TCNICAS DE VISUALLIZACIN MICROORGANISMOS. EXAMEN EN CLASIFICACIN Y APLICACIONES.

MICROSCPICA DE FRESCO. TINCIONES:

1.- TECNICAS DE VISUALIZACION MICROSCOPICA DE MICROORGANISMOS 1.1.INTRODUCCION. EXAMEN DE LOS MICROORGANISMOS VIVOS. 1.1.1.- EXMEN EN FRECO 1.1.1.1.- PREPARACIONES HMEDAS. 1.1.1.2.- PREPARACION DE LA GOTA PENDIENTE. 1.1.1.3.- EXAMEN EN FRESCO CON NIGROSINA 1.1.2.- COLORACIONES VITALES 2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS. 2.1.- FASES DE LAS TINCIONES 2.1.1.- CONFECCIN DEL FROTIS 2.1.2.- SECADO. 2.1.3.- FIJACIN. 2.1.4.- COLORACION. 2.1.5. LAVADO Y SECADO. 2.2.- CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES 2.2.1.- TINCIONES SIMPLES 2.2.2.- TINCIONES DIFERENCIALES. 2.2.2.1.- GRAM. 2.2.2.2.- ZHIEL-NEELSEN 2.2.3.- TINCIONES ESTUCTURALES. 2.2.3.1.- TINCIONES DE FLAGELOS. 2.2.3.2.- TINCION DE ESPORAS 2.2.3.3- TINCION DE CAPSULAS 2.2.3.4.TINCION DE METACROMTICOS. 3.- TINCIONES ESPECIALES 3.1.- TINCION DE NARANJA DE ACRIDINA 3.2.- TINCION DE RODAMINA-AURAMINA. 3.3.- TINCION DE CALCOFLUOR

CORPUSCULOS

1.- TECNICAS DE MICROORGANISMOS

VISUALIZACION

MICROSCOPICA

DE

1.1.- INTRODUCCION. EXAMEN DE LOS MICROORGANISMOS VIVOS. EL examen microscpico nos informa de la presencia o no de las bacterias, de su morfologa, de sus caractersticas tintoriales etc. Es el primer paso que nos permitir orientar el resto del examen para una perfecta identificacin del agente etiolgico de la enfermedad. Para el estudio microscpico de los microorganismos, existen mtodos muy diferentes, cada uno de los cuales nos va a proporcionar informacin sobre distintos aspectos y propiedades de los microorganismos. Dependiendo del objetivo que se pretenda alcanzar, se seleccionar un mtodo u otro. Se denomina observacin vital, al tipo de examen que se utiliza para la investigacin de los caracteres principales del microorganismo (movilidad bacteriana, morfologa, estructura, observacin de huevo, etc.). Los mtodos que se emplean para este tipo de examen son: Examen en fresco: Preparaciones hmedas. Mtodo de la gota pendiente Examen en fresco con nigrosina Coloraciones vitales. 1.1.1.- EXMEN EN FRECO La mayor parte de estas observaciones se realizan mediante la microscopia de campo claro, aunque la utilizacin de microscopia de contraste de fases, puede facilitar la visualizacin de los microorganismos. Las preparaciones deben de obtenerse de material clnico fresco o de cultivos recientes (24 horas) y realizados en medios adecuados. Muestras como sedimentos urinarios, esputos o exudados pueden utilizarse directamente, mientras que si el material es demasiado espeso se puede diluir con solucin salina estril. La preparacin se observa al microscopio con objetivo de inmersin y con poca intensidad de luz para facilitar la observacin microscpica 1.1.1.1.- PREPARACIONES HMEDAS. Se obtienen colocando una gota de liquido que contienen los microorganismos sobre un portaobjetos (limpio y seco), sobre el que recoloca un cubreobjetos. Si se parte de un producto slido, se deposita primero una gota de agua estril o solucin salina 2

