Fenol-cloroformo

Fenol-cloroformo (abreviado PC o PCIA, ver reactivos abajo) es una extraccin lquido-lquido en la

tcnica bioqumica . Es ampliamente utilizado en biologa molecular para el aislamiento
de ADN , ARN y protenas . Volmenes iguales de un fenol: cloroformo y se mezcla una muestra
acuosa se mezclan, formando una mezcla bifsica . Este mtodo puede tardar ms de unsistema
basado en columnas , como la purificacin a base de slice, pero tiene una mayor pureza

[ cita requerida ]

la ventaja de una alta recuperacin de ARN: una columna de ARN es normalmente adecuado para la
purificacin de corta duracin (<200 nucletidosARN) especies,
como siRNA , miRNA , gRNA y tRNA . Mtodos de columna tambin cizallamiento fragmentos
grandes de ADN, que puede o no puede ser un problema en funcin de las aplicaciones posteriores.
Fue ideado originalmente por Piotr Chomczynski y Sacchi Nicoletta y publicada en 1987 (referido
como tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo).

[1] [2]

El reactivo utilizado especficamente para la

extraccin de RNA se vende por Sigma-Aldrich por el TRI nombre Reactivo, por Invitrogen bajo el
nombre TRIzol , por Bioline como Trisure y por Tel-Test como STAT-60.

Cmofunciona
Este mtodo se basa en la separacin de fases por centrifugacin de una mezcla de la muestra
acuosa y una solucin que contiene agua saturada con fenol , cloroformo y una solucin caotrpico
desnaturalizante ( tiocianato de guanidinio ), resultando en una fase superior acuosa y una fase
inferior orgnica (principalmente fenol). cido nucleico (ARN, ADN) de las particiones en la fase
acuosa, mientras que las particiones de protenas en fase orgnica. En una ltima etapa, el ARN se
recuper de la fase acuosa mediante precipitacin con 2-propanol o etanol . ADN se encuentra en la
fase acuosa en ausencia de tiocianato de guanidinio y por lo tanto la tcnica se puede utilizar para la
purificacin de ADN solo.
Tiocianato de guanidinio desnaturaliza las protenas, incluyendo las RNasas, y separa rRNA de
protenas ribosomales, mientras fenol , isopropanol y agua son disolventes con una mala
solubilidad. En presencia de cloroformo o BCP ( bromocloropropano ), estos disolventes separar
completamente en dos fases que son reconocidos por su color: una fase clara, acuosa superior (que
contiene los cidos nucleicos) y una fase de rosa brillante inferior (que contiene las protenas
disueltas en fenol y los lpidos se disolvi en cloroformo).Otros productos qumicos desnaturalizantes
tales como 2-mercaptoetanol y sarcosina tambin se pueden usar. La desventaja principal es que el
fenol y cloroformo son ambos materiales peligrosos e inconveniente, y la extraccin es a menudo
laborioso, por lo que en los ltimos aos muchas compaas ahora ofrecen formas alternativas para
aislar el ADN.

Reactivos

Fenol: El fenol usado para bioqumica es en una solucin saturada de agua con tampn de
Tris , tal como un tampn Tris-solucin 50% de fenol, cloroformo al 50%, o como un tamponada
con Tris 50% fenol, cloroformo al 48%, 2% de alcohol isoamlico solucin (a veces llamado
"25:24:1"). El fenol es, naturalmente, algo soluble en agua, y da una interfaz difusa, la cual se
agudiza por la presencia de cloroformo, y el alcohol isoamlico reduce la formacin de
espuma. La mayora de las soluciones tambin tienen un antioxidante, como fenol oxidado
daos a los cidos nucleicos. Para la purificacin del ARN, el pH se mantiene a alrededor de pH
4, que retiene el ARN en la fase acuosa preferentemente. Para la purificacin del ADN, el pH es
generalmente cerca de 7, momento en el que todos los cidos nucleicos se encuentran en la
fase acuosa.

Cloroformo: Cloroformo se estabiliza con pequeas cantidades de amileno o etanol , ya que

la exposicin de cloroformo puro a la luz ultravioleta y oxgeno produce fosgenogas. Algunas
soluciones de cloroformo venir como pre-cloroformo hizo un 96%, 4% de mezcla de alcohol
isoamlico que se puede mezclar con un volumen igual de fenol para obtener la solucin
25:24:1.

