HTTP://WWW.SCRIBD.

COM/DOC/4743830/PRUEBAS-BIOQUIMICAS-PARAENTEROBACTERIAS

HTTP://WWW.SCRIBD.COM/DOC/4743830/PRUEBAS-BIOQUIMICAS-PARAENTEROBACTERIAS?AUTODOWN=PPT

PRUEBAS BIOQUMICAS

INDOL I !"#$%&&'(

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de m.o.

P"' &')'#

La prueba de indol est basada en la formacin de un comple o ro o cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p!dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de "ovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ Caldo triptofano

#eptona o digerido pancretico de casena %loruro de sodio (gua destilada &,' g

$g

)&& ml

Reactivo de Kovacs

(lcohol amlico o isoamlico p!dimetilaminobenzaldehdo *%l conc. '& ml

)'& ml )& g

P"#&*$'/'* !#

+nocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a ,'-% durante ). a $/ horas. (l finalizar este perodo, a0adir ' gotas de reactivo por la pared interior del tubo.
I !*")"*!-&'(

El desarrollo de un color ro o intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despu1s de a0adir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

%ontroles Escherichia coli2 positivo Klebsiella pneumoniae2 negativo 3mayora de las cepas4

RO0O DE METILO - 1O2ES-PROS3AUER 4RM 1P5 P"' &')'#

5na de las caractersticas ta6onmicas que se utilizan para identificar los diferentes g1neros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. 7e conocen dos tipos generales2 la fermentacin cido!mi6ta y la fermentacin del $,, butanodiol. En la fermentacin cido mi6ta se forman fundamentalmente lctico, ac1tico y succnico, adems de etanol, *$ y %8$. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido 3acetato y succinato4 y los principales productos son el butanodiol, etanol, *$ y %8$. El ro o de metilo es un indicador de p* con un intervalo de vira e entre 9,& 3amarillo4 y /,/ 3ro o4, que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mi6ta. El acetil!metil!carbinol 3o acetona4 es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de o6geno la acetona es o6idada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa!naftol dando un color ro o!fucsia

M*$'#+ , "*-&!'.#+ Caldo RM/VP

#eptona

:g

;lucosa

'g

<osfato dipotsico ' g (gua destilada )L

p* = 9,> ? &,)

Indicador de pH rojo de metilo

@o o de metilo

&,) g en ,&& mL de etanol >'$&& ml

(gua destilada

Revelador VP

alfa!naftol 3solucin al 'A en etanol >'-4 7olucin de "8* al /&A en agua destilada

P"#&*$'/'* !#

+nocular el caldo @BC# con un cultivo puro de no ms de $/ horas del m.o. en estudio. +ncubar a ,'-% durante /. horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir ) mL del caldo a un tubo limpio para C#. En el caldo restante revelar @B agregando unas / ! . gotas del indicador ro o de metilo. #ara revelar C# agregar &,9 ml 3)& gotas4 de alfa!naftol al 'A y ) gota de "8* al /&A. (gitar cuidadosamente para e6poner el medio al o6geno atmosf1rico y de arlo reposar durante )& a )' minutos.

I !*")"*!-&'(

La prueba @B es positiva si se desarrolla un color ro o estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el vira e del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de cido mi6ta. 5n color anaran ado, intermedio entre el ro o y el amarillo no es considerado como positivo. La prueba C# es positiva si se desarrolla un color ro o!fucsia luego de )' minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de o6idacin de la acetona.

%ontroles @B positivo, C# negativo2 Escherichia coli @B negativo, C# positivo2 Enterobacter aerogenes

UTILI6ACI7N DE CITRATO I !"#$%&&'(

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias.

P"' &')'#

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de p* se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a p* :,9.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ Medio de Simmons

<osfato dicido de amonio <osfato dipotsico %loruro de sodio %itrato de sodio 7ulfato de magnesio (gar (zul de bromotimol (gua destilada c.s.p. )' g )g 'g

)g

$g &,$ g

&,&. g )L

p* = 9,>

P"#&*$'/'* !#

7e inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. 5tilizar un cultivo de $/ horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. +ncubar a ,'-% durante / das.

I !*")"*!-&'(

El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompa0ado o no de un vira e del indicador al azul.

