UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

Facultad de Ciencias - Escuela de Química

Laboratorio de Bioquímica
Semestre II-2019

Práctica No. 1. Carácter anfotérico y punto isoeléctrico de

aminoácidos.
Geraldine Álvarez González – 2161948
Javier Felipe Rojas Acevedo – 2151866

Fecha de la elaboración de la práctica: 2019-09-23.

Fecha de presentación del informe: 2019-09-30.

Resumen

Los aminoácidos son monómeros ampliamente utilizados para la síntesis de proteínas debido a su
facilidad para formar cadenas largas entre varios de ellos, al aplicar un cambio de pH se puede
observar que contienen dos grupos principales altamente ionizables, por tanto, se realiza una curva
de titulación con el propósito de hallar el punto isoeléctrico, los pKa y probar su carácter anfotérico.
Se utilizó una solución de aminoácido desconocido 0.1 M con pH aproximadamente de 1.5 que fue
titulado con 50 mL de NaOH agregando pequeños volúmenes de 0.5 mL. El aminoácido hallado
tentativamente es la histidina debido a que los pKa son muy cercanos a los reportados en literatura,
siendo respectivamente pKa1: 1.8, pKa2: 6.0 y pKa3: 9.2, y un valor de PI = 7.6, lo que indica que el
aminoácido intercambia protones a pH fisiológico, comportándose como un excelente amortiguador
en los medios biológicos.

Introducción

Las proteínas son polímeros muy importantes en los seres vivos ya que cumplen varias funciones para
el buen funcionamiento del organismo. Estas macromoléculas están compuestas de monómeros
denominados aminoácidos, como su nombre lo indica poseen un grupo amino unido al carbono
central seguido de un grupo carboxilo, a este carbono central o carbono alfa también está unido un
hidrógeno o una cadena lateral (R) con la cual se pueden diferenciar los distintos tipos de
aminoácidos; se pueden clasificar en alifáticos, básicos, ácidos, aromáticos, cíclicos y con azufre o
hidroxilo dependiendo de la cadena lateral unida a ellos1, en consecuencia, muchos de estos grupos
presentes son sensibles a los cambios de pH ya que el grupo amino será protonado si el pH es ácido
y el grupo carboxilo será deprotonado a un pH relativamente básico; el organismo se encuentra en un
pH cercano a la neutralidad.

El pKa del grupo carboxilo y amino es de aproximadamente 2 y 10, por consiguiente, cada uno de los
grupos presentes perderá o adquirirá un protón para la formación del zwitterion1, debido a esto se
puede decir que el aminoácido tiene carácter anfotérico. En está practica se realiza la titulación de un
aminoácido desconocido, con el fin de obtener una curva de valoración para visualizar cada uno de
los estados de la muestra conforme crece el pH de la solución y poder vislumbrar su estructura.

Resultados

Los resultados obtenidos de la titulación del aminoácido se evidencian el primer punto del
cuestionario de la práctica contenido en Anexos.
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Discusión

A partir de la Tabla 1, se puede construir la correspondiente curva de titulación (Figura 2), en la cual
se observan dos saltos de pH, por lo que se deduce que el aminoácido contiene tres valores de pKa.
Inicialmente, la solución del aminoácido en HCl tiene un pH = 1.49; durante los primeros 6 mL
adicionados de NaOH, aproximadamente, no se observan cambios significativos de pH; por lo que
en esta zona ocurre la desprotonación del grupo carboxilo, obteniéndose así un pKa1 = 1.8, este valor
depende del efecto inductivo que genera el grupo amino y en este caso, el grupo ionizable de la
cadena, lo cual facilita aún más la desprotonación de dicho grupo. Luego de adicionar alrededor de
18 mL de la base y aproximándose a pH neutro, ocurre el siguiente salto, es decir que durante este
rango ocurrió la desprotonación del grupo de la cadena lateral, dando un pKa2 = 6, y se puede deducir
que el aminoácido tiene un carácter básico; y seguido a esto, no se observan cambios ligeramente
grandes en el pH hasta que este iguala el valor de 9.59, equivalente a un volumen de aproximadamente
28 mL de base adicionada, por lo que finalmente se desprotona el grupo amino y se obtiene un pKa3
= 9.2, de modo que el punto isoeléctrico obtenido es 7.6; que indica que la carga neta es igual a 0, es
decir, el ion híbrido zwitterión, resultante de la carga negativa del anión carboxilato y la carga positiva
del catión amonio. Según lo reportado en la literatura 1, se trata de la Histidina, y así se concluye que
los valores obtenidos experimentalmente cuentan con gran exactitud. Como se dedujo anteriormente,
la Histidina es un aminoácido básico junto con la lisina y la arginina, su cadena lateral contiene un
grupo imidazol1, como se puede observar en la Figura 1, vale destacar que la presencia de este
aminoácido en las proteínas eleva el pH a 7, en el cual está principalmente compuesto de anión
carboxilato, catión amonio y una pequeña fracción del grupo imidazol desprotonado (ver punto 2,
Anexos). De este aminoácido se puede resaltar que debido a que su cadena intercambia iones a pH
próximos al fisiológico, se le atribuye la participación en la catálisis enzimática 1,2 y el aporte de su
carácter anfotérico en medios biológicos como por ejemplo el caso de la Hemoglobina3,4. La Histidina
se encuentra mayormente cargada positivamente a pH fisiológico, y debido a esto tiene un carácter
muy polar, por lo que suele hallarse en la superficie de las proteínas y así interaccionar con el medio
acuoso1.