estril sobre el portaobjeos, para posteriomente, con ayuda del asa de siembra (Previamente flameada y enfriada) realizar una suspensin del producto. 1.1.1.2.- PREPARACION DE LAGOTA PENDIENTE. Se utilizan portaobjetos especiales con una o varias excavaciones, se coloca una gota de la suspensin en el centro de un cubreobjetos (limpio y seco) con un asa previamente estril. A continuacin, recoloca el porta sobre el cubreobjetos, de forma que la gota queda suspendida con el centro de la excavacin. Despus se le da la vuelta rpidamente al portaobjetos manteniendo el cubre en su posicin. El tamao de la gota debe de ser el adecuado, para evitar una rpida evaporacin, y lo suficientemente pequea para evitar un contando con el portaobjetos. 1.1.1.3.- EXAMEN EN FRESCO CON NIGROSINA Mediante este mtodo, se obtienen imgenes en las que se destacan las bacterias. 1.1.2.- COLORACIONES VITALES Se definen como montajes de materia viva teidos, suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro, verde de Jano) a muy bajas concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es el de facilitar la observacin, mediante el colorante, la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS. Este tipo de de preparaciones con las mas frecuentes, tanto las obtenidas directamente a travs de muestras clnicas como las obtenidas a partir de cultivos bacterianos. 2.1.- FASES DE LAS TINCIONES Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y coloreada son: confeccin del frotis, secado, fijacin y coloracin. 2.1.1.- CONFECCIN DEL FROTIS Puede preparase a partir de productos lquidos o slidos: Productos slidos, se pasa sobre la superficie del portaobjetos el hisopo con el que se ha tomado la muestra. Tambin se puede preparar una suspensin del material en una gota de agua o solucin salina previamente colocada en el portaobjetos. Productos lquidos, para la preparacin del frotis, se coloca sobre el portaobjetos una gota del material y se extiende con el asa de siembra. 2.1.2.- SECADO. Se dejara secar el frotis a temperatura ambiente. Para ello, se puede agitar varias veces el porta al aire hasta comprobar su secado. 2.1.3.- FIJACIN. Tiene como objeto la inmovilizacin de las estructuras del material a estudiar en un estado lo ms prximo al estado vivo. Las formas ms habituales de fijacin son: Por el calor, se pasa varias veces, la parte inferior de la preparacin por la llama azul de un mechero BUNSEN, hasta que se note caliente al colocarlo en el dorso de la mano, sin que queme. Alcohol en fri, se cubre la preparacin con etanol o metanol. Se deja actuar durante varios minutos, se escurre y se deja secar. 2.1.4.- COLORACION. Es el proceso de coloracin de los microorganismos, para teirlos existe un gran nmero de productos qumicos con propiedades colorantes. Su eleccin est condicionada al tipo de tincin a realizar. 2.1.5. LAVADO Y SECADO. El lavado es la eliminacin del exceso de colorante. Para el lavado se utilizar el frasco lavador, teniendo precaucin de no dirigir

el chorro directamente al frotis. El secado se sita la preparacin en posicin inclinada y al aire. 2.2.- CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES Se sigue la siguiente clasificacin, especificidad: Tinciones simples Tinciones diferenciales Tinciones estructurales atendiendo a su

2.2.1.- TINCIONES SIMPLES Las tinciones simples son aquellas en las que se utilizan un solo colorante y tienen como objetivo permitir la observacin de la morfologa bacteriana. Existen dos clases, azul de metileno y verde malaquita. 2.2.2.- TINCIONES DIFERENCIALES. Son aquellas que permiten diferenciar a las bacterias atendiendo a su afinidad por el colorante (se emplean dos tipos de colorante), tenemos dos tipos GRAM y ZHIEL-NEELSEN. 2.2.2.1.- GRAM. Esta coloracin fue desarrolladas, en 1983, por Christian Gram y es la coloracin diferencial mas utilizada en microbiologa Por medio de ella, se dividen a los microorganismos en dos grandes grupos, grampositivos y gramnegativos, segn retengan o no el primer colorante (cristal violeta) utilizado en la tincin. El fundamento de esta tcnica es tratar a las bacterias una vez realizado el frotis correspondiente con cristal violeta y una solucin de yodo, todas ellas se van a teir de un color violceo, al unirse el colorante al yodo de la pared celular. Si a continuacin se les trata con una solucin de decolorante (alcohol-cetona), las bacterias grampositivas retendrn el colorante, debido a la composicin de su pared, mientras que las gramnegativas no lo retienen, siendo eliminado el colorante. Si a continuacin, se les trata con un colorante de contraste (fucsina diluida, tambin se puede emplear safranina), las bacterias gramnegativas sern teidas por l. La tincin Gram, puede utilizarse no solo para bacterias procedentes de las colonias aisladas, sino para el examen directo de muestras clnicas, de tal modo que se puede evaluar la flora que predomina en esa muestra. En la tincin de Gram, se forma un complejo de cristal de iodo insoluble en el interior de la clula, que en el caso de las Bacteria Gram negativas puede extraerse con alcohol pero no en las Bacteria 5