%ontroles #ositivo2 Klebsiella spp. Degativo2 E.coli

DESCARBO8ILACI7N DE LISINA 9 ORNITINA I !"#$%&&'(

La descarbo6ilacin de aminocidos es llevada a cabo por descarbo6ilasas y se forman aminas y %8$. %ada descarbo6ilasa es especfica para un aminocido y la reaccin es completa e irreversible. Los aminocidos

ensayados habitualmente para la identificacin son lisina, ornitina y arginina.

P"' &')'#

El caldo descarbo6ilasa de Boeller es el medio base ms comnmente usado para la determinacin de las descarbo6ilasas en enterobacterias. 7e prepara un tubo con el medio conteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. 7e cubren con una capa de aceite mineral 3vaselina lquida4 para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Eurante las primeras etapas de la incubacin en ambos tubos se observar vira e del indicador de p* del medio al cido, por la fermentacin de la glucosa. Luego, si el aminocido es descarbo6ilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un vira e al alcalino.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ Base de Moeller

#eptona

'g 'g &,' g &,&&' g

E6tracto de carne ;lucosa #irido6al

#rpura de Fromocresol &,&) g @o o de cresol (gua destilada c.s.p. &,&&' g )L

p* final = 9,&

%aldo Lisina o 8rnitina de Boeller2 #reparar igual al medio base y agregar )& g del aminocido 3)A de concentracin final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminocido ya que solo la levo es activa4. (gregar aceite mineral para formar una capa de ) cm de espesor.

P"#&*$'/'* !#

+nocular con un cultivo puro de $/ horas un tubo de base de Boeller con el aminocido a estudiar 3lisina u ornitina4 y un tubo de la base 3control sin aminocido4. +ncubar a ,'-% durante ). a $/ horas.

I !*")"*!-&'(

El ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y vira e del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de p* que permite la activacin de las descarbo6ilasas. El retorno al color azul!violeta en el tubo que contiene el aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarbo6ilacin.

%ontroles Eescarbo6ilacin de lisina positiva2 Enterobacter aerogenes

Descarboxilaci n de lisina ne!ativa" Enterobacter cloacae Descarboxilaci n de ornitina positiva" Serratia spp Descarboxilaci n de ornitina ne!ativa" Klebsiella spp.

:ENILALANINA DESAMINASA I !"#$%&&'(

La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin o6idativa forma un cetocido, el cido fenilpirvico. 7lo los g1neros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias.

P"' &')'#

La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. #ara eso se agrega cloruro f1rrico que forma un comple o de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede contener e6tractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ #!ar fenilalanina

EL fenilalanina

$g ,g

E6tracto de levadura %loruro de sodio <osfato de sodio (gar 'g )g )$ g

(gua destilada c.s.p.

)L

p* = :,,

%loruro f1rrico %loruro f1rrico *%l concetrado (gua destilada c.s.p. )& g $,' g )&& ml

P"#&*$'/'* !#

+nocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de $/ horas e incubar a ,'-% durante ).!$/ horas. Luego de transcurrido el perodo de incubacin, agregar / o ' gotas de reactivo de cloruro f1rrico, directamente sobre la superficie del agar.

I !*")"*!-&'(

La aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y una prueba positiva.

%ontroles #ositivo2 Proteus Degativo2 Escherichia coli

TSI 4TRIPLE SU2AR IRON5 I !"#$%&&'(

El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Gambi1n permite la deteccin de la produccin de *$7. Es un medio til para la identificacin de enterobacterias.

P"' &')'#

El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que e6istan dos cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada 3pico4 e6puesta en toda su superficie al o6geno es aerobia y la porcin inferior 3fondo4 est protegida del aire y es relativamente anaerobia.

(l crecer un m.o. en el G7+, el pico tiende a virar al p* alcalino 3color ro o por el ro o fenol4 por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo !donde no hay o6geno! la degradacin de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la produccin de peque0as cantidades de cido 3color amarillo por el ro o fenol4. 7i se inoculan m.o. no fermentadores no se formarn cidos, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar ro o.