Figura 1. Estructura de la Histidina.

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Conclusiones

Mediante la titulación con una solución básica de NaOH, se logró determinar los valores de pKa de
los grupos ionizables de un aminoácido desconocido, tratándose de la Histidina, siendo ésta un
aminoácido básico que se comporta como un excelente amortiguador a pH fisiológico, debido a que
su punto isoeléctrico es 7.6, es decir, intercambia fácilmente protones a este pH, lo que comprueba
su carácter anfotérico.

 Bibliografía

[1] Mathews, Christopher K.; van Holde, K. E.; Ahern, Kevin G. Bioquímica. Pearson educación, S.
A., 3ra edición, 2002, 143-149.

[2] Horta Ronda, A. (2008). Separación de aminoácidos y derivados utilizando resinas impregnadas
de extractante (Doctorado). Universidad de Burgos.

[3] Gonzalez Nuñez, V. (n.d.). AMINOACIDOS. PROPIEDADES ACIDO-BASE. Aminoácidos

proteinógenos codificables (20). Todos L-αα. [online] Salamanca, p.4. Disponible en:
http://ocw.usal.es/ciencias-biosanitarias/bioquimica-ph-equilibrios-acido-2013-
base/contenidos/3%20AminoacidosPropiedadesAcidoBase_2012.pdf [Accessed 27 Sep. 2019].

[4] Gonzalez Nuñez, V. (n.d.). CURVAS DE TITULACION DE AMINOACIDOS. Curva de

titulación de un aminoácido básico como la histidina. [online] Salamanca, pp.3-4. Disponible en:
http://diarium.usal.es/vgnunez/files/2012/11/4.-Curvas-de-titulaci%C3%B3n-de-aminoacidos.pdf
[Accessed 27 Sep. 2019].

Autoevaluación crítica de trabajo grupal

Cada uno de los integrantes participó de manera activa en cada una de las partes para la elaboración
del informe, logrando así un resultado óptimo del mismo.

Nombre Nota
Geraldine Álvarez González – 2161948 5.0

Javier Felipe Rojas Acevedo – 2151866 5.0

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ANEXOS

1. Construya una tabla de datos y los gráficos correspondientes a las curvas de titulación de pH versus
miliequivalentes de NaOH adicionados para cada aminoácido. Analice e interprete sus resultados.

