad. Basada en la mayor densidad del ARN respecto al resto de los
componentes celulares.
2. Extraccin fenlica. Basada en la propiedad de los cidos nucleicos de ser ms solubles en soluciones acuosas
que en solventes orgnicos.
Separacin de RNA Mediante Extraccin Fenlica
Principio bsico de la desproteinizacin del homogeneizado celular y la eliminacin de los componentes no
hidrosolubles mediante una separacin de fases con distinta solubilidad.
Homogeneizacin del tejido: Las clulas deben ser lisadas por mtodos fsicos.
Accin de fenol y centrifugacin: Se separa en dos fases:
a) Fase orgnica o fenlica: contiene protenas lpidos y
fragmentos celulares varios.
b) Fase superior acuosa: ms densa, contiene polisacridos,
cidos nucleicos y otras pequeas molculas
hidrosolubles.
c) Interfase: queda la mayor parte de las protenas, debido
a su contenido de aminocidos hidroflicos e
hidrosolubles.
Ligera acidificacin del homogeneizado: A pH 5-6 el ADN es selectivamente retenido en la fase orgnica y la
interfase, dejando exclusivamente al ARN en la fase acuosa.
Las siguientes etapas estn destinadas a purificar cada vez ms al ARN mediante precipitaciones a baja temperatura con
alcoholes y centrifugaciones secuenciales, produciendo un pellet cada vez ms libre de contaminantes.
Ratn
Tiene una anatoma muy similar a la nuestra y tenemos un 80% de similitud gentica
con ellos. El hgado contiene 0.430.05g de ARN por cada 100g de tejido hmedo.









Diagrama de Flujo

Colocar un raton con ayuno de
12hrs en un vaso de pp. con un
algodon con cloroformo hasta
que este muerto.
Colocar al raton en una charola
de diseccion, limpiando con un
poco de agua y realizar la
diseccion.
Extraer el higado y colocarlo en
un vaso previamente sumerjido
en hielo y pesar el contenido.
Moler el higado en el mortero
adicionando alicuotas de 5mL
de agua destilada por cada
gramo de higado.
Filtrar con gasa.
En bao de agua a temperatura
ambiente y por 20min, agitar
vigorosamente el filtrado con
un volumen de fenol 90% igual
al adicionado de agua
destilada.
Enfriar la suspension por 5min
en bao de hielo.
Centrifugar a 3000rpm por
15min.
Colocar la fraccion acuosa
superor y capa intermedia en
un tubo y centrifugar a
3000rpm durante 15min.
Decantar y medir el volumen
del sobrenadante obtenido.
Aadir 1mL de KCH
3
COO al 20%
pH 5 por cada 10mL de
sobrenadante.
Enfriar en bao de hielo el
sobrenadante y precipitar el
ARN aadiento 2 volumenes de
etanol absoluto frio.
Centrifugar a 2000rpm durante
5min.
Suspender el pp en
aproximadamente 5mL de
Etanol-Agua (3:1) a
temperatura ambiente y
centrifugar a 2000rpm durante
5 min.
Repetir la adicion de 2
volumenes de etanol absoluto
y la centrifugacion, y despues
realizarla con eter.
Secar al aire y pesar.
Disposicin de Residuos
1. Disponer el cadver del ratn y el slido obtenido del filtrado en bolsa para residuos biolgico infecciosos.
2. La fase fenlica posterior a la centrifugacin disponerla en recipiente F.
3. Las fases etanlica y etrea obtenidas despus de la centrifugacin disponerlas en contenedor A.

Observaciones
El homogeneizado con el fenol presento una coloracin marrn oscura de aspecto lechoso. A la hora de realizar
la centrifugacin, la fase acuosa fue incolora y presento turbidez, la fase orgnica fue marrn oscura y
transparente, y la interfase se distingua claramente como una membrana blanca. Tambin hubo la presencia de
un precipitado marrn-blancuzco.
Al transferir la fase acuosa y centrifugar, hubo un precipitado blanco.
Se agreg 3mL de etanol absoluto frio para precipitar, al hacerlo se presentaron 2 fases, una incolora
transparente superior y otra incolora con turbidez de aspecto gelatinoso.
Al realizar las precipitaciones secuenciales, las paredes del tubo de ensayo se fueron tornando turbias.
Al dejar secar se present un compuesto de aspecto blancuzco y gelatinoso.

Resultados
Se extrajo el hgado de un ratn macho, el cual tuvo un peso de 1g. El ARN obtenido tuvo un peso de 0.00244 g, esto no
representa todo el contenido de ARN, puesto que en la primera centrifugacin se rompi un tubo que contena la mitad
del homogeneizado.

Conclusiones
Puesto que es una experimentacin in vivo, hay que evitar estrs y dolor innecesario, adems de tratar con respeto al
animal.
La extraccin, aislamiento y purificacin de ARN es un procedimiento muy sensible puesta la naturaleza inestable del
ARN y por la presencia de RNasas en el medio, por lo cual es de vital importancia trabajar a temperaturas bajas sino se
cuenta con soluciones tratadas adecuadamente. Tambin resulta muy laborioso por las precipitaciones y
centrifugaciones secuenciales.
A pesar de que el hgado es uno de los rganos con mayor contenido de ARN, se obtiene una cantidad muy pequea,
esto se puede predecir desde el rendimiento terico de 0.430.05g de ARN por cada 100g de hgado.

