FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

INTRODUCCIÓN

La síntesis de la materia viva es endergónica, es decir que necesita un gasto de energía.

Las levaduras, microorganismos quimiorganótrofos (quimioheterótrofos), obtienen energía por la
degradación de materia orgánica. En función de las condiciones de aerobiosis, las levaduras
pueden degradar los azúcares utilizando dos vías metabólicas: la fermentación y la respiración,
ambos procesos tienen su inicio común en la glicólisis. La sucesión de reacciones que transforman
la glucosa en piruvato con formación de ATP, constituye una vía casi universal en los sistemas
biológicos.

El significado de la palabra fermentación hace referencia a los fenómenos de descomposición

de la materia orgánica (líquido azucarado) con rápido y tumultuoso desprendimiento de gas. Como
síntesis sobre las fermentaciones podemos establecer:
1. Las fermentaciones son reacciones en cadena catalizadas por una serie de enzimas.
2. Las secreciones enzimáticas de las distintas especies microbianas que tienen en común una
fundamental actividad fermentativa presentan una gran diversidad cualitativa y cuantitativa, y a
menudo sucede, aunque en menor medida, entre cepas, variedades o razas de una misma
especie.
3. Los agentes fisicoquímicos del medio influyen notablemente sobre la producción y funcionalidad
de las enzimas microbianas. Por lo tanto, el desarrollo de cada fermentación y el resultado final
pueden ser diferentes tanto por las características fisiológicas de las levaduras como por las
condiciones en que se realice la fermentación.

LAS ENZIMAS

Las enzimas intervienen en los procesos fermentativos catalizando las reacciones

bioquímicas. En la Fermentación Alcohólica (FA) interviene un número importante de enzimas, se
las clasificó en cuatro grupos:
- Fosforilantes, que ligan o separan los radicales fosfato de la molécula orgánica,
- Oxidorreductoras, que intervienen en reacciones de oxidoreducción, transportando
hidrogeniones,
- Carboxilasas, que catalizan reacciones de descarboxilación, con liberación de CO2, y de
carboxilación;
- y el cuarto grupo, integrado por las enzimas que catalizan otras reacciones tales como
mutación, isomerización, enolización, etc.

Para ejercer su actividad catalítica, un cierto número de enzimas necesita de un cofactor

que puede ser: un ion metálico; un grupo prostético sólidamente ligado a la proteína enzimática
o una coenzima que no está ligada a la proteína (o lo está poco) y se comporta como un sustrato
de la reacción. A continuación se describen cuatro cofactores que desempeñan un papel
importante en los mecanismos de las fermentaciones.
Nicotinadenindinucleótido (Nicotinamida adenina dinucleótido) o NAD

Su estructura comprende dos nucleótidos, ligados por una unión pirofosfato.

- -
O O
 
Nicotinamida Ribosa O-P-O-P-O Ribosa Adenina
 
O O
Nucleótido Nucleótido

Interviene como coenzima de diversas deshidrogenasas que catalizan distintas reacciones

de oxidorreducción, fijando de manera reversible dos hidrógenos por medio de su núcleo
nicotinamida.

H CONH2 H H CONH2

-
O OH
| +2H |
R – P – O – R’ R – P – O – R’
|| ||
O O
N+ N
Forma oxidada Forma reducida

En forma abreviada, el mecanismo se representa de la siguiente manera :

+ +
NAD NADH + H , o más simplemente: NAD + 2H NADH2

En esta operación, la sustancia que le cede los hidrógenos (dador) se oxida, y el NAD
reducido, que hace de carrier, se reoxida recién cuando entrega los hidrógenos a otro cuerpo
(aceptor), que a su vez se reduce.

Tiamina pirofosfato (TPP) o Cocarboxilasa

Su estructura es la siguiente:
- -
O O
 
-
Pirimidina Tiasol O-P-O-P-O
 
O O

Es la coenzima de las descarboxilasas de los ácidos -cetónicos según la siguiente

reacción general:

R - CO - COOH R - CHO + CO2

Interviene asimismo en reacciones de condensación (acetoínica y formación de 2-3,

butanodiol) y de carboxilación. Es un transportador de agrupamientos aldehídicos, en especial del
++
acetaldehído. Las reacciones requieren también de otro cofactor, el ion Mg .

1
Adenosina difosfato o ADP y Adenosina trifosfato o ATP

La estructura molecular de los diferentes ésteres de la adenosina es la siguiente :

- - -
O O O
  
-
Adenina Ribosa O-P-O-P-O-P-O
  
O O O

Adenosina monofosfato o AMP

Adenosina difosfato o ADP

Adenosina trifosfato o ATP

Estos cuerpos desempeñan un rol fundamental en los procesos de incorporación y

transferencia de energía. En la molécula de ATP, la tercera molécula de fosfato está ligada a la
precedente por una unión llamada “rica en energía” y la ruptura de este enlace se acompaña de
una liberación de energía. Recíprocamente, se necesita una energía externa para formar el enlace
rico en energía.
Se puede decir que a partir de ADP y de fosfato
mineral, las reacciones químicas que liberan energía
(exergónicas) permiten la formación de moléculas de
Energía ATP que constituyen una forma de almacenamiento de
energía directamente utilizable. Los ATP, única forma
asimilable de energía, se utilizan en las reacciones de
ADP + Fosfato ATP + H O
síntesis y en otras que necesitan energía
(endergónicas), indispensables a los microorganismos
Energía para asegurar sus funciones vitales y en particular su
crecimiento.

Coenzima A

Este cofactor, formado por adenosina difosfato, ácido pantoténico y tioetilamina, en forma
abreviada se representa así: Co-A-SH. Esta notación pone de manifiesto el agrupamiento químico
tiol (SH) que es la base de sus propiedades. Con los ácidos forma las acilcoenzimas A (R-CO-S-
CoA), con gran capacidad de reacción permitiendo la fijación del radical R-CO sobre otras
moléculas. Interviene en numerosas síntesis, en particular bajo la forma de acetilcoenzima A o
acetato activo (CH3 -CO-S-CoA). Es la base de la síntesis de los ácidos grasos (ciclo de los ácidos
tricarboxílicos) y de los lípidos.

2
QUIMISMO DEL PROCESO FERMENTATIVO

En la figura que sigue se observa el desarrollo del proceso fermentativo:

Figura 1: esquema de la fermentación alcohólica

El transporte de hexosas del mosto a través de la membrana, pone en juego un complejo

sistema de transportadores proteicos incompletamente dilucidado. Aunque no se trata de un
transporte activo que requiere de gasto de energía, ya que el movimiento se realiza a favor de un
gradiente de concentración, lo que es energéticamente favorable. Luego la glicólisis se efectúa
enteramente en el citosol de la célula de levadura.

La fermentación alcohólica es una transformación enzimática que, si parte de la glucosa,

tiene 11 reacciones y termina en la producción de etanol y CO2. La transformación de la fructosa o
levulosa tiene una reacción enzimática menos. La primera parte, llamada etapa inductiva,
comprende reacciones de fosforilación, y transfosforilación, mecanismo bioquímico basado en
razones energéticas. El adenosin trifosfato (ATP), compuesto rico en energía, impulsa estas
reacciones y los ésteres formados poseen enlaces ricos en energía. Se pierden dos ATP por mol
de azúcar. La energía que la fructosa-1,6-difosfato tiene acumulada es suficiente para producir la
escisión de la molécula formándose dos triosas isómeras.