Alcohol isoamlico: alcohol isoamlico puede reducir la formacin de espuma y asegurar la

desactivacin de RNasas.

Tiocianato de guanidinio (GITC) es un compuesto qumico utilizado como un desnaturalizante

de protenas en general, ser unagente caotrpico , aunque se usa ms comnmente en la
extraccin de ADN y ARN. [1]
Nota: Este compuesto tambin puede ser reconocida como tiocianato de guanidina. Esto es
porque guanidinio es el cido conjugado de guanidina y se llama el catin de guanidinio ,
[CH 6 N 3] +.
Tiocianato de guanidina se puede usar para desactivar un virus , como el virus de la gripe que
caus el 1918 " gripe espaola ", de modo que pueden ser estudiadas de manera segura. Esta
aplicacin es de suponer que la base de su actividad desnaturalizacin.
Tiocianato de guanidinio se utiliza tambin para lisar las clulas y las partculas de virus en el
ARN y las extracciones de ADN, donde la funcin, adems de su accin de lisis, es evitar que
la actividad de las enzimas RNasa y DNasa mediante la desnaturalizacin de las enzimas
ellos. Estas enzimas de otro modo daar el extracto.
Un mtodo comnmente usado es tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo extraccin . No es
estrictamente necesario el uso de fenol o cloroformo si la extraccin de ARN de transferencia

Northern o un ADN para el anlisis de Southern blot porque la electroforesis en gel seguido de
la transferencia a una membrana se separa el ARN / ADN de las protenas. Adicionalmente,
puesto que estos mtodos utilizan sondas que se unen a sus conjugados, los pptidos que
conseguir a travs del proceso generalmente no importa a menos que un pptido es una
RNasa o DNasa, y slo si la enzima se las arregla para renaturalizar, que no debera ocurrir si
los protocolos adecuados se siguen. Una posible excepcin podra ser cuando se trabaja con
temperaturas extremfilos porque algunas enzimas de estos organismos puede permanecer
estable bajo circunstancias extraordinarias

Agente caotrpico
De Wikipedia, la enciclopedia libre
Saltar a navegacin , bsqueda
Un agente caotrpico es una sustancia que altera la estructura de,
y desnaturaliza , macromolculas tales como protenas y cidos
nucleicos (por ejemplo ADN y ARN ). Solutos caotrpicos aumentar
laentropa del sistema al interferir con las interacciones mediadas por
intramoleculares no covalentes tales como fuerzas de enlaces de
hidrgeno , fuerzas de van der Waals , y los efectos hidrfobos . Estructura
macromolecular y la funcin es dependiente del efecto neto de estas
fuerzas (vase el plegamiento de la protena ), por lo tanto, se deduce que
un aumento de solutos caotrpicos en un sistema biolgico desnaturalizarn
macromolculas, reducir la actividad enzimtica e inducir estrs en una
clula (es decir, una clula tendr que sintetizar protectores de
estrs). Plegamiento de protenas terciaria es dependiente de las fuerzas
hidrfobas de aminocidos en toda la secuencia de la protena. Solutos
caotrpicos disminuir la red efecto hidrfobo de regiones hidrfobas a causa
de un desorden de las molculas de agua adyacentes a la protena. Esta
solubiliza la regin hidrfoba en la solucin, lo que la desnaturalizacin de la
protena. Esto es tambin directamente aplicable a la regin hidrfoba
en bicapas lipdicas , si una concentracin crtica de un soluto
chaotropgnfgnfic se alcanza (en la regin hidrofbica de la bicapa),
entonces la integridad de membrana se ver comprometida, y la clula
se lisan . [1]
Caotrpicos sales que se disocian en solucin ejercer efectos caotrpicos a
travs de diferentes mecanismos. Considerando que los compuestos
caotrpicos tales como etanol interferir con no- covalentesfuerzas
intramoleculares como se indic anteriormente, las sales pueden tener
propiedades caotrpicas por blindaje cargos y prevenir la estabilizacin de
puentes de sal. El enlace de hidrgeno es ms fuerte en medios no polares,
por lo que las sales, que aumentan la polaridad qumica del disolvente ,
tambin pueden desestabilizar el enlace de hidrgeno. Mecansticamente

esto es porque hay molculas de agua insuficientes para

efectivamente solvato los iones. Esto puede resultar en in-dipolo
interacciones entre las sales y especies de enlaces de hidrgeno que son
ms favorables que las normales de enlaces de hidrgeno . [2]