Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

Bioqumica III- 2009

Trabajo Prctico Nro 2 Preparacin de ADN plasmdico y su caracterizacin mediante mapeo de restriccin
INTROD !!I"N El trmino plsmido define un elemento extracromosomal de replicacin autnoma. Sus tamaos pueden variar de 1 a ms de 200 kb. Aun ue su replicacin no est sincroni!ada con la del cromosoma" depende de factores del #ospedador para llevarse a cabo. $os plsmidos no son esenciales para la supervivencia de la bacteria" pero suelen codificar para una amplia variedad de determinantes %enticos ue le permiten sobrevivir en condiciones adversas del medio o competir con otros microor%anismos ue ocupan el mismo nic#o ecol%ico. En la fi%ura se es uemati!an los plsmidos ue se utili!arn el &'. En la misma se sealan los sitios (nicos de restriccin ) los se%mentos de funcionalidad relevante. O#$%TI&O' D%( TP $a finalidad de este &' es purificar plsmidos de cultivos de tres cepas de E.coli, identificadas como )* 2 y + * ue llevan el plsmidos 1" 2 ) +" respectivamente, ) caracteri!arlas estableciendo un mapa de restriccin a fin de ue identifi ue a cual de los mapas *A" - o ., corresponde cada plsmido. Se reali!ar en primer lu%ar la purificacin de los plsmidos *miniprep,. .ada A/0 as1 purificado ser sometido a la accin de diversas endonucleasas de restriccin * ue 2d. propon%a, con el fin de identificar los distintos plsmidos. !ON'ID%RA!ION%' ,%N%RA(%' $os seminarios ) los traba3os experimentales no son entidades independientes del curso. Es importante ue antes, durante y despus del traba3o experimental trate de afirmar los conceptos tericos sobre los ue estn apo)ados las #iptesis de traba3o ) los mtodos utili!ados. $os mtodos ue utili!ar en el traba3o prctico son los de uso corriente en los laboratorios de investi%acin en -iolo%1a 4olecular. El detalle de los procedimientos se encuentra al final de la %u1a. En la primera parte de la %u1a slo se explican los fundamentos ) ob3etivos del &'. Es de suma importancia el comprender ue un aspecto relevante de la experimentacin es lo%rar la reproducibilidad de los datos. Es decir ue adems de la importancia obvia de obtener un resultado" es imprescindible ue se pueda reproducir *o en el peor de los casos" no volver a cometer los mismos errores,. 'ara lo%rar esto es clave contar con un correcto re%istro de lo reali!ado" por lo tanto durante el desarrollo de la clase experimental se debern reali!ar anotaciones de las observaciones )5o posibles modificaciones ue se realicen al procedimiento escrito adems del re%istro de los datos cuantitativos )5o documentos %rficos *fotos,. En definitiva lo ue se pretende es ue cual uier persona ue repita el procedimiento tal como lo describe lle%ue a los mismos resultados obtenidos por 2d *sean buenos o no6,.

Tcnicas Experimentales PART% A -Da ). I. Preparacin de DNA Plasmdico -/0iniprep1.

1, A un tubo de microcentr1fu%a transferir 1"7 ml de cultivo de E. coli ) centrifu%ar a mxima velocidad durante 1 minuto. 2, 8etirar el tubo de la microcentr1fu%a" descartar el sobrenadante invirtiendo el tubo. 9olver a transferir 1"7 ml de cultivo de E. coli ) centrifu%ar en las mismas condiciones. /escartar el sobrenadante ) eliminar los restos de medio de cultivo tomndolos con una pipeta ':200.

+, 8esuspender el pellet en 222 l de 'olucin P). *opcional; $iso!ima 0.7m%5ml de '1, <, A%re%ar +22 l de 'olucin P2 -preparada en el momento. ) me!clar el contenido del tubo cuidadosamente por inversin suave varias veces para permitir una lisis celular suave *no superar los 7 minutos,. En este paso es clave ue los movimientos sean lentos para evitar romper excesivamente las membranas ) el cromosoma. =bserve la lisis bacteriana por desaparicin de la turbide!. 7, A%re%ar +22 l de solucin P+ ) me!clar por inversin suave. >, .entrifu%ar a mxima velocidad durante 10 minutos. ?, 8etirar cuidadosamente el tubo de manera de no perturbar el precipitado. .on una pipeta ':1000 tomar unos 322 l del sobrenadante teniendo muc#o cuidado de no tomar restos celulares precipitados ) pasarlos a un tubo nuevo. *opcional; A%re%ar 1ul de 80asa 1m%5ml" lue%o incubar 7 min a 8&,. @, A%re%ar 2 4ol5menes de etanol o un 4olumen de Isopropanol ) me!clar por inversin. A, .entrifu%ar a mxima velocidad durante 10 minutos. 10, 8etirar cuidadosamente el tubo de la centr1fu%a de manera de no desprender un pe ueo precipitado blanco presente en el fondo del tubo ) descartar el sobrenadante invirtiendo cuidadosamente el tubo. 11, $avar el precipitado a%re%ando unos 622 l de etanol al 627" me!clando un par de veces por inversin tratando de no desprender el precipitado. 12, 8etirar la ma)or1a del alco#ol con a)uda de una ':1000. 1+, /ar un pulso de centr1fu%a para ba3ar los restos de etanol ad#eridos a la superficie del tubo ) retirar el etanol del fondo del tubo con a)uda de una ':200. 1<, /e3ar secar sobre papel durante 7 minutos o 1 minuto a 70B.. 17, 8esuspender en )2 l de a8ua bidestilada est9ril. Soluciones empleadas; 'olucin P): %lucosa 70 m4" solucin de &ris 27 m4 ) E/&A 10 m4" pC @. 'olucin P2: Solucin 0"2 0 de 0a=C ) 1D de S/S preparada en el momento mediante la me!cla de cantidades i%uales de solucin 0"< 0 de 0a=C ) 2 D de S/S. 'olucin P+: Solucin de Actico5Acetato de 'otasio +4. *.onc. Einal 74 Ac:5 +4 FG,.