Saccharomyces cerevisiae posee dos hexokinasa (PI y PII) capaces de fosforilar la glucosa
y la fructosa. La PII es constitutiva y mayoritariamente se expresa sobre la fase de crecimiento en
un medio rico en azúcar. La PI es parcialmente reprimible por glucosa, sólo se expresaría a partir de
la fase estacionaria (Bisson, 1993).

El segundo estadio de de la glicólisis es la formación del gliceraldehido-3-fosfato y

dihidroxiacetona fosfato, bajo la acción catalítica de una aldolasa. La fructosa-1,6-difosfato está
fragmentada en dos triosas. Aunque en equilibrio la forma cetosa sea más abundante que la
aldosa, la transformación de la dihidroxicetona al gliceraldehído es rápida, pues este compuesto es
eliminado en las siguientes reacciones de la glicólisis.

3
 La tercera fase de la glicólisis incluye dos etapas que intentan recuperar una parte de la
energía del gliceraldehido-3-fosfato. Las moléculas de fosfato pueden dar con ciertos radicales
orgánicos enlaces ricos en energía. Esto ocurre al formarse el ácido 1-3 difosfoglicérico ya que el
+
NAD permite la nueva fosforilación del gliceraldehído-3-fosfato y produce NADH2, que es
necesario en la fase final para pasar el etanal a etanol. Esta reacción está catalizada por la
gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa.

Cuatro ATP vuelven a la levadura cuando el ácido 1-3, difosfoglicérico se convierte en ácido
3, fosfoglicérico y el ácido fosfoenolpirúvico pasa a ácido pirúvico. Por ello, la ganancia neta es de 2
ATP. La fosfogliceromutasa cataliza la conversión del 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato. La
deshidratación de este último, catalizada por una enolasa conduce al fosfoenolpiruvato; este
compuesto posee un alto potencial de transferencia del grupo fosforilo y se forma por fosforilación,
ácido pirúvico y ATP. Con la formación del ácido pirúvico termina la glicólisis que constituye el
primer estadio de la FA. Luego, la piruvato descarboxilasa (cofactor tiamina pirofosfato), transforma
el ácido pirúvico en acetaldehído. Esta es la única fase donde se desprende CO2. Finalmente, el
etanal es reducido a alcohol por la enzima alcohol deshidrogenasa en presencia de NAD reducido.
El etanol es el otro producto principal de la FA.

En resumen, la ganancia neta de la glicólisis es de dos moléculas de ATP por molécula de

hexosa metabolizada. Es en este sentido, marcando el fin del tronco común de la glicólisis que se
diferencian la fermentación alcohólica, la fermentación gliceopirúvica y la respiración.
++ ++
En algunos pasos también se requiere el concurso de algunos cationes como Mg , Zn ,
++ ++ ++ +
Co , Fe , Ca y K .

El poder reductor producido por la glicólisis bajo la forma de NADH, debe ser transferido a
+
un receptor de electrones para regenerar el NAD . En la fermentación alcohólica no es el piruvato
sino su producto de descarboxilación: el acetaldehído es quien sirve de aceptor final de electrones.
Por lo tanto en comparación con la glicólisis, la fermentación alcohólica involucra dos reacciones
enzimáticas suplementarias: la descarboxilación del piruvato y la reducción del acetaldehído
en etanol por el NADH.

FERMENTACION GLICEROPIRUVICA
(FGP)

La fermentación alcohólica incluye exclusivamente la formación de etanol a partir de los

azúcares según la ecuación de Gay-Lussac:

C6 H12 06 2 CH3 - CH2OH + 2 CO2

Pero sabemos que en una vinificación un cierto número de moléculas de azúcar es

degradado por otra vía llamada fermentación gliceropirúvica, que se realiza según la ecuación de
Neuberg, que conduce a cantidades equivalentes de glicerol, CO2 y acetaldehído.

C6 H12 O6 CH2OH - CHOH - CH2OH + CH3 - CO - COOH

Glucosa glicerol ácido pirúvico

Al describir los mecanismos de la fermentación alcohólica se puso en evidencia la

necesidad de la reoxidación del NADH2, formado al comienzo de la fermentación, cuando se
produce la fosforilación de la D-gliceraldehida-3-fosfato. Este NADH2 es necesario para el
paso final de reducción de acetaldehida a alcohol.

Al comienzo de la fase de crecimiento; es decir, al principio de la fermentación, se

encuentran elevados niveles de etanal; pero las concentraciones caen cuando el proceso se
4
inicia "en serio"

5
(Ough, 1994). Cuando las levaduras comienzan a actuar en el mosto de uva, la producción de
etanol no es inmediata, ya que las enzimas esenciales de la fermentación alcohólica, piruvato
decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, son inducibles por la glucosa y no se encuentran en sus
niveles máximos al principio de la fermentación alcohólica. Como consecuencia se forman
numerosos compuestos secundarios además del etanol, tales como: glicerol, piruvato, succinato, y
otros ácidos orgánicos.

Así se explica la existencia de un período de inducción durante el cual la reoxidación del

NADH2 se realiza a expensas de la dihidroxiacetona fosfato que pasa a glicerina-3-fosfato y
finalmente una fosfatasa la transforma en glicerol.

CH2OH CH2 CH2

 OH OH
C= CHOH CHOH
O  
CH2O - P NADH2 NAD CH2O - P H 2O PO4H3 CH2OH

Dihidroxicetona fosfato glicerol – 3 – fosfato glicerol

La cantidad de glicerina que se forma, varía según las condiciones del medio. Aumenta, por
ejemplo, con el aumento de la temperatura de fermentación. Cada vez que se forma una
molécula de glicerina, una molécula de ácido pirúvico (eventualmente descarboxilada formando
etanal) no puede reducirse a alcohol etílico porque los dos hidrógenos necesarios (provenientes
del NADH2) fueron invertidos en la formación de glicerina. Este ácido pirúvico se acumula, o bien
sirve de base para la síntesis de un cierto número de productos secundarios: ácido acético, ácido
succínico, acetoína, 2-3 butanodiol, diacetilo, etc. La figura 2 nos muestra en forma resumida el
desarrollo del proceso. La confrontación de los esquemas de las fermentaciones alcohólica y
gliceropirúvica (figuras 1 y 2) muestra muy bien la competencia entre los dos aceptores de
hidrógeno: acetaldehida y dihidroxiacetona fosfato.

Figura 2. Esquema de la Fermentación Gliceropirúvica.

La acetaldehida es más fácil de reducir y es la que fija preferentemente los hidrógenos del
NADH2 cuando los dos compuestos están en concentraciones equivalentes. Pero si no hay
acetaldehida disponible, lo que ocurre al comienzo de la fermentación como ya se dijo, la
dihidroxiacetona sirve de aceptor de hidrógeno y al mismo tiempo permite la acumulación de
etanal, que servirá para impulsar la fermentación alcohólica.

El vino contiene aproximadamente 8 g/l de glicerina. Se calcula que alrededor del 8 % de

las moléculas de azúcar, siguen la vía de la fermentación gliceropirúvica y el 92% la de la
fermentación
6
alcohólica propiamente dicha. Por lo que es el segundo componente cuantitativamente
más importante del vino después del etanol y que le confiere caracteres de suavidad y
aterciopelado

Interpretación de Oura

La fermentación gliceropirúvica y, en consecuencia, la formación de glicerina, predomina al

principio del desarrollo de la levadura. Pero, se ha comprobado que, aún en plena fermentación,
no hay nunca una fermentación alcohólica pura y la liberación de glicerol persiste hasta el final de
la fermentación. De manera que la explicación anterior no da cuenta de todo el glicerol producido.