La glucosa en el G7+ est en una proporcin )& veces menor que la lactosa y la sacarosa. 7i el G7+ es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de cido producida por fermentacin ser ba a 3porque la cantidad de glucosa inicial es ba a4. En las primeras horas 3)& a )9 hs4 de incubacin se producir vira e del indicador al amarillo en todo el tubo 3pico y fondo4, pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al ro o por la produccin de aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita. 7i el m.o. fermenta la lactosa yHo la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares son )& veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido 3que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie4, por lo tanto todo el tubo 3pico y fondo4 virar al color amarillo 3cido4.

La produccin de *$7 a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro ferroso 3negro4. %omo esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimiento del fondo del tubo 3que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo4 se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. (dems puede observarse la produccin de gas 3*$ y %8$4, ya sea como burbu as en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie.

M*$'#+ , "*-&!'.#+

$SI

E6tracto de carne , g E6tracto de levadura #eptona )' g ,g

#roteosa peptona ' g Lactosa 7acarosa ;lucosa %loruro de sodio 7ulfato ferroso Giosulfato de sodio &,, g (gar @o o fenol (gua destilada )$ g &,&$/ g )L )& g )g 'g &,$ g )& g

p* = :,/ ? &,$

P"#&*$'/'* !#

+nocular los tubos de G7+ con punta 3alambre recto4. #ara eso introducir la punta hasta , a ' mm del fondo del tubo. Gras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. +ncubar a ,' -% durante ).!$/ hs, pero no ms de $/ hs..

I !*")"*!-&'( , C# !"#;*+

#ara el G7+ siempre se informa el resultado en el siguiente orden2 pico, fondo, produccin de gas y *$7.
Pico alcalino/fondo alcalino %#lc/#lc/!as&/H'S&(

Do hay fermentacin de azcares. %aracterstica de bacterias no fermentadoras como E . Pseudomonas sp

#ico alcalinoHfondo cido 3(lcH(Hgas!H *$7!4

;lucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Do hay produccin de gas ni de *$7. E . Shigella spp.

#ico alcalinoHfondo cido 3(lcH(Hgas!H *$7I4 ;lucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Do hay produccin de gas, si de *$7. E . Salmmonella typhi. #ico alcalinoHfondo negro 3(lcH(HgasIH*$7I4 ;lucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico. E . Salmonella spp. 3la mayora de las especies de Salmonella4.

#ico cidoHfondo cido 3(H(4 ;lucosa y lactosa yHo sacarosa fermentadas. #uede producirse *$7 o no. E.coli 3(H(H*$7 !4 ( estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. E . (H(HgasIH*$7!.

LIA 4L9SINE IRON A2AR5 I !"#$%&&'(

Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarbo6ilacin o desaminacin de la lisina. 7e puede detectar adems la produccin de *$7. Es muy utilizado en las t1cnicas de bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

P"' &')'#

Eurante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de p* del medio al cido 3amarillo4 por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarbo6ilado se formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un vira e al bsico 3color violeta4. En la desaminacin se produce un cido carbo6lico y D*, y se visualiza en la superficie la aparicin de un color ro o intenso. La produccin de *$7 a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro.

M*$'#+ , "*-&!'.#+

#eptona

'g ,g )g )& g &,' g &,&/ g

E6tracto de levadura ;lucosa L!lisina *%l %itrato f1rrico amnico Giosulfato de sodio

#rpura de bromocresol &,&$ g (gar (gua destilida )' g )L

p* = 9,: &,$

I !*")"*!-&'( , &# !"#;*+

pico alcalinoHfondo alcalinoH*$7 I, descarbo6ilacin de lisina positiva. E .2 Salmonella choleraesuis. pico ro oHfondo cidoH*$7!, desaminacin de lisina positiva, descarbo6ilacin de lisina negativa. E .2 Proteus mirabilis.

pico alcalinoHfondo cidoH*$7! descarbo6ilacin de lisina negativa. E . E. coli pico alcalinoHfondo cidoH*$7I descarbo6ilacin de lisina negativa, produccin de *$7. E . Citrobacter freundii.

PRODUCCI7N DE PI2MENTOS PARA PSEUDOMONAS SP. I !"#$%&&'(

La capacidad para producir pigmentos como pioverdina 3fluorescena4 y piocianina es una caracterstica importante para la identificacin de especies de Pseudomonas. (lgunas de ellas elaboran slo fluorescena 3e . Ps. fluorescens4 y otras ambos pigmentos 3e . Ps. aeruginosa4. La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie la producen. 7e han dise0ado medios de cultivo que potencian la elaboracin de uno de los pigmentos e inhiben la formacin del otro.