Cuestionario
1. Calcular el rendimiento de la extraccin de ARN
6.99958 g tubo con ARN
6.999714 g tubo solo
Por cada 100 g de tejido hay 0.43 0.05 g de ARN
6.99958g -6.99714g = 0.00244 g
( ) (


) = 100%

( ) (

)
2. Explicar cul es la funcin de los siguientes reactivos en la prctica Fenol, Etanol absoluto y ter?
Fenol: Se aade un volumen de fenol y, tras una intensa agitacin, se centrifuga la mezcla, dando como resultado la
separacin de dos fases: a) una fase inferior orgnica (fenlica) que contiene lpidos, protenas y fragmentos
subcelulares varios, y b) una fase superior acuosa (menos densa) que contiene polisacridos, cidos nucleicos y otras
pequeas molculas hidrosolubles, quedando la mayor parte de las protenas en la interface debido a su contenido en
aminocidos hidrofbicos e hidroflicos.
Etanol absoluto: Las etapas siguientes estn destinadas a purificar cada vez ms el RNA mediante precipitaciones abaja
temperatura con alcoholes (como etanol e isopropanol) y centrifugaciones secuenciales, produciendo un pellet cada
vez ms libre de contaminantes (polisacridos, sales, etc.).
ter: est destinado a purificar cada vez ms el RNA mediante precipitaciones a baja temperatura y centrifugaciones
secuenciales.
3. Explique qu desventajas tendra el utilizar ratas que no hubieran tenido ayuno?
Los seres vivos al alimentarnos lo que no requerimos en ese momento lo guardamos, el hgado tiene la funcin de
convertir los carbohidratos en glucagn para reserva de energa, entonces al no tener un ayuno el glucagn reservado
interferira en las pruebas de aislamiento de ARN
4. De qu otras fuentes sera posible obtener ARN y que modificaciones hara en la tcnica de identificacin y
aislamiento?
El mtodo elegido vara con arreglo al tipo de tejido y a la
especie particular de ARN que se desea aislar. Con tejidos
animales, a veces es conveniente efectuar un fraccionamiento
preliminar de material nuclear y citoplsmico. El mtodo ms
frecuente en la preparacin de ARN no degradado, con
suficiente rendimiento, est basado en el tratamiento a
temperaturas elevadas (63C) con un detergente para liberar y
desnaturalizar la protena, junto con un disolvente, como el
fenol, para la protena desnaturalizada. La capa acuosa
obtenida despus de centrifugar contiene ARN y polisacridos.
Ambos de precipitan con etanol, pero el ARN puede extraerse
del precipitado con 2-metoxietanol en tampn fosfato. Tras
dilisis, el ARN se vuelve a precipitar con etanol. Hay varias
modificaciones del mtodo del fenol. Las trazas de ADN se
eliminan con DNasa pancretica (purificada y libre de actividad
RNasa).
Mientras que con los mtodos indicados el ARN puede ser extrado directamente a partir de las clulas y posteriormente
fraccionado por cromatografa u otros procedimientos, en ciertas circunstancias es preferible fraccionar el material
celular antes de extraer el ARN para la extraccin selectiva de los tipos de ARN.

Actividades de Integracin
1. Considere lo siguiente con base en el concepto de niveles de estructura (primaria, secundaria, terciaria y
cuaternaria) como se definen para las protenas. Qu nivel muestra el ADN de doble cadena, el ARN
M
y el ARN
T
?
ARN
T
: Posee en algunas zonas estructura secundaria,
lo que va hacer que en las zonas donde no hay bases
complementarias adquieran un aspecto de bucles,
como una hoja de trbol. Los plegamientos se llegan
a hacer tan complejos que adquieren una estructura
terciaria.




1. CONTENIDO DEL ARN EN DIVERSOS ORGANOS DE
COBAYOS
RGANO
NIVEL DEL MAR ALTURA
(g/100g de tejido hmedo)
MEDIA DE MEDIA DE
TESTICULOS 0,31 0,06 0,46 0,04
BAZO 0,51 0,04 0,61 0,06
RIONES 0,40 0,02 0,56 0,07
CORAZON 0,21 0,01 0,23 0,02
HIGADO 0,43 0,05 0,50 0,02
PULMONES 0,30 0,01 0,43 0,04

ADN de doble cadena: Presenta una estructura secundaria
ya que se observa la conformacin espacial de la
estructura primaria.
El ARN
M
: Es una cadena de largo tamao con estructura
primaria.

2. Por qu el ARN es ms vulnerable a la hidrolisis alcalina que el ADN?
Porque sus grupos -OH en el C 2' pueden, en el medio alcalino, perder el protn atacando al mismo tiempo al fosfato en
el C 3' y formando un intermediario fosfato cclico, con lo cual se rompe el fosfodister". "Porque el grupo -OH en el C 2'
favorece la hidrlisis del enlace fosfodister".

Referencias
cidos Nucleicos.
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp08.pdf
Consultado 07/10/2014.
Anlisis Del RNA: Estudio De La Expresin Gentica.
http://www.revistanefrologia.com/revistas/P1-E111/P1-E111-S129-A3434.pdf
Consultado 07/10/2014.
Contenido De ADN, ARN Y Protenas En Diversos rganos De Cobayos Oriundos De La Altura.
http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/farma/article/view/5232
Consultado 07/10/2014.
Anatoma Y Diseccin De Un Ratn
http://melkenenlaciencia.blogspot.mx/2011/03/anatomia-y-diseccion-de-una-rata-raton.html
Consultado 07/10/2014
Ecologa Molecular
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/download/530.pdf
Consultado 14/10/2014
Bioqumica De Los cidos Nucleicos De Davidson Chapman and Hall, London 8
ed
, 1980. Pg.: 49-52.
Estructuras De Los cidos Nucleicos
http://www.maristasgranada.net/webcole/documentos/Ciencias/Bach-
2%BA/Biologia/1_Bioquimica/04_Ac_Nucleicos/ADN_Estructura_1%AA,2%AA,3%AAy4%AA.pdf
Consultado 14/10/2014