Oura, en 1977, ha aportado una explicación diferente que hace intervenir el equilibrio
redox de la célula, que debe estar comprendido entre 0,7 y 0,9.

NAD+ NADH2 NAD+/ NADH2 = 0,7 a 0,9

Durante la fase de crecimiento de la levadura se han verificado variaciones del equilibrio.

Se libera NADH2 excedentario. Para restablecer el equilibrio redox de la célula, este excedente
reducirá una cantidad equivalente de dihidroxiacetona fosfato. En resumen, más que una vía
normal, la producción de glicerina constituye, según Oura, una válvula de seguridad.

LOS PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA FERMENTACIÓN

GLICEROPIRÚVICA

El ácido pirúvico y el etanal, provenientes de la fermentación gliceropirúvica servirán para

formar diversos productos secundarios según mecanismos comunes a muchos tipos de
fermentaciones. Terminada la fermentación, hay una pequeña cantidad de ácido pirúvico en el
vino, aproximadamente 80 mg/l. Es mayor en los vinos blancos que en los tintos y también mayor
cuanto más alta sea la temperatura de fermentación o si ésta ha sido incompleta. Veamos los
principales productos que derivan de él o de la acetaldehída.

Formación de ácido láctico

En la fermentación de los azúcares por la levadura aparece siempre ácido láctico, alrededor
de 400 mg/l (Peynaud, 1967). El ácido pirúvico puede escapar a la acción de la descarboxilasa y
funcionar como aceptor de los hidrógenos del NADH2, reduciéndose a ácido láctico por acción de
la lacticodeshidrogenasa.
COOH

D (-) lácticodeshidrogenasa H-C-OH

NADH2 NAD CH3

COOH ácido D (-) láctico


C=O

CH3

ácido pirúvico COOH

L (+) lácticodeshidrogenasa 
HO-C-H
NADH 2 NAD
CH3
Ácido L ( +) láctico

Figura 3: Formación de los isómeros del ácido láctico a partir del ácido pirúvico

Existen dos isómeros, ácido D (-) láctico y ácido L (+) láctico, formados a partir del ácido
pirúvico por las lacticodeshidrogenasas correspondientes. En anaerobiosis, la levadura
sintetiza sobre todo D (-) lacticodeshidrogenasa. En consecuencia, en el curso de la fermentación
se forma casi exclusivamente ácido D (-) láctico, y solo algunas decenas de mg de ácido L (+)
7
láctico.

8
Ácido succínico

En la fermentación alcohólica siempre se produce ácido succínico, que es uno de

los principales productos secundarios y es el que más impresiona al gusto por su sabor particular
entre salado y amargo, confiriendo especificidad a las bebidas fermentadas.

En condiciones de anaerobiosis, el ciclo del ácido cítrico no puede ser completo, pues la
actividad de la succino-deshidrogenasa necesita la presencia de FAD, coenzima
estrictamente respiratoria. La cadena de respiraciones se interrumpe a nivel de succinato que se
acumula y representa de 0,5 a 1,5 g/L generado por el funcionamiento de esta porción del ciclo de
Krebs.

Además de la vía propuesta por Oura, hay otros mecanismos posibles para su formación.
Sin embargo, según Radler (1977) el ácido succínico proviene esencialmente del ácido -
cetoglutárico, procedente de la desaminación oxidativa del ácido glutámico.

COOH COOH COOH COOH

 NH3   
(CH2 )2 (CH2) CH2 CH2
   
CHNH2 C=O CH2 CH2
 ½ O2  CO2  ½ O2 
COOH COOH CHO COOH
Ácido glutámico ácido -cetoglutárico semialdehída succínica ácido succínico

Reafirmando esta opinión, Radler ha aislado una -cetoglutaratodeshidrogenasa activa de

levaduras desarrolladas en anaerobiosis.

Metabolitos del ciclo diacetilo – acetoínico

Los compuestos acetoínicos (acetoína, diacetilo y 2-3 butanodiol), siempre presentes en el

vino, participan de forma muy directa en las características organolépticas y a determinadas
concentraciones perjudican su bouquet y aroma. Estos compuestos se pueden formar a partir del
ácido pirúvico o del etanal, mediante reacciones de condensación activadas por la Tiamina
Pirofosfato. La carencia de Tiamina, elemento activo de las carboxilasas, disminuye notablemente
la formación de acetoína, diacetilo y butanodioles.

La formación de acetoína, vía piruvato, por la piruvato descarboxilasa, implica una doble
descarboxilacxión. La acetoína formada se reduce en parte por la acción de una deshidrogenasa,
contribuyendo a la formación del 2-3 butanodiol. Otra vía en que interviene el ácido pirúvico para
formar acetoína es por reacción con acetil CoA, dando como compuesto intermedio el diacetilo, del
que una pequeña parte se acumula y el resto se reduce gastando una molécula de NADH2.

Los butanodioles y la acetoína no tienen ninguna importancia sensorial. En cambio

el diacetilo, si está presente en cierta cantidad, más de 3 a 5 mg/l, confiere un gusto indeseable a
manteca rancia, pero no se manifiesta tan desagradable en cantidades próximas al umbral de
percepción

9
Ácido acético

Hasta no hace mucho, la presencia de ácido acético en el vino, junto a otros componentes
de la acidez volátil, era atribuida a alteraciones biológicas de origen bacteriano. Sin embargo se
forma siempre en el curso de la fermentación, siendo este ácido y sus ésteres (acetato de etilo)
elementos negativos en la apreciación sensorial de cualquier vino. Exceptuando la formación de
ácido acético por vía bacteriana, a las levaduras fermentativas de primera fase (Kloeckera,
Candida, Hanseniaspora) y las del metabolismo aerobio (Hansenula y Picchia) se les atribuye el
principal protagonismo en la formación de estos compuestos.

En los mostos de uvas sanas, con moderado tenor de azúcar (220 g/L) Saccharomyces
cerevesiae produce cantidades relativamente bajas (100 – 300 mg/L) pero es variable según la
cepa.
La via bioquímica de la formación de ácido acético no ha sido claramente precisada.
Puede ser producida por hidrólisis de la acetilcoenzima A, proveniente de la descarboxilación
oxidativa del
ácido pirúvico por el complejo de la piruvato deshidrogenasa. Asimismo, la carencia de
ácido pantoténico, componente de la coenzima A, favorece la formación de acético.

El ácido acético puede provenir de la oxidación del acetaldehído por la alcohol

+
desidrogenasa; esta enzima cuyo cofactor es el NADP es activa durante la fermentación
alcohólica. El NADPH formado puede ser utilizado para la síntesis lipídica.

Las condiciones prácticas de la vinificación, pueden conducir a cantidades anormales del

ácido acético. Cuanto más elevado es la riqueza en azúcares del mosto mayor es la cantidad de
ácido acético. Otros factores de vinificación que favorecen la formación de ácido acético son la
10
anaerobiosis, pH muy bajos (- de 3,1) o por el contrario muy altos (mayores de 4), temperaturas
muy elevadas (25 a 30 º C) durante la fase de multiplicación de las levaduras.