P"' &')'#

El medio "ing ( 3o #seudomonas (gar #4 potencia la elaboracin de piocianina mientras que el "ing F 3o #seudomonas (gar <4 potencia la elaboracin de fluorescena e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul!verde mientras que la fluorescena es amarillo!verdoso y fluoresce cuando es e6puesto a la luz 5C 3=$'/ nm4. E6isten pigmentos amarillo!verdosos producidos por algunas especies de #seudomonas que no fluorescen.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ Kin! #

#eptona ;licerol "$78/ Bg%l$ (gar

#!)a

$& g )& g )& g ),/ g )' g

*+

Kin! B

#roteosa #eptona $& g ;licerol "$*#8/ Bg78/.:*$8 (gar

#!)a

)& g ),' g ),' g )' g

*+

Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a )$)J% durante )' minutos y se de an solidificar inclinados.

P"#&*$'/'* !#

+nocular los tubos por estras. +ncubar a ,'J% durante $/ hs.

I !*")"*!-&'(

8bservar al 5C, la produccin de pigmento azul!verdoso en el medio "ing ( y la de pigmento amarillo!verdoso, en el "ing F

%ontroles Pseudomonas aeruginosa2 "ing ( I P. fluorescens2 "ing ( ! P. fluorescens2 "ing F I P. stutzeri2 "ing F !

DNASA - DESO8IRRIBONUCLEASA I !"#$%&&'(

La actividad deso6irribonucleasa 3ED(sa4 se ha demostrado fundamentalmente en los g1neros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el (ED a fracciones de menor peso molecular. Esta caracterstica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. KecLman y %atlin demostraron la estrecha correlacin entre la produccin de ED(sa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la produccin de coagulasa.

P"' &')'#

Los m.o. ED(sa positivos degradan el ED( cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras2 ya sea inundando las placas crecidas con *%l &,) D y observando zonas transparentes alrededor de las estras o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo 3viran a rosado cuando el test es positivo4.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ D,#sa a!ar

Griptosa (ED Da%l (gar

$& g $g 'g )' g

(zul de toluidinaM &,) g (gua c.s.p. )L

M o verde de metilo

P"#&*$'/'* !#

Estriar la superficie de la placa e incubar a ,'-% durante ).!$/ horas. 8bservar el vira e del indicador a rosado alrededor de las estras.

I !*")"*!-&'(

5n resultado positivo est dado por el vira e del indicador en la zona de la estra a rosado.

Controles

#ositivo2 S.aureus y Serratia marcescens Degativo2 S.epidermidis2

COA2ULASA I !"#$%&&'(

La coagulasa es una enzima proteica con actividad seme ante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible en un sistema analtico adecuado. 7e cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infeccin estafilocccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus 3coagulasa positivo4 de otros 7taphylococcus.

P"' &')'#

La coagulasa se halla presente en dos formas, NlibreO y Nfi aO, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de t1cnicas de determinacin diferentes2 %oagulasa fi a 3prueba en portaob etos42 la coagulasa fi a est unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las c1lulas suspendidas en plasma 3que contiene fibringeno4 provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaob etos. %oagulasa libre 3prueba en tubo42 la coagulasa libre es una enzima e6tracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. %uando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un cogulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera similar a cuando se a0ade trombina.

M*$'#+ , "*-&!'.#+

#lasma coagulasa 3Eifco, o FFL4 %ultivo de 7taphylococcus de $/ horas en un agar nutriente o caldo nutriente.

P"#&*$'/'* !# Pr)eba en portaobjetos

%olocar una gota de agua destilada sobre un portaob etos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensin cargada homog1nea. (gregar una gota de plasma reconstituido unto a la gota de la suspensin del m.o. Bezclar bien con el ansa. +nclinar el portaob etos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos.

Pr)eba en t)bo

%olocar as1pticamente &,' ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo est1ril. (0adir &,' ml de cultivo de $/ horas 3o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa4. Bezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido. %olocar en ba0o de agua a ,:-% y observar cada hora hasta / horas y luego a las $/ horas, la formacin de un cogulo visible.