Gram positivas. El alcohol deshidrata las bacterias Gram positivas que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano. El resultado es el cierre de los poros de las paredes impidiendo el escape del complejo de cristal de iodo insoluble. En las Bacteria Gram negativas, el alcohol penetra rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos sin que la fina capa de peptidoglicano evite el paso del solvente, permitiendo de este modo la eliminacin del complejo de cristal de iodo insoluble. No obstante, la reaccin de Gram no se relaciona directamente con la qumica de la pared celular puesto que las levaduras que poseen una gruesa pared celular pero una composicin qumica completamente distinta, tambin se tien como Gram positivas. Por lo tanto, el motivo de una reaccin Gram positiva no son los constituyentes qumicos sino la estructura fsica de la pared. Reactivos: Cristal violeta Lugol Alcohol-cetona Safranina Tcnica Preparar los frotis bacterianos. Teir con cristal violeta 2 min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1 min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30 segundos) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teir con fucsina bsica 5 min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin. Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (grampositivas y gramnegativas) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables.

Se observa al microscopio con objetivo de 40x, los bacterias grampositivas, se teirn con el primer colorante (cristal violeta), mientras que las gramnegativas lo harn de color rojo (Safranina). 2.2.2.2.- ZHIEL-NEELSEN La tincin del Zhiel-Neelsen o de Bacilos cido Alcohol Resistentes (BAAR) se utiliza para diferenciar las bacterias cido alcohol-resistentes de las que no lo son, esta diferenciacin viene dada por la existencia de un componente en la pared de la bacteria (cido teicoico, es un cido graso de cadena larga) que permite soportar la decoloracin cida de la tincin. Esta tincin requiere un previo calentamiento del frotis, para que el colorante pueda atravesar la pared de la bacteria y se quede fijado a los componentes de ella. Reactivos: Fucsina fenicada de Zhiel-Neelsen Solucin de decolorante alcohol clorhdrico Azul de metileno fenicado. Tcnica Una vez preparado y fijado el frotis por calor, se cubre con la fucsina fenicada y se caliente mediante una llama, hasta la emisin de vapores. Se lava con agua destilada. Se cubre el portaobjetos con la solucin decolorantes durante un minuto y se escurre el porta. Se lava con agua y se elimina el exceso. Se cubre con el colorante de contraste y se deja actuar un minuto Se lava con agua deshilada y se elimina el resto Se seca al aire. Se observa al microscopio con objetivo de inmersin. Los bacilos cido-alcohol resistentes aparecen coloreados en rojo sobre el fondo azul de la preparacin. 2.2.3.- TINCIONES ESTUCTURALES. Son aquellas que utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto distintas estructuras bacterianas. Existen distintos tipos: flagelos, esporas y cpsulas y corpsculos metacromticos. 2.2.3.1.- TINCIONES DE FLAGELOS. Para su observacin, se debe de partir de cultivos jvenes (6 y 12 horas). En la preparacin del frotis, deben de emplearse portaobjetos nuevos, limpios y tratados con una mezcla sulfocrmica 7

y perfectamente aclarados con agua destilada. Existen tres tipos de tinciones: Rhodes, Tribondeau y Leifson. Rhodes: Los reactivos son el mordiente de Rhodes y el nitrato de plata amoniacal. Los flagelos se pueden observar gracias al precipitado negro que se ha depositado en torno a la estructura. Tribondeau. Como reactivos se emplean el mordiente de Tribondeau y solucin violeta de cristal, la visualizacin de los flagelos es de de color castao. Leifson. Como colorante se unas el Leifson., los flagelos se observan de color rojo a azulnegruzco. 2.2.3.2.- TINCION DE ESPORAS Las esporas son la forma de resistencia de las bacterias, tienen forma esfrica u oval. Al microscopio sin teir, presentan una estructura de granulo brillante. Segn la localizacin de la espora puede ser: central subterminal y terminales (en el centro, prxima al extremo y al final del extremo de la bacteria), lgicamente la esporas solo lo formaran estructuras bacilares. Existen dos tipos de tinciones: Moeller y Wirtz-Conklin. Moeller Como reactivos se emplean, solucin acuosa 5% de cido crmico, fucsina fenicada de Zhiel-Neelsen, solucin acuosa de clorhidrato de anilina 5%, solucin de azul de metileno y alcohol absoluto.Las esporas se observan con objetivo de inmersin y se visualizando color rojo o rosado y las bacterias de color azul. Wirtz-Conklin Los reactivos empelados son, solucin acuosa de verde malaquita 5% y solucin acuosa de safranina al 0,5%. Se observaron objetivo de inmersin y las esporas e habrn teido de verde y las bacterias de color rojo intenso. 2.2.3.3- TINCION DE CAPSULAS La cpsula es una capa mucosa, ms o menos gruesa que envuelve la pared celular o de algunas bacterias. Esta compuesta de polisacridos, mucopolisacridos o polipptidos. A consecuencia de su elevado contenido en agua, se tien dbilmente por los colorantes. Hay dos tcnicas Hiss y tinta china 8