11
Otros productos

La levadura produce ácido citramálico (0 – 300 mg/L) y el dimetilglicérico (0 – 600 mg/L),

por condensación del ácido acético (en forma de acetil-CoA) y ácido pirúvico. La incidencia
organoléptica de estos compuestos es desdeñable.

También se originan otros diversos ácidos grasos. Los de 6 a 12 átomos de

carbono presentan aromas lácteos que recuerdan a ciertos quesos. Sus ésteres juegan un papel
muy favorable en el aroma afrutado de los vinos blancos.

OTRAS RUTAS METABÓLICAS

Formación de alcoholes superiores

Los fenómenos bioquímicos de la nutrición nitrogenada de las levaduras comprenden

síntesis y degradaciones diversas. Entre los productos del metabolismo de los aminoácidos, los
alcoholes superiores son los más importantes en Enología, los ácidos cetónicos originados en la
desaminación de los aminoácidos pueden ser excretados luego de la descarboxilación y la
reducción el alcohol.

En efecto, estos constituyentes de los aromas secundarios, intervienen por sí o por sus
ésteres en los caracteres organolépticos del vino. La cantidad de alcoholes que se encuentran en
los vinos varía según las cepas de levadura, la temperatura de fermentación y la cantidad de
nutrientes. Los principales son: isoamílico, isobutílico, n-butanol, n-propanol y tirosol.

Según Erlich (1907) los aminoácidos son los principales precursores de los alcoholes
superiores. Su mecanismo lleva implícitos sucesivos pasos de desaminación, formando un ácido
- cetónico, descarboxilación de éste dando una aldehída y, finalmente, reducción de la aldehída a
un alcohol superior que tiene un carbono menos que el aminoácido que le dio origen.

Estudios posteriores demuestran que los alcoholes superiores (aceite de fusel) se forman
por tres mecanismos diferentes: uno de ellos, lo hace a partir de los aminoácidos presentes en el
medio, posiblemente sintetizados por las mismas levaduras (vía catabólica); en los otros dos, se
forman anabólicamente a partir de la glucosa o levulosa (fermentación alcohólica).

Los tres mecanismos dan como producto intermedio un ácido -cetónico. Estos ácidos
son los verdaderos precursores de los alcoholes superiores y la reacción final es común a los
tres mecanismos.
R
 Descarboxilasa Deshidrogenasa
C=O R R
  
COOH COH CH2OH
Acido -cetónico CO2 Aldehída NADH2 NAD Alcohol

Síntesis de SO2 y SH2

Las células de levaduras tienen necesidad absoluta de azufre, que utilizan en sus procesos
biosintéticos localizándolo en aminoácidos y proteínas y, en menor cantidad, como componente de
12
vitaminas y enzimas (CoA-SH).

13
 A partir del sulfato las levaduras forman SO2 y SH2 en una reacción en que primero lo
reducen a sulfito, requiriendo para ello 2 ATP, y luego a sulfuro. Las levaduras podrían realizar
esta reacción para disponer de sulfuro con el que sintetiza cisteína, serina y metionina.
Normalmente esto sucede solamente cuando los aminoácidos del mosto son insuficientes y, de
hecho, los vinos con bajo contenido de aminoácidos tienen un ligero olor a sulfhídrico. Se puede
evitar este inconveniente añadiendo al mosto compuestos de amonio. La carencia de pantotenato
también origina SH2 que las células excretan.
Formación de otros compuestos volátiles con características aromáticas

Con bastante frecuencia se ha destacado el rol de las levaduras sobre la calidad aromática
de los vinos, poniéndose en evidencia la incidencia de las distintas especies y cepas sobre los
aromas y los precursores de aromas de las uvas.

Además de los alcoholes superiores, otros compuestos volátiles con características

odorantes tienen su origen en la actividad de las levaduras, durante el proceso fermentativo o con
posterioridad a él. Algunos son agradables y eventualmente específicos de un cepaje y otros son
desagradables y constituyen en sí defectos olfativos. Veamos algunos de ellos.

Los vinilfenoles

Entre los numerosos componentes del aroma de los vinos blancos, ciertos fenoles volátiles,
el vinil-4-fenol y el vinil-4-guayacol, presentes en cantidades variables, les confieren olores
“farmacéuticos” desagradables, sobre todo el primero. Los precursores directos de los vinilfenoles
son los ácidos fenoles libres. En la uva madura existe de 2 a 5 veces más en forma de ésteres que
en forma de ácidos libres. Estos ésteres son susceptibles de ser hidrolizados para dar los ácidos
fenoles (hidroxicinámicos) correspondientes. En 1992, se demostró que una esterasa específica,
una cinamil-esterasa, es responsable de esta transformación.

Cinamil – esterasa fermentación alcohólica

 
Ésteres de ácidos fenoles Acidos fenoles Vinilfenoles

Es evidente que el riesgo de que un vino tenga defectos fenólicos es tanto mayor cuanto
más importante sea la concentración de ésteres de ácidos fenoles y la actividad cinamil-esterasa.
La actividad enzimática está presente en la mayoría de las preparaciones pectolíticas comerciales
y su empleo puede conducir a un contenido de vinilfenoles elevado y originar gustos desagradables
en los vinos blancos. Recientemente se han obtenido preparaciones pectolíticas purificadas para
eliminar la actividad cinamil-esterasa y así limitar los contenidos
de vinilfenoles en los vinos, independientemente de la
cepa de levadura utilizada.

Los vinilfenoles provienen esencialmente de la descarboxilación no oxidativa de los ácidos

hidroxicinámicos de la uva y son los ácidos p-cumárico y ferúlico. La Cinamato Descarboxilasa
es endocelular, específica sólo de estos dos ácidos y actúa solamente durante la fermentación.
CO2
OCH3 OCH3

HO CH = CH -COOH HO CH = CH2
Cinamato descarboxilasa
Ácido ferúlico Vinil-4-guayacol
CO2

HO CH = CH - COOH HO CH = CH2
Cinamato descarboxilasa
14
Acido p-cumárico Vinil-4-fenol

15
 En lo que concierne a los vinos tintos, los tenores en vinilfenoles son siempre muy limitados.
Esto se debería a que la actividad descarboxilasa de la levadura es inhibida por ciertos
compuestos fenólicos de la uva, en particular, ciertos taninos catéquicos poco polimerizados. La
mayoría de las cepas de levaduras activas utilizadas en enología poseen la actividad cinamato
descarboxilasa. Trabajos de selección realizados han permitido obtener cepas con baja actividad.

Formación (revelación) de aromas

Una mercaptopentanona (4-mercapto-4-metilpentano-2-ona) ha sido identificada como el

constituyente esencial del aroma de Sauvignon. Este compuesto no existe en el mosto, sino que
aparece en el curso de la fermentación en muy pequeña concentración, lo que supone la
existencia de un precursor aromático del Sauvignon (PAS). Este precursor ha sido aislado de
mosto de Sauvignon y agregado a un medio modelo en fermentación, libera mercaptopentanona.
La aptitud de las cepas de Saccharomyses cerevisiae para revelar el aroma de Sauvignon es
extremadamente variable.