I !*")"*!-&'(

#rueba en portaob etos2 una reaccin positiva se detecta usualmente en )' a $& segundos por la aparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en $ a , minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de 7taphylococcus aureus no producen coagulasa fi a.

#rueba en tubos2

)I2 peque0os cogulos no organizados. $I2 peque0os cogulos organizados. ,I2 gran cogulo organizado. /I2 todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. 7e consideran positivos los grados ,I y /I

Controles

#ositivo2 S.aureus Degativo2 S.epidermidis2

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA I !"#$%&&'(

La prueba de la bilis!esculina est basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo E, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al ) o /A. La esculina es, qumicamente, un derivado de la cumarina 39!b!glucsido!:!hidro6icumarina4, que por su estructura pertenece a los glucsidos. #or definicin, 1stos estn constitudos por dos restos unidos por un puente de o6geno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la :!hidro6icumarina 3que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona4.

P"' &')'#

Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambi1n hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina 3:,: dihidro6icumarina4 y 1sta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formacin de un comple o marrn oscuro o negro.

(lgunos medios bilis!esculina incluyen tambi1n azida sdica para inhibir el desarrollo de organismos ;ram negativos, transformndose en selectivos para estreptococos.

M*$'#+ , "*-&!'.#+ Medio bilis&esc)lina

#eptona

'g

E6tracto de carne , g Filis de buey Esculina %itrato f1rrico (gar (gua destilada )' g )L /& g )g &,' g

P"#&*$'/'* !#

7e estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis!esculina. 7e incuba a ,:-% durante $/ horas.

I !*")"*!-&'(

La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o negro alrededor de las colonias en placa.

%ontroles #ositivo2 streptococo del grupo E Degativo2 estreptococo no del grupo E

UREASA I !"#$%&&'(

La urea es una diamida del cido carbnico que puede ser hidrolizada con liberacin de amonaco y di6ido de carbono.

P"' &')'#

La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reaccin qumica2 5rea I $*$8 %8$ I *$8 I $D*,

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, produci1ndose alcalinizacin y aumento de p* del medio.

M*$'#+ , "*-&!'.#+

El caldo urea y agar urea de %hristensen son los dos medios mas comnmente usados en los laboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o.

Caldo de St)art

E6tracto de levadura <osfato monopotsico <osfato disdico 5rea @o o fenol (gua >,' g $& g &,&) g )L

&,) g >,) g

p* = 9,.

#!ar )rea de C-ristensen

#eptona ;lucosa

)g )g 'g $g

%loruro de sodio

<osfato monopotsico 5rea @o o fenol (gar (gua $& g

&,&)$ g )' g )L

p* = 9,.

P"#&*$'/'* !#

+nocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. +ncubar a ,'-% durante $/ hs.

I !*")"*!-&'(

Los m.o. que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en ) a , hs. Las especies mas lentas pueden requerir , o mas das. %aldo2 una coloracin ro iza indica alcalinazacin e hidrlisis de urea

(gar2 una coloracin ro iza en el medio indica hidrlisis de urea positiva. Los degradadores lentos producen coloracin parcial 3generalmente el pico4, los rpidos producen coloracin en todo el tubo. 7i no hay hidrlisis el medio permanece con el colo original 3amarillo4 y se observa crecimiento.

%ontroles #ositivo2 Proteus sp Degativo2 Escherichia coli

Introduccin Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. De la amplia variedad de pruebas bioqumicas, nosotros en laboratorio utilizaremos !, aplicados a " especies de microorganisos. #dem$s estudiaremos los resultados que estos test arro%an, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de traba%o de nuestro laboratorio. Objetivos &ealizar el experimento adecuadamente y poder identificar 'aplicando (ste m(todo' distintos microorganismos. Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioqumcas es o son el )los* adecuado)s* de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.