Hiss. Como reactivos se emplean solucin acuosa de cristal violeta 1% y solucion acuosa de sulfato de cobre 2%.Las cpsulas se observancion objetivo de inmersin y las cpsulas se visualizaran de azul plido y las bacterias de color prpura y el fondo claro. Tinta china. Cono reactivos tenemos, solucin de fucsina diluida y nigrosina o tinta china. Se observa al microscopio con objetivo de inmersin y se visualizan las bacterias teidas de rojo por la fucsina y la cpsula ser un halo blanco que las envuelve. 2.2.3.4.- TINCION DE CORPUSCULOS METACROMTICOS. Los corpsculos metacromticos son unas estructuras en cuyo interior llevan fosfato, presentando la particularidad que son muy afines por colorantes de tipo bsico .Las tinciones empleadas son dos, Albert y Loefller. Albert. Como reactivos tenemos, solucin de lugol y colorante de Albert, se observa la extensin con objetivo de inmersin y los corpsculos metacromticos se vern de color oscuro sobre el cuerpo bacteriano ms claro. Loeffler. Los reactivos empleados son, solucin de azul de metileno de Loeffler, los grnulos se vern de azul intenso, sobre el fondo de la clula azul mas claro.

3.- TINCIONES ESPECIALES Este tipo de tinciones se emplean para visualizar ciertas estructuras bacterianas afines con colorantes fluorescentes, es decir con aquellos colorantes estructuras (fluorocromos) que al excitarse con luz ultravioleta excitan ciertas molculas que al volver a su estado normal liberan ese estado de energia como luz visible. Como tinciones fluorescentes ms empleadas tenemos: Naranja de Acridina y coloracin de rodamina-auramina. 3.1.- TINCION DE NARANJA DE ACRIDINA Esta tincin se utiliza principalmente para el estudio de microorganimos en hemocultivos y liquido cefalorraquideo (LCR), el colorante presenta una gran afinidad por el cido nucleico bacteriano. 3.1.1.- TECNICA Como reactivos se emplean Naranja de Acridina al 0,01% en tampn de acetato de pH 4, el procedimiento es el siguiente: se extiende y se seca la preparacin. se fijan los frotis con metanol o por calor. se cubre la preparacin con el colorante y se deja durante dos minutos se lava con agua se seca al aire. se examina la preparacin con objetivo de inmersin en microscopio de fluorescencia. Las bacterias presentan un color naranja brillante sobre un fondo verdoso u oscuro. 3.2.- TINCION DE RODAMINA-AURAMINA. Los fluorocromos auramina y rodamina tienen la propiedad de fijarse a las paredes celulares de las micobacterias, que aparecern de color amarillo o naranja brillante sobre un fondo verdoso. Se utiliza, adems un colorante de contraste (permanganato potsico) que tiene como funcin evitar la fluorescencia inespecfica. 3.1.2.- TECNICA. Como reactivos reemplean: solucin colorante rodaminaauramina, solucin de colorante, colorante de contraste. El procedimiento es el siguiente: se cubre la preparacin con el colorante auramina-rodamina, durante quince minutos se lava con agua destilada se cubre la preparacin con solucin decolorante (alcohol clorhdrico) dejndose actuar durante dos o tres minutos. 10

se lava con agua destilada se cubre la preparacin con el colorante de contraste y se deja actuar durante tres o cuatro minutos. se lava y se deja secar al aire. Se observa a microscopia de fluorescencia, las bacterias cido alcohol resistentes aparecen de color amarillo-naranja sobre un fondo verdusco. 3.3.- TINCION DE CALCOFLUOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

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