II. Di8estin con %nzimas de Restriccin;

1, 'repare una me!cla de reaccin ue inclu)a; a, 'lsmido purificado b, 1 l de la en!ima correspondiente. Nunca la retire del <ielo; c, .antidad adecuada de buffer 10H *un dcimo del volumen final de la me!cla de reaccin, d, cantidad adecuada de a%ua bidestilada estril para llevar al volumen final 2, Incube a +? B. 1 #ora.

PART% # -Da 2. III. %lectro=oresis en ,el de A8arosa;

1, 'ese la cantidad adecuada de a%arosa en relacin con el volumen final a preparar ) la concentracin deseada *se recomienda 1"7 D p5v para fra%mentos de entre 0"2 a +"0 kpb" p.e3. fra%mentos de '.8J 1 D p5v para fra%mentos de 0"7 a ?"0 kpb" p.e3. plsmidos o di%estionesJ 0"@ p5v para fra%mentos de 0"@ a 10"0 kpb" p.e3. di%estiones de /0A total,. 2, A%re%ue &-E #asta el volumen deseado +, Eunda en microondas o a bao mar1a #asta ue la a%arosa fundida se vea transparente ) sin %rumos. <, /e3e enfriar #asta ue pueda tomar la botella sin uemarse ) a%re%ue bromuro de etidio #asta una concentracin final de 0"7 %5ml. Esta cantidad se a%re%a desde un stock 10 m%5ml en a%ua. ! IDADO !ON %( #RO0 RO D% %TIDIO: %' !AN!%RI,%NO; PARA 0ANIP (AR(O 'I%0PR% '% , ANT%' D%'!ARTA#(%'; NO TO> % OTRA !O'A ( %,O D% ?A#%R TO!ADO A(,O > % !ONT &I%RA #RO0 RO D% %TIDIO; 'I N%!%'ITA TO!AR OTRA !O'A* > IT%'% %( , ANT% @ R%%0P(A!%(O; 7, 'repare la cama para el %el sellando el soporte de acr1lico con cinta de papel o con tacos de %oma. >, .olo ue el peine cuidando ue uede un espacio de al menos 2 mm entre los dientes ) la cama. ?, 9ierta la a%arosa fundida ) tibia dentro de la cama con el peine colocado. $lene #asta ue la a%arosa ad uiera un espesor de 0"7 cm aproximadamente. @, Espere #asta ue se enfr1e la a%arosa ) solidifi ue. En ese momento" el %el ad uiere una opalescencia blanca. NO TO> % %( ,%(; A, 8etire el peine cuidadosamente para no romper los pocillos. 10, 8etire las cintas de papel o los tacos de %oma utili!ados para sellar la cama. 11, Sumer3a la cama con el %el en la cuba de electroforesis" ue debe contener &-E. $a cantidad de buffer debe cubrir totalmente el %el. 12, 4e!cle las muestras con buffer de siembra <H en una proporcin de + partes de muestra por cada parte de buffer. 9ol(menes ma)ores a 2< l no cabrn en el pocillo de siembra. Inclu)a en una calle al%(n marcador de peso molecular *p.e3. fa%o cortado con HindIII o Eco8I,. 1+, .onecte los electrodos adecuadamente *#acia donde mi%ran los cidos nucleicosK, e inicie la corrida *se recomienda 100:120 volts,. NO TO> % %( # AA%R NI %( ,%( 0I%NTRA' (A ! #A %'TA !ON%!TADA; 1<, El colorante incluido en el buffer de siembra le indicar el frente de corrida. .uando se #a)a despla!ado lo suficiente" desconecte el e uipo de electroforesis" ) retire el %el utili!ando %uantes. 17, =bserve el %el en un transiluminador 29. TI(I!% NA 0A'!ARA PROT%!TORA @A > % (A ( B & P %D% DACAR ' PI%( @ 'O#R% TODO* ' ' R%TINA'; Si cree ue la separacin de las bandas a(n no es suficiente" puede volver a colocar el %el en la cuba ) repetir los pasos 12:1< #asta obtener un resultado satisfactorio. 1>, 8e%istre el resultado mediante una foto%raf1a o un dibu3o a escala.