 +ntender los principios bioquimicos de las pruebas. Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioqumias ,onocer el uso de las pruebas bioqumicas para la identificacin de microorganismos -dentificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometi el o los errores, para as, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioqumicas. Internet: http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html http://edicionmicro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html Prueba MIO (MotilityIndoleOrnitine MotilidadIndolOrnitina) +sta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de -ndol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento. -nocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por /0 1oras a 234 . -nterpretacin y &esultados. &eaccin -nterpretacin +nturbiamiento del #gar. 5ay movilidad #gar transparente de' sarrollo solo en picada 6o 1ay movilidad #zul )alcalino* Descarboxila ornitina ,oloracin #marilla )$cido* 6o descarboxila &o%o )anillos* -ndol )7* #marillo )anillos* -ndol ) ' * Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Az car !ierro) +l 8S- es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de $cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un 9nico medio. 8ambien permite la identificacin de la produccin de S5/. +sta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de g(nero en la familia Enterobacteriaceae, con ob%etivo de diferenciar entre. bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerog(nicas bacterias productoras de S5/ a partir de sustancias org$nicas Prueba MIO (MotilityIndoleOrnitine MotilidadIndolOrnitina) +sta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de -ndol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento.

-nocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por /0 1oras a 234 . -nterpretacin y &esultados. &eaccin -nterpretacin +nturbiamiento del #gar. 5ay movilidad #gar transparente de' sarrollo solo en picada 6o 1ay movilidad #zul )alcalino* Descarboxila ornitina ,oloracin #marilla )$cido* 6o descarboxila &o%o )anillos* -ndol )7* #marillo )anillos* -ndol ) ' * Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Az car !ierro) +l 8S- es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de $cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un 9nico medio. 8ambien permite la identificacin de la produccin de S5/. +sta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de g(nero en la familia Enterobacteriaceae, con ob%etivo de diferenciar entre. bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerog(nicas bacterias productoras de S5/ a partir de sustancias org$nicas que contengan azufre. Prodedimiento. -nocular los tubos de 8S- con punta )alambre recto*. Para eso introducir la punta 1asta 2 a " mm. del fondo del tubo. 8ras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento 1acia uno y otro lado. -ncubar a 2"4 durante /0 1oras. Posteriormente se debe medir el p5 de los cultivos. &esultados. Pico alcalino:fondo alcalino . no 1ay fermentacin de azucares. ,aracterstica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino:fondo $cido . ;lucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. hi!ella spp. . alcalino:fondo negro . ;lucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de $cido sulf1drico. almonela spp. Pico $cido:fondo $cido. ;lucosa y lactosa y:o sacarosa fermentadas. Puede producirse S5/ o no. "scherichia coli. # estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Prueba "IA ("ysine Iron Agar Agar "isina !ierro) +sta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de S5/ y es m$s sensible que el 8S- para la deteccin de S5/.

+s muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento. -nocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por /0 1oras a 234 . -nterpretacin y &esultados. &eaccin -nterpretacin #zul )alcalino* 5ay movilidad &o%o 6o 1ay movilidad +ngrecimiento Descarboxila ornitina &uptura del #gar 6o descarboxila <ondo #marillo y 8endido p9rpura Descarboxilacin de lisina Pruebas #io$u%&icas IM'i() Agar (itrato La utilizacin de citrato como 9nica fuente de carbono es una prueba 9til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como 9nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como 9nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. +ste aumento de p5 se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a p5 3,=. Procedimiento. Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. >tilizar un cultivo de /0 1oras en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. -ncubar a 2"4, durante 0 das. +l ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompa?ado o no de un vira%e del indicador al azul. &esultados. )7*@lebsiella spp. ) ' * +sc1eric1ia ,oli Indol

Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioqumcas es o son el )los* adecuado)s* de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar. +ntender los principios bioquimicos de las pruebas. Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioqumias ,onocer el uso de las pruebas bioqumicas para la identificacin de microorganismos -dentificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometi el o los errores, para as, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioqumicas. *+I',-SI.A. ., SA+TIA/O ., (!I", 0A(*"TA. T,(+O"O/I(A T,(+O"O/1A ., A"IM,+TOS Microbiolo!#a Pruebas #io$u%&icas