Formación de urea y carbamato de etilo

Los aminoácidos entran en las células de levadura mediante diversas permeasas, una vez
dentro, pueden sintetizar directamente proteínas y otros compuestos. También pueden
transaminarse con ácidos -cetónicos para formar otros aminoácidos. Es interesante el
catabolismo de los aminoácidos, en especial cuando interviene la arginina. Las levaduras,
mediante la arginasa dan lugar a la formación de ornitina y urea y la urea puede ser transformada
en amoniaco y CO2.
Esta reacción es importante por otras razones. La pequeña cantidad de urea que existe en
el
citosol de la célula puede ser transportada por las permeasas y difundirse en el vino. Y la urea,
en cantidades significativas, puede transformarse en un producto tóxico como es el carbamato de
etilo,
dependiendo de la temperatura, el pH y la concentración de etanol.

NH2 O
 
C = O + C2H5 -OH C- 0 - C2H5 + NH3
 
NH2 NH2

Úrea Etanol Carbamato de etilo

16
BALANCE QUÍMICO DE LA FERMENTACIÓN

Los productos principales de la fermentación del mosto de uva son el alcohol etílico y el
anhídrido carbónico y se originan de la fermentación alcohólica. Junto a estos, aparecen, otros
muchos compuestos, llamados productos secundarios, formados como consecuencia de la
fermentación gliceropirúvica y otros procesos colaterales de la fermentación alcohólica.

Balances fermentativos

Lavoisier fue el primero en establecer un balance de los productos de la fermentación

alcohólica. Sirviéndose de la balanza demostró en 1789 que durante la fermentación el azúcar es
descompuesto en alcohol y anhídrido carbónico.
Gay-Lussac, en 1813, representó el proceso fermentativo mediante su famosa ecuación.

C6H12O6 2 CH3 -CH2OH + 2 CO2

Más tarde (1819), elaboró una fórmula matemática de la reacción:

Azúcar alcohol + gas carbónico

100 g 51,84 g 48,16 g

Pasteur estableció que la ecuación de Gay-Lussac es válida para el 90 % del

azúcar transformado. El resto lo forman otras sustancias como la glicerina y el ácido succínico, que
él mismo descubrió como productos de la fermentación. En 1860, nos da un balance de la
fermentación de 100 g. de sacarosa, que al hidrolizarse forman 105,4 g. de azúcar invertido
(glucosa + levulosa):

Alcohol....................................... 51,1 g.
Anhídrido carbónico................... 49,4 g.
Glicerina..................................... 3,2 g.
Acido succínico.......................... 0,7 g.
Consumido por las levaduras.... 1,0 g.

total 105,4 g.

Con el correr de los años, otros productos de la fermentación han sido identificados: ácido
acético (Bechamp, 1863), 2-3- butanodiol (Henninger, 1882), ácido láctico (Peynaud, 1946), ácido
butírico y acetona (Bertrand y Ribereau-Gayón, 1968), ácido pirúvico (Blouin y Peynaud, 1963),
ácido oxaloacético (Carles y otros, 1967), ácido propiónico, ácido citramálico o metilmálico (Carles
y otros,
1958), ácido dimetilglicérico (Carles y otros, 1966), diacetilo, acetoína o
acetilmetilcarbinol, acetaldehida.

Farkas (1988) sugiere que alrededor del 10-12 % del azúcar presente es desviado a
biomasa de levaduras y productos secundarios. Varios autores contemporáneos han presentado
balances fermentativos (Garoglio, Amerine y Joslyn, Peynaud y otros), pero siempre algún otro
producto secundario ha sido identificado a posteriori. A continuación, se transcribeel
balance de la fermentación de 170 g. de
azúcar, presentado por Peynaud en 1976. Las cantidades medias se expresan en miligramos.

Alcohol etílico................ 80.000 Acido citramálico......... 80

Anhídrido carbónico...... 76.000 Acetaldehida................ 80
Glicerina........................ 6.000 Acido pirúvico............... 60
Acido succínico............. 1.800 Acido a-cetoglutárico... 40
2-3 Butanodiol............... 400 Acetato de etilo............ 40
Acido acético................. 300 Acetoína....................... 10
17
Acido láctico.................. 300 Levadura seca.............. 2.000
Alcoholes superiores..... 300

18
Rendimiento en alcohol

De acuerdo al balance de Peynaud, 170 g de azúcar producen 80 g de etanol, o sea 100,8

ml
(la densidad a 15º C es de 0,7936).
Para producir un grado de alcohol (un ml de alcohol absoluto en 100 ml de vino, o lo que es
lo mismo 10 ml/l), se necesitan 16,864 g de azúcar [( 170 x 10) / 100,8]. Este rendimiento es muy
difícil de alcanzar a nivel industrial. Esto se debe a que:

1. Ordinariamente se produce una mayor multiplicación de levaduras y, consecuentemente,

un mayor consumo de azúcar para la formación del cuerpo celular.
2. A veces, hay una mayor formación de productos secundarios como consecuencia de la
presencia de otros microorganismos.
3. Se verifican pérdidas de alcohol durante la fermentación debido al calentamiento y otras
causas como el fulado, los remontajes, etc.

En la práctica, se calcula que para producir un grado alcohólico se necesitan 17 g de

azúcar, índice adoptado por algunos países como Francia y aceptado por la Organización
Internacional de la Vid y el Vino (O.I.V.). En nuestro país, fundado en estudios técnicos que
contemplan las características de nuestra industria y modalidades de trabajo, se ha establecido
legalmente un rendimiento máximo de 17,5 g de azúcar para producir un grado de alcohol.

Producción de anhídrido carbónico

La cantidad de anhídrido carbónico que se produce es enorme. De acuerdo al balance de

Peynaud, 170 g de azúcar producen 76 g de CO2, que a 0ºC y 760 mm. de presión ocupan un
volumen de 38,442 l. (un litro de CO2, medido a 0ºC y 760 mm. de presión pesa 1,977 g).
Supongamos un mosto de 12º Bé (210 g/l de azúcar). Un hectólitro que fermenta desprende
4750 litros de a CO2 que se incorporan al ambiente y que, de no tener el local de fermentación las
condiciones adecuadas para evacuarlos, entrañan un peligro cierto para las personas que trabajan
allí.
El mosto en fermentación esta saturado de anhídrido carbónico. La cantidad depende de
la temperatura, la presión y el grado alcohólico. Cuando termina la fermentación el CO2
tiende a
desprenderse del vino, favorecido por el trasiego y otras operaciones y movimientos.
Un detalle importante es el arrastre de alcohol producido por el desprendimiento del
anhídrido carbónico. Se ha intentado recuperar el alcohol (Bremond, 1950; Furlotti, 1967), pero
también se ha
hecho notar que el valor del alcohol recuperado no compensa los gastos que exige la operación.
Con
más criterio se ha insistido en mejorar las condiciones de elaboración (temperaturas de
fermentación, operaciones tecnológicas, etc.) para reducir al mínimo las pérdidas de alcohol.
El anhídrido carbónico de la fermentación ha sido utilizado para la gasificación de los
vinos
(Carpené) y también para inertizar las maquinarias utilizadas en el procesamiento de la uva para
la obtención del mosto (moledoras, escurridores, prensas).