Preguntas
'ara el aprovec#amiento del traba3o experimental es imprescindible saber exactamente u se est #aciendo en cada momento ) por u. 8ecuerde ue la experiencia de laboratorio es intransferible ) no la encontrar en nin%(n libroJ por lo tanto las oportunidades desaprovec#adas durante el traba3o experimental en el laboratorio dif1cilmente puedan recuperarse con posterioridad en la carrera. Es por ello ue su%erimos resolver el si%uiente cuestionario antes de venir al traba3o experimental. 1, 2, +, <, 7, >, ?, 8) A, 10, 11, 12, 1+, 1<, 17, 1>, LSon esenciales los plsmidos para la supervivencia de la bacteriaK LMu utilidad tienen las distintas partes contenidas en el plsmido %raficado en la fi%uraK LEn u se basa cada uno de los mtodos de extraccin plasm1dica ms #abitualesK LMu mtodos conoce para separar el A/0 del A80 ) las prote1nasK LMu venta3a tiene" para este &' utili!ar una cepa conteniendo un plsmido de alto n(mero de copiasK LMu funcin cumple cada una de las soluciones utili!adas en el &'K L'or u %eneralmente se utili!a isopropanol ) no etanolK Si tiene 10l de una preparacin de A/0 plasm1dico ue se encuentra altamente contaminada con prote1nas; a, LMu #ace para aumentar la pure!a de su preparacinK ) b, L) si adems tiene un alto contenido de salesK LMu es un mapa de restriccinKL.ul es el %rado de precisin con el cual puede construirloK. L/e u dependeK L'uede reali!ar me!clas de di%estin con m(ltiples en!imasK LMu son isoes uismerosK L'or u el procedimiento de purificacin ue emplear en la miniprep le permite obtener A/0 plasm1dico ) no A/0 cromosomalK LMu procedimientos puede emplear para cuantificar el A/0 plasm1dicoK L.mo se obtienen los tamaos *en kpb, en una corrida electroforticaK LMu precauciones deben tomarse para manipular material con bromuro de etidioK LMu precauciones deben tomarse para mirar el resultado de una electroforesis en %el de a%arosaK

(a)II 4548 , 4432 S s pI , 4108 S "aI , pB a

BbeI,235 EheI,235 Kas I,235 NarI,235 HindIII,399 X baI,633 BamHI,662 S a I,669

*a"+ 35S p# ,(

(mp !&r10 3'10 , Eam1105 3625 , s m-K. 1000 K/E* pRTLGFPKDEL

4000

! aI,1002

4621 bps
!# E1
3000

N"#I,1218 pep)id#0 1E% ider0 KpnI,1391 N"#I,1442 E"#$I,1591 X h#I,1596 E"#$%,1691

2000

*a"I p*a"

2E235S pr

S apI 2566 , HindIII 2331 ,

5529 S a pI , ( 4993 7NI , 413 pB a 444' Bs a I , -s 4429 3I , (m p

5000

HindIII,236 . p34I,3'6 . s h(I,693 ! a 4%35S Xba I,899 Nhe I,905

00*a " +

1000

pMonAmh
4000

S pe I,11'8 Nde I,1254 S 5& I,1338 S s e 838',1403 (m h11

5536 bps
2000

4036 S"aI ,

HindIII,16'3 (s p'18,1'91 KpnI,1'91 Bs )XI,1800 S p I,2026 1)hI,2034

! # E1 #ri (a 3596 )II ,

3000

*a *a " I +0 p*a" " N#s 30

66

/ra 3118 III , Ba 3045 nII , N5#4I 3015 , Na 3015 eI , 2816 Na rI , 2816 Ka s I , 2816 Ehe I , 2816 Bbe I ,

Nr3I,22'5 HindIII,2283 Ba I,2335 Bs 336,23'0 Ba m HI,23'5 Ns iI,249' . p310I,249' S m a I,2643 Xm a I,2643

Bs 403' a HI , 39'9 S"aI ,

/ra III,225 Bs a (I,228 Na e I,331 N5#4I,331

(m pi" i in
4000

00*a " +

Ba m HI,'19

Ea m 1105 3496 ,

653 KpnI (pa I Xh#I Hin" II Sa I ! aI HindIII E" #$ % . s )I '0'

pS KA2B1a
4413 bps
3000

1000

! # E1 #ri5in
2000

(2B1a 0

*a " +0 (& 2608 III , 2210 Sa"I , Bs 5I,19'4

(8 rII,1652 S ), I,1652 Bbs I,1'21

21'1 HindIII Ba I Nde I Xba I N#)I S a " II 2202

'