Autor) "ab +2 3 (od4 56 * #ibliogra7%a Microbiolog%a 8 T9o&as .4 #roc:; Mic9ael T4 Madigan /a. ed. en espa?ol, AA2. B(xico C +ngleDood ,liffs . +d. Prentice 5all 5ispanoamericana. Microbiolog%a 8 Mic9ael <4 Pelczar; <r4; -oger .4 -eid /a. ed. en espa?ol., AE/. B(xico . +d. Bc;raD'5ill. Tratado de &icrobiolog%a ) con inclusin de in&unolog%a y gen=tica &olecular 8 #ernard .4 .avis /a. ed., A3E. Farcelona . +d. Salvat. Internet: http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html http://edicionmicro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html Prueba de la O>idasa +l ob%etivo de la prueba Gxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e'. +ste se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina. el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. +n estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a p9rpura. Procedimiento. ,on un peque?o papel de filtro a?adimos reactivo de @ovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. 8ras unos 2! segundos, observamos si 1a ocurrido alg9n cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positva esta prueba cuando toma un color p9rpura la muestra. &esultados. )7* Pseudomonas aeruginosa ) ' * +sc1eric1ia coli Prueba de la (atalasa ' +l Gb%etivo es buscar la presencia de la enzima catalasa +l perxido de 1idrgeno se produce al utilizar la bacteria el az9car por va oxidativa. #l ser (ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa )5/G/ 'H 5/G 7 I G/*. Prodecimiento. #gregamos aproximadamente " ml. de perxido de 1idrgeno al 2J a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liquida de perxido de 1idrogeno y debemos observar la reaccin de esta. La prueba se considera como positiva si observamos burbu%as de oxgeno. &esultados. )7* Stap1ylococcus aureus

) ' * Streptococcus spp. Prueba de la (oagulasa La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. +l ob%etivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. +sta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Stap1ylococcus. Procedimiento. Preparamos una mezcla de !, ml. de ,,, )caldo cerebro corazon* y !,2 ml. de plasma de cone%o en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. #ureus. 8apamos el tubo de ensayo con algodn 1idroflico y lo llevamos a ba?o Bara a 234 , durante una 1ora, observando la muestra cada " minutos. #l completa la 1ora, sacamos las muestras y observamos sus resultados. &esultados. +stratificaremos los resultados en 0 distintos niveles. . peque?os co$gulos no oganizados /. peque?os co$gulos oganizados 2. gran co$gulo organizado 0. todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 2 y 0. )7* Stap1ylococcus aureus / ) ' * Stap1ylococcus epidermis. Prueba MIO (MotilityIndoleOrnitine MotilidadIndolOrnitina) +sta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de -ndol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento. -nocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por /0 1oras a 234 . -nterpretacin y &esultados. &eaccin -nterpretacin +nturbiamiento del #gar. 5ay movilidad #gar transparente de' sarrollo solo en picada 6o 1ay movilidad #zul )alcalino* Descarboxila ornitina ,oloracin #marilla )$cido* 6o descarboxila &o%o )anillos* -ndol )7* #marillo )anillos* -ndol ) ' * Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Az car !ierro) +l 8S- es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de $cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un 9nico medio. 8ambien permite la identificacin de la produccin de S5/. +sta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de g(nero en la familia Enterobacteriaceae, con ob%etivo de diferenciar entre. bacterias fermentadoras de la glucosa

 bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerog(nicas bacterias productoras de S5/ a partir de sustancias org$nicas que contengan azufre. Prodedimiento. -nocular los tubos de 8S- con punta )alambre recto*. Para eso introducir la punta 1asta 2 a " mm. del fondo del tubo. 8ras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento 1acia uno y otro lado. -ncubar a 2"4 durante /0 1oras. Posteriormente se debe medir el p5 de los cultivos. &esultados. Pico alcalino:fondo alcalino . no 1ay fermentacin de azucares. ,aracterstica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino:fondo $cido . ;lucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. hi!ella spp. . Pico alcalino:fondo negro . ;lucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de $cido sulf1drico. almonela spp. Pico $cido:fondo $cido. ;lucosa y lactosa y:o sacarosa fermentadas. Puede producirse S5/ o no. "scherichia coli. # estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Prueba "IA ("ysine Iron Agar Agar "isina !ierro) +sta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de S5/ y es m$s sensible que el 8S- para la deteccin de S5/. +s muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento. -nocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por /0 1oras a 234 . -nterpretacin y &esultados. &eaccin -nterpretacin #zul )alcalino* 5ay movilidad &o%o 6o 1ay movilidad +ngrecimiento Descarboxila ornitina &uptura del #gar 6o descarboxila <ondo #marillo y 8endido p9rpura Descarboxilacin de lisina Pruebas #io$u%&icas IM'i() Agar (itrato La utilizacin de citrato como 9nica fuente de carbono es una prueba 9til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como 9nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como 9nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. +ste aumento de p5 se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a p5 3,=. Procedimiento. Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. >tilizar un cultivo de /0 1oras en un medio slido y

cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. -ncubar a 2"4, durante 0 das. +l ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompa?ado o no de un vira%e del indicador al azul. &esultados. )7*@lebsiella spp. ) ' * +sc1eric1ia ,oli Indol 0 +l indol es uno de los productos de degradacin metablica del amino$cido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de 1idrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, $cido pir9vico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muc1as especies de microorganismos. La prueba de indol est$ basada en la formacin de un comple%o ro%o cuando el indol reacciona con el grupo alde1do del p'dimetilaminobenzalde1do. +ste es el principio activo de los reactivos de @ovacs y +1rlic1. +l medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Procedimiento. -nocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 2"4, durante E a /0 1oras. #l finalizar este perodo, a?adir " gotas de reactivo de @ovacs por la pared interior del tubo. +l desarrollo de un vivo color ro%o fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despu(s de a?adir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. &esultados. )7* +sc1eric1ia coli ) ' * @lebsiella pneumoniae -ojo Metilo >na de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes g(neros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen / tipos generales. La fermentacin $cido'mixta y la fermentacin del /,2 butanodiol. +n la fermentacin $cido mixta se forman fundamentalmente l$ctico, ac(tico y succnico, adem$s de etanol, 5/ y ,G/. +n la va del butanodiol se forman cantidades menores de $cido )acetato y succinato* y los principales productos son el butanodiol, etanol, 5/ y ,G/. +l ro%o de metilo es un indicador de p5 con un intervalo entre =,! )amarillo* y 0,0 )ro%o*, que se utiliza para visualizar la produccin de $cidos por la va de fermentacin $cido mixta. Procedimiento. -nocular el caldo &o%o Betilo con un cultivo puro de no m$s de /0 1oras del microorganismo en estudio. -ncubar a 2"4, durante 0E 1oras. Luego de finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de ro%o de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color ro%o estable. +sto indica que la produccin

de $cido es suficiente para producir el vira%e del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de $cido mixta. >n color anaran%ado, intermedio entre el ro%o y el amarillo no es considerado como positivo. &esultados. )7* +sc1eric1ia coli ) ' * +nterobacter aerogenes 'ogues Pros:auer +n la prueba de Koges'ProsLauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de ro%o de metilo. +l acetil'metil'carbinol )o acetona* es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. +n medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. +ste se revela en presencia de alfa'naftol dando un color ro%o'fucsia. 1 Procedimiento. -nocular el caldo &BKP con un cultivo puro de no m$s de /0 1oras del microorganismo en estudio. -ncubar a 2"4, durante /0 1oras. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir ml del caldo &B:KP a un tubo limpio y agregar !,= ml de alfa'naftol al "J y !,/ ml de @G5 al 0!J. #gitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosf(rico y de%arlo reposar durante ! a " minutos. +l desarrollo de un color ro%o'fucsia luego de " minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba KP positiva. &esultados. )7* +nterobacter aerogenes )'*+sc1eric1ia coli .iagra&a de 7lujo realizacin de Pruebas $io%u#micas -,(O",((I?+ ., MAT,-IA",S A *TI"I@A- ,+ P-*,#AS #IOA*1MI(AS P-,PA-A(IO+ ., MAT,-IA" ., "A#O-ATO-IO -,A"I@A(IO+ .," P-O(,.IMI+TO PA-A P-*,#AS #IOA*IMI(AS I+(*#A(IO+ ., M*,ST-AS A+OTA- -,S*"TA.OS A+A"ISIS ., -,S*"TA.OS 2 (OMPA-A(IO+ ., -,S*"TA.OS ,BP,-IM,+TA",S C T,O-I(OS ,'A"*A(IO+ C -,S*"TA.OS 0I+A",S ., P-*,#AS #IOA*IMI(AS *3