ENERGESIS: BALANCE ENERGETICO DE LA FERMENTACION ALCOHÓLICA

El balance químico de la fermentación alcohólica pura, se expresa así:

C6H12O6 + 2 ADP + 2 H3PO4 2 CH3 - CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP

En el plano energético, la variación total de energía es de 40 kcal/mol de hexosa (Conn y

Stumpf, 1972). De las 40 kcal, 14,6 corresponden a los 2 ATP formados (la formación de una
unión ATP demanda 7,3 kcal), única forma de energía "biológicamente asimilable", que son
19
utilizados por las células de levaduras para asegurar sus funciones vitales, en particular su
multiplicación. La diferencia, o sea 25,4 kcal, constituye la energía libre que se incorpora al medio
en forma de calor y provoca el calentamiento del mosto en fermentación.
No toda la energía libre se resuelve en un aumento de la temperatura. En un sistema
absolutamente cerrado (aislado térmicamente) la temperatura aumentaría 25,4ºC; pero en
la

20
industria, el aumento de la temperatura esta regulada por la relación entre dos factores: la tasa de
fermentación (depende de la energía fermentativa de la levadura, temperatura de fermentación,
número de células, contenido de azúcar, contenido de alcohol) y la disipación de la temperatura al
medio externo.
La disipación de la temperatura depende tanto de las características constructivas de
la vasija: material (coeficiente de conductividad térmica), espesor de las paredes, tamaño y
forma
(relación superficie/volumen), individualidad (paredes compartidas o no); como de la temperatura
y
ventilación del cuerpo de fermentación. También influye, aunque en menor medida, el sistema de
vinificación y el calor latente de vaporización de sustancias volátiles que se desprenden junto con
el anhídrido carbónico.
En definitiva, para nuestras condiciones de vinificación sólo unas 15 kcal se resuelven en
un aumento de la temperatura, el resto se disipa. De cualquier modo, se debe recurrir a
refrigeraciones
oportunas para mantener el mosto en fermentación dentro del rango de temperatura adecuado,
según el sistema de vinificación. De ahí la importancia de disponer de suficiente capacidad
de
refrigeración para manejar eficientemente la temperatura de fermentación, aún en la peor situación
imaginable. Si las vasijas "escapan" y se tornan muy calientes, el control es difícil, sino imposible, y
la
calidad del vino
sufre.

FENOMENOS FISICOS QUE SE PRODUCEN EN LA

FERMENTACION

Mientras se suceden los fenómenos bioquímicos ligados a la fermentación alcohólica y el

mosto va transformándose en vino, se observan los siguientes fenómenos físicos: disminución de
la densidad, producción de calor, disminución del volumen y precipitaciones.

Disminución de la densidad

La densidad del mosto de uva oscila normalmente entre 1,090 y 1,110 y

depende fundamentalmente del tenor azucarino.
El mosto de uva madura contiene normalmente entre el 15 y 25 % de hexosas (glucosa
y levulosa) y a veces más en uvas sobremaduras o donde es habitual la podredumbre noble
producida
por Botrytis cinerea. De ahí que la densidad oscile entre 1,080 y 1,110, ya que los azucares por
sí
mismo tienen una densidad próxima a 1,613.
Al producirse la fermentación el azúcar va transformándose en alcohol etílico como
producto principal, cuya densidad a 15ºC es de 0,7936. Esto hace que la densidad vaya
disminuyendo a
medida que avanza la fermentación.
El vino que ha fermentado totalmente, debido al contenido de alcohol tiene una
densidad menor que 1; tanto más bajo cuanto más rico en azúcar era el mosto y, por lo
tanto, mayor la
cantidad de alcohol producida.
En un vino que no ha terminado de fermentar, la densidad será de 1 o más, tanto más
alto cuanto mayor sea la cantidad de azúcar residual.

Disminución del volumen

El volumen del vino producido es inferior al del mosto que le dio origen. Esto se debe a las
siguientes causas: el fenómeno de contracción de la mezcla alcohol-agua, pérdidas por el
desprendimiento del CO2 y el arrastre de algunas sustancias volátiles (alcohol y otras) y21
las precipitaciones de sales tartáricas.
Para un vino de 12,5 % v/v, considerando que el coeficiente de contracción es de 0,07 por 1
% de alcohol, la disminución de volumen será de 0,875 ml. cada 100 ml. (12,5 x 0,07).
Las pérdidas atribuidas al anhídrido carbónico (desprendimiento y arrastre) sumadas a las
precipitaciones, superan ligeramente el 1 %. Sumadas a la disminución de volumen debida a
la
contracción nos da un volumen de vino inferior al 2 % aproximadamente, con relación al del
mosto
original.

22
Producción de calor

Como hemos visto al tratar el balance energético de la fermentación alcohólica, 25,4 kcal
se incorporan al medio en forma de calor provocando el calentamiento del mosto. Pero debido a
las causas que ya hemos analizado, se pierden unas 10 kcal.
Existe un coeficiente práctico, de uso generalizado en nuestro medio, que permite calcular
rápidamente el aumento de temperatura que podría esperarse: 1,4ºC por cada grado Baumé.
Desde el punto de vista práctico, se observa que un mosto que tiene 12,5ºBé, por efecto de
la fermentación aumentaría su temperatura en 17,5ºC (12,5 x 1,4). En consecuencia, si la
temperatura
de campo fuese de 25ºC, llegaría teóricamente a una temperatura de 42,5ºC, lo que haría
imposible la vida del fermento.
Es necesario entonces intervenir mediante los medios enotécnicos adecuados en el
control
de la temperatura. Al tratar el tema de las operaciones comunes a todas las vinificaciones,
veremos en detalle los sistemas de refrigeración.

Precipitaciones

Las precipitaciones más corrientes en el pasaje de mosto a vino, son el tartrato neutro
de calcio y el bitartrato de potasio o cremor tártaro.
El mosto de uva constituye una solución saturada de bitartrato de potasio. La solubilidad
de
esta sal depende de la temperatura, a mayor temperatura aumenta la solubilidad, y del contenido
de alcohol que hace que la solubilidad disminuya. Al avanzar la fermentación se va acumulando
alcohol etílico y, consecuentemente, disminuye la solubilidad del bitartrato. El exceso de soluto
precipita, depositándose en las paredes y el fondo de la vasija de fermentación.
Por efectos del alcohol, también se insolubilizan en parte las gomas y mucílagos.

23
INFLUENCIA DEL MEDIO Y DE LAS EXIGENCIAS TECNOLOGICAS SOBRE
LAS LEVADURAS

Condiciones para el desarrollo de las levaduras

Temperatura: La temperatura óptima se sitúa entre 18 y 30 ºC. Con menos de

10 ºC la fermentación no empieza y si supera los 35 ºC, se detiene. La velocidad de
transformación de azúcar, crece con la temperatura. A medida que la temperatura es
más elevada, la entrada en fermentación es más rápida, pero el grado alcohólico
obtenido es menor.

Con respecto a los nutrientes: Los mostos están bien provistos de los azúcares
y minerales que necesitan las levaduras, no así de sustancias nitrogenadas. Las
levaduras necesitan nitrógeno amoniacal. Un mosto en fermentación queda
desprovisto de nitrógeno amoniacal en 36 horas. En vinificaciones en blanco hay que
recurrir al agregado de nutrientes a base de sales de amonio, que se agregan dentro
de las 48 horas de iniciada la fermentación por medio de un remontaje. También
puede requerirse un suplemento vitamínico, como Tiamina y Pantotenato (50 mg/hL).
Existen mezclas de nutrientes en el mercado que además traen cáscaras de levaduras
que sirven para absorber toxinas.

La acidez no influye en el desarrollo de las levaduras, ya que son resistentes;

pero una alta acidez impide una multiplicación peligrosa de bacterias en caso de que
la fermentación alcohólica se detenga.