mL NaOH mEq NaOH pH mL NaOH mEq NaOH pH

0,5 0,0274 1,5 25,5 1,3974 9,09
1 0,0548 1,54 26 1,4248 9,16
1,5 0,0822 1,6 26,5 1,4522 9,26
2 0,1096 1,65 27 1,4796 9,34
2,5 0,137 1,7 27,5 1,507 9,43
3 0,1644 1,74 28 1,5344 9,51
3,5 0,1918 1,8 28,5 1,5618 9,59
4 0,2192 1,85 29 1,5892 9,7
4,5 0,2466 1,89 29,5 1,6166 9,81
5 0,274 1,95 30 1,644 9,92
5,5 0,3014 2,01 30,5 1,6714 10,02
6 0,3288 2,07 31 1,6988 10,17
6,5 0,3562 2,13 31,5 1,7262 10,37
7 0,3836 2,2 32 1,7536 10,57
7,5 0,411 2,28 32,5 1,781 10,75
8 0,4384 2,36 33 1,8084 10,92
8,5 0,4658 2,47 33,5 1,8358 10,99
9 0,4932 2,58 34 1,8632 11,07
9,5 0,5206 2,74 34,5 1,8906 11,16
10 0,548 2,94 35 1,918 11,25
10,5 0,5754 3,32 35,5 1,9454 11,31
11 0,6028 4,33 36 1,9728 11,38
11,5 0,6302 4,89 36,5 2,0002 11,42
12 0,6576 5,09 37 2,0276 11,49
12,5 0,685 5,32 37,5 2,055 11,53
13 0,7124 5,42 38 2,0824 11,56
13,5 0,7398 5,55 38,5 2,1098 11,58
14 0,7672 5,66 39 2,1372 11,62
14,5 0,7946 5,77 39,5 2,1646 11,64
15 0,822 5,85 40 2,192 11,66
15,5 0,8494 5,94 40,5 2,2194 11,68
16 0,8768 6,04 41 2,2468 11,71
16,5 0,9042 6,12 41,5 2,2742 11,73
17 0,9316 6,21 42 2,3016 11,76
17,5 0,959 6,3 42,5 2,329 11,77
18 0,9864 6,41 43 2,3564 11,79
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18,5 1,0138 6,57 43,5 2,3838 11,81

19 1,0412 6,71 44 2,4112 11,83
19,5 1,0686 6,89 44,5 2,4386 11,85
20 1,096 7,1 45 2,466 11,86
20,5 1,1234 7,47 45,5 2,4934 11,88
21 1,1508 7,85 46 2,5208 11,9
21,5 1,1782 8,11 46,5 2,5482 11,91
22 1,2056 8,33 47 2,5756 11,92
22,5 1,233 8,48 47,5 2,603 11,93
23 1,2604 8,6 48 2,6304 11,94
23,5 1,2878 8,7 48,5 2,6578 11,96
24 1,3152 8,83 49 2,6852 11,97
24,5 1,3426 8,92 49,5 2,7126 11,98
25 1,37 9 50 2,74 11,99

Tabla 1. Datos de pH obtenidos de la titulación del aminoácido 2.

Figura 2. Curva de titulación experimental de pH vs. mEq de NaOH para el aminoácido 2.

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Se observa la presencia de tres valores de pKa, por lo que se deduce que se trata de un aminoácido
con una cadena lateral ionizable.
2. De las respectivas curvas de titulación, determine los valores de pKa y pI de los aminoácidos
utilizados. Relacione los resultados e identifique el posible aminoácido que se encuentra en solución.
Además, calcule la fracción ionizada de los diferentes grupos a pH 7 (utilice la ecuación de
Henderson-Hasselbalch).
Para el primer pKa, correspondiente al grupo carboxilo (α-COOH), se observa en el rango de pH =
1.5 – 2.01, por lo que el pKa = 1.8. Para el segundo pKa, correspondiente a la cadena lateral, se
observa en el rango de pH = 5.55 – 6.41, por lo que el pKa = 6. Finalmente, para el tercer pKa,
correspondiente al grupo amino (α-NH3+), se observa en el rango de pH = 8.83 – 9.59, por lo que el
pKa = 9.2.
Para calcular el valor del PI, se hace mediante el promedio del pKa de la cadena lateral y el pKa del
9.2+6
grupo amino, de modo que 𝑃𝐼 = = 7.6.
2

Según lo registrado en la siguiente tabla en la que se reportan los valores de pKa de los grupos
ionizables de los 20 aminoácidos, se deduce que se trata de la Histidina, por ende, la cadena lateral
ionizable corresponde al grupo imidazol.

Figura 3. Valores de pKa de los 20 aminoácidos. Fuente: Bioquímica de Mathews.