En el mosto, las levaduras encuentran los constituyentes que les son necesarios
para asegurar sus funciones vitales. Entre ellos, se encuentran los hidratos de carbono,
los ácidos orgánicos, sales minerales, pH, constituyentes nitrogenados y factores de
6
crecimiento y supervivencia. De manera general, con una correcta inoculación (10
cél/mL) la fermentación se inicia rápidamente y llega a su término. Por lo tanto, el
correcto desenvolvimiento de la fermentación alcohólica, y en consecuencia, la
calidad del vino resultante, dependen de numerosas variables; algunas de naturaleza
química, otras están referidos a carencias nutricionales y a la presencia de inhibidores.
Estos factores se podrían clasificar en tres grupos: a. la composición del mosto:
concentración de azúcares, acidez, disponibilidad de nutrientes y factores de
crecimiento y el contenido en sustancias fenólicas; b. la microbiota y c. las condiciones
operativas.

Un perfecto manejo de la fermentación es una de las primeras funciones del

enólogo. Los problemas de fermentación han constituido serios obstáculos técnicos
para el normal desarrollo del proceso de vinificación; entre ellos están: comienzos de
fermentación tardíos, fermentaciones "languidecientes", detenciones de la
fermentación antes del agotamiento completo del azúcar. Una interrupción de la
fermentación constituye un peligro grave, no solamente para la dificultad de reiniciarla,
sino también porque en tal situación puede temerse que ocurran desviaciones
bacterianas que provocarían un aumento de la acidez volátil, deteriorando la calidad
del producto final.

Para comprender la explicación de estos fenómenos es necesario considerar la

fermentación bajo su aspecto biológico. La fermentación alcohólica no es solamente un
balance analítico en el que figura la equivalencia entre el peso de azúcar degradado y
la suma de productos principales y secundarios. Esencialmente, la fermentación es la
24
consecuencia del conjunto de actividades bioquímicas por las que la levadura se
procura la energía necesaria para la biosíntesis de la sustancia celular, asegurando la
edificación

25
de su esqueleto carbonado, su multiplicación, su conservación, es decir, el conjunto
de sus funciones vitales.

Asimismo, el mosto de uva presenta una constitución diferente según el cepaje,

el suelo y las condiciones climáticas del año. Su composición se encuentra
también fuertemente condicionada por las modalidades tecnológicas; tanto en lo que
se refiere al manejo del viñedo, al cultivo y al momento de recolección de los frutos,
como a la obtención y tratamientos del mosto, todas ellas variables en función del tipo
de vino deseado. También las técnicas y condiciones en que se realiza la vinificación
condicionan el desarrollo y actividad de las levaduras.

La influencia del medio y de las exigencias tecnológicas se manifiesta sobre el

crecimiento y el metabolismo de las levaduras.

CONTROL DE LA FERMENTACIÓN

Ciclo de crecimiento de las levaduras y cinética de fermentación

En el desarrollo normal de una fermentación alcohólica el ciclo muestra tres
fases principales. La primera, de crecimiento limitado de 2 a 5 días en que aumenta la
7 8 -1
población progresivamente hasta un valor comprendido entre 10 – 10 células ml .
La segunda fase es cuasi estacionaria y dura alrededor de ocho días. Por último la fase
5
de declinación donde se reduce progresivamente la población viable hasta 10 células
-1
ml , esta fase puede durar muchas semanas. Durante ese ciclo, particularmente
largo, el crecimiento está limitado a cuatro o cinco generaciones. Existe una
desproporción entre la duración de las diferentes fses, en particular la fase de
declinación que es de tres a cuatro veces más larga que la de crecimiento.

La cinética de fermentación está ligada directamente al ciclo de crecimiento. La

velocidad de fermentación es máxima y prácticamente constante durante un poco más
de 10 días, correspondiendo a las dos primeras fases del crecimiento. Luego
disminuye cada vez más, pero se prolonga durante varias semanas, las levaduras en
ese momento se encuentran en una fase de supervivencia. Finalmente, la detención
en la fermentación se da por crecimiento insuficiente y por una inhibición de la
actividad metabólica de las células no proliferantes.

La detención del crecimiento no es consecuencia de la desaparición del alimento

energético, sino que la paralización de la actividad metabólica ha sido interpretada por
la desaparición del ATP celular, por la acumulación de etanol en la célula o más
probablemente por las dificultades del transporte a través de la membrana, causando
la desaparición de los esteroles celulares. Se observa que los sistemas enzimáticos de
la célula funcionan siempre, pero que la concentración de azúcar decrece
progresivamente dentro de la célula.

La disminución y la interrupción de la fermentación pueden ser provocadas por

una temperatura excesiva.

Vigilar la marcha de la fermentación es una necesidad que permite seguir las

transformaciones, prever su evolución e intervenir a tiempo de ser necesario. Dos
controles deben efectuarse diariamente: el seguimiento de la fermentación y la
medición de la temperatura.

Las levaduras viables pueden ser enumeradas al microscopio directamente por

el recuento en cámara de Neubauer con la ayuda de tinción vital. También puede
utilizarse la técnica de epifluorescencia y, en algunos casos, la estimación del ATP.
26
Regulación fermentación - respiración
Pasteur fue el primero en comparar el crecimiento de las levaduras en
aerobiosis y anaerobiosis, y en constatar una inhibición de la fermentación por
respiración. Cuando la levadura puede utilizar los azúcares indiferentemente por
respiración o fermentación (lo que sólo es posible en bajas concentraciones de
glucosa), la aireación induce a un aumento en la cantidad de biomasa, a una
disminución en la producción de etanol y del consumo de azúcar.

El fenómeno por el que la respiración que inhibe a la fermentación, también

llamado “Efecto Pasteur”, recibió muchas interpretaciones. Puede explicarse por la
competencia entre dos enzimas catalizadoras. La piruvato descarboxilasa, implicada
en la vía fermentativa, presenta frente al piruvato una afinidad muy inferior a la
piruvato deshidrogenasa. Pero, la mejor explicación del efecto es la inhibición por ATP
de las enzimas de la glicólisis. El ATP surgido de la fosforilación oxidativa inhibe en
particular a la fosfofructoquinasa, lo que trae aparejado una acumulación de hexosas
fosforiladas, una disminución en el transporte de los azúcares a través de la
membrana y en consecuencia de la glicólisis.

Cuando la concentración de azúcares es elevada, como en el caso del mosto de

uva, Saccharomyces cerevisiae sólo metaboliza los azúcares por vía fermentaria,
incluso en presencia de oxígeno la respiración es imposible. Esto se denomina
“Represión catabólica de la glucosa” o “contraefecto Pasteur”, en donde las levaduras
presentan un degeneramiento de las mitocondrias, una disminución de la tasa de
esteroles y de ácidos grasos celulares y una represión de las enzimas del Ciclo de
Krebs. Este efecto se manifiesta a partir de los 9 g/L. En el mosto, cualesquiera que
sean las condiciones de aireación la levadura está obligada a fermentar. La aireación
del mosto favorece la fermentación alcohólica desde el punto de vista de la síntesis de
ácidos grasos y esteroles por las levaduras.

Incidencia de la aireación del mosto sobre la fermentación

Experiencias clásicas muestran que en fermentaciones conducidas con aireación

permanente, las poblaciones levadurianas máximas en el mosto de uva son duplicadas
y la fermentación es más rápida y más completa que en anaerobiosis.

Este hecho, que no puede explicarse por el efecto glucosa, ha encontrado una
aplicación tecnológica en la práctica de los remontajes en la vinificación en tinto. El
remontaje consiste en tomar el mosto en fermentación y "remontarlo" por bombeo
sobre el orujo, lo que equivale a una aireación.

Practicado al tercer día de la fermentación espontánea del mosto, es decir

cuando interviene sobre una población levaduriana ya importante (pero siempre en
fase de crecimiento), el remontaje permite desarrollar la actividad máxima con una
velocidad fermentaria comparable a la de un mosto que fermenta en aerobiosis
permanente. Practicado el octavo día o después, es decir sobre una población menos
densa y estacionaria o en vía de declinación, se vuelve prácticamente ineficaz.

Necesidades nutritivas

Alimentación carbonada

27
 La levadura encuentra en el mosto de uva, la glucosa y la fructosa que le sirven
como fuentes de carbono y de alimentos energéticos. No queda excluido que la

28
riqueza del mosto en azúcar influye en la selección de cepas de levaduras que
aseguran la marcha de la fermentación. Este proceso es lento en un medio que
contiene unos pocos gramos de azúcar por litro; su velocidad aumenta hasta 15 – 20
g/L, luego se estabiliza alrededor de 200 g/L. Por encima de esta cifra la fermentación
disminuye y finalmente la producción de alcohol puede ser más escasa en mostos que
contengan cerca de los 300 g/L. Por lo tanto, una concentración de azúcar elevada,
afecta al crecimiento de la levadura y disminuye la población máxima; en
consecuencia, la fermentación se reduce, incluso antes de la aparición de una
cantidad significativa de etanol que agrega su efecto antiséptico.

Alimentación nitrogenada

La levadura encuentra en el mosto la alimentación nitrogenada necesaria para su

crecimiento. El catión amonio es particularmente asimilable y puede satisfacer él
mismo la síntesis de aminoácidos. Los polipéptidos y las proteínas no participan del
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ya que no tiene la propiedad de
hidrolizarlos, y tampoco tiene necesidad absoluta de recibir aminoácidos en su
alimentación nitrogenada, pues es capaz de sintetizarlos individualmente. Sin
embargo, su adición presenta un efecto estimulante. Existen tres mecanismos para la
utilización de aminoácido por la levadura:

1. Integración directa, sin modificaciones en las proteínas.

2. Descomposición del grupo aminado que es utilizado por la biosíntesis de los

diferentes constituyentes nitrogenados y la cadena carbonada es excretada. (ver
formación de alcoholes superiores).

3. Las moléculas de aminoácidos pueden ser utilizadas como fuente de carbono en las
reacciones del metabolismo. Simultáneamente la levadura recupera el nitrógeno
amoniacal correspondiente.

La asimilación de los diferentes aminoácidos depende del funcionamiento de los

sistemas de transporte y de la regulación de los sistemas metabólicos. Aunque las
mezclas complejas de sales de amonio y de aminoácidos poseen una eficacia máxima,
tanto en el crecimiento de la levadura como en la velocidad de fermentación, por
razones de simplicidad el enriquecimiento de mostos en alimento nitrogenado se hace
exclusivamente con sales de amonio. La riqueza del mosto inicial en catión amonio es
uno de los elementos más importantes a tener en cuenta para fijar la oportunidad de
+
un enriquecimiento. Se pudo estimar su necesidad cuando el tenor de NH4 es inferior
a 25mg/L.

Con aportes excesivos, se puede temer, al término de la fermentación la presencia

de amonio residual no asimilado. También hay que considerar que un exceso de
nitrógeno amoniacal puede ocasionar una modificación en los caracteres aromáticos
del vino, ya que la levadura no teniendo la necesidad de desaminar los aminoácidos,
forma menos productos secundarios. Por último, la alimentación nitrogenada implica
la formación de carbamato de etilo, el que por sus propiedades cancerígenas es un
constituyente no deseado y controlado por diferentes legislaciones.

En lo que respecta a las condiciones de empleo de sales de amonio, el momento de

su adición parece importante. Se sugiere hacer este agregado en el mosto antes de
iniciarse la fermentación, tomando en cuenta la mejor reacción de la levadura a toda
intervención en fase de crecimiento; en un medio con poco etanol pareciera mejorar
29
la asimilación.

30
Factores de supervivencia
La noción de factores de supervivencia resulta de la interpretación del modo de
acción de los estores y de algunos ácidos grasos de cadena larga sobre la actividad de
las levaduras y la marcha de la fermentación.

En estudios realizados en medio de cultivo sintético, adicionado de ergoesterol

solubilizado en el tween 80 (ester de oleato), se pudieron obtener poblaciones de
levaduras muy importantes en anaerobiosis estricta en el curso de cultivos sucesivos
durante más de 5 meses. A título de ejemplo: en un mosto rico en azúcar (260 g/L)
S. cerevisiae fermenta en 10 días 175 g/L de azúcar y 258 g/L cuando el mosto se
encontraba adicionado con 5 mg/L de ergosterol. Contrariamente en aerobiosis, se
observa un leve efecto inhibidor. Se demuestra así, que estas sustancias son
indispensables para las levaduras que se desarrollan al abrigo total del aire, porque en
esas condiciones no tiene la posibilidad de sintetizarlos; la presencia de esteroles es
necesaria para asegurar la permeabillidad de las membranas.

Por otra parte, el 6% en peso seco de la membrana citoplasmática está

constituido por esteroles; podrían por lo tanto intervenir en el control de la
permeabilidad de la membrana. Los principales esteroles de la levadura son el
ergoesterol y el 24(28) dehidroergoesterol. Los esteroles aportados al medio de cultivo
de las levaduras que se desarrollan en anaerobiosis permiten paliar la ausencia de
oxígeno, de alguna manera, el ergosterol, es para la levadura un sustituto del oxígeno.

El rol funcional de los esteroles ha sido precisado recientemente. Los esteroles

según resultados de Cobon (1973) favorecerían el pasaje de "gel en fase líquida" a la
estructura membrana biológica. Los esteroles asociados a los fosfolípidos de las
membranas juegan un rol regulador. Participan en el control de la permeabilidad de la
membrana celular y, por lo tanto, de los intercambios de la célula con el medio
exterior.

Propiedades análogas a la del ergosterol se encuentran en otros esteroles y

ácidos grasos de cadena larga. En un estudio de la composición de la cera cuticular de
la uva, muestra que esta sustancia está esencialmente constituida por un triterpeno
que comprende un grupo carboxílico, una función alcohólica y un doble enlace: el ácido
oleanólico. Bréchot trata de explicar el crecimiento anaerobio de las levaduras en
vinificación por maceración carbónica, lo que lo lleva a estudiar la acción de la cera
cuticular sobre el desarrollo anaerobio de las levaduras. Efectivamente ella es
activadora. Un poco más tarde este efecto es relacionado únicamente al ácido
oleanólico, principal componente de la cera cuticular, que presenta un efecto "factor de
crecimiento" anaerobio de las levaduras.

El papel funcional del ácido oleanólico es aún poco conocido. A partir de las
experiencias de Bréchot se puede pensar que permite mantener el ácido glutámico en
un índice estable en el conjunto de los aminoácidos de la célula y que participa así en
la activación de las síntesis proteicas.

31