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Para conocer la fracción ionizada de cada uno de los grupos presentes en el aminoácido a pH neutro,
se hace uso de la ecuación de Henderson-Hasselbalch:

𝑏𝑎𝑠𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑑𝑎
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log ( )
á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑑é𝑏𝑖𝑙

Para el grupo carboxilo a pH 7 y con pKa = 2, se obtiene que la relación -COO-/-COOH es:

−𝐶𝑂𝑂 −
7 = 1.8 + log ( )
−𝐶𝑂𝑂𝐻
−𝐶𝑂𝑂 −
5.2 = log ( )
−𝐶𝑂𝑂𝐻
−𝐶𝑂𝑂−
= 158489
−𝐶𝑂𝑂𝐻

Para el grupo imidazol a pH 7 y con pKa = 6, se obtiene que la relación =N-/=NH-+ es:

=𝑁−
7 = 6 + log ( )
= 𝑁𝐻 + −
=𝑁−
1 = log ( )
= 𝑁𝐻+ −
=𝑁−
= 10
= 𝑁𝐻 + −

Para el grupo amino a pH 7 y con pKa = 9.2, se obtiene que la relación -NH2/-NH3+ es:

−𝑁𝐻2
7 = 9.2 + log ( )
−𝑁𝐻3+

−𝑁𝐻2
−2.2 = log ( )
−𝑁𝐻3+
−𝑁𝐻2
= 6.31 × 10−3
−𝑁𝐻3+
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3. Considerando el aminoácido identificado por usted (tentativamente), construya un gráfico de

titulación de 5 mL de solución 0,1M del aminoácido X (disuelto en HCl 0.1M), considerando que
adiciona alícuotas de 1 mL de NaOH 0,05M hasta pH 12,5. Compárela con la curva experimental.
Analice resultados.

Figura 4. Curva de titulación teórica de la Histidina.

La curva teórica muestra claramente los saltos de pH en cada una de las regiones en donde el pKa se
vuelve diferente, a diferencia de la experimental en esta se puede observar mejor el cambio abrupto
de pH, aunque de igual forma ambas gráficas son muy semejantes en cuanto al rango de pH de
cambio, por tanto, se puede decir que el error experimental fue muy pequeño y las mediciones
tomadas se acercaron mucho al valor teórico de la Histidina.

4. Utilizando la gráfica de la curva de titulación para el aminoácido, dibuje las estructuras del
aminoácido identificado, a pH 1,5, en pI, y a pH 12,5.
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Figura 5. Curva de titulación de la Histidina con las respectivas especies ionizada a diferentes
valores de pH.
5. ¿Pueden comportarse los aminoácidos como un buffer intracelular? ¿Por qué? ¿En qué rangos de
pH? Argumente su respuesta. Tenga en cuenta el rango de valores del pKa de los grupos carboxilo y
amino de los 20 aminoácidos.
Un aspecto fundamental en la fisiología de todos los organismos es la capacidad para mantener una
situación de equilibrio dinámico favorable. En este fenómeno tiene gran importancia los sistemas
amortiguadores que equilibran la presencia de sustancias ácidas y básicas para mantener el pH dentro
de los límites fisiológicos; en humanos los valores extremos compatibles con la vida y con el
mantenimiento de funciones vitales oscilan entre 6,8 y 7,8; siendo el estrecho margen de 7,35 a 7,45
el de normalidad. Una de las maneras en la que se puede regular el pH dentro de los límites
compatibles con la vida es mediante los tampones fisiológicos. Los aminoácidos son excelentes
amortiguadores, gracias a la capacidad de disociación del grupo carboxilo, del grupo amino y de otros
grupos ionizables de sus cadenas laterales. Los grupos ácido-base débiles presentan una capacidad
tamponadora máxima en la zona próxima al pKa. Aunque vale destacar que los valores de pKa
calculados para los AA en disolución pueden verse ligeramente modificados en el entorno proteico.
6. ¿Cómo separaría los aminoácidos R, H, D y E de una mezcla a pH 7?
Variando el pH de la mezcla, ya que este es un factor determinante de la solubilidad de cada
aminoácido; cuando el pH es mayor o menor al punto isoeléctrico, la molécula del aminoácido está
cargada y las moléculas de agua interaccionan con la carga, provocando la solubilidad de éste, pero
a valores de pH próximos al PI, dichas interacciones son mínimas, de modo que se produce la
precipitación del AA.
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Inicialmente, ya que el punto isoeléctrico de la Histidina (H) es 7.6, es probable que se pueda observar
el precipitado de ésta y se separe de la mezcla. Seguidamente se bajaría el pH hasta valores próximos
a 3, provocando la precipitación del ácido glutámico (E), ya que su PI = 3.15, y con una mínima
disminución se precipitaría el ácido aspártico (D) ya que su PI = 2.85. De este modo, solo quedaría
la Arginina (R) en el recipiente.