REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA Asignatura: Biologa Molecular

GUA DE ESTUDIO Unidad II GENOMA EUCARIOTA

Prof. Lorena Atencio - MSc.

Marzo 2008

Introduccin.

2 El estudio del genoma eucariota a pesar de haber alcanzado gran avance en los ltimos aos, sobre todo con la secuenciacin del genoma humano, aun sigue siendo una gran incgnita, sobre todo en lo referente a la regulacin de la trascripcin de todos los genes. No obstante se tiene un amplio conocimiento de las caractersticas estructurales de los cromosomas, genes y secuencias, as como de ejemplos de muchos de ellos, razn por la cual es de gran importancia estudiar estas caractersticas. Esta gua de estudio est dirigida a los estudiantes de las Maestras en Microbiologa y Biologa, mencin Inmunologa Bsica, especficamente como una materia obligatoria de este programa de postgrado. Orientacin didctica. La presente gua de estudio est ordenada de la siguiente forma: Primero se enumeran las caractersticas mas resaltantes del genoma eucariota, haciendo hincapi en las secuencias funcionales y sin funcin conocida de los genes de copia nica, al igual que las secuencias repetidas y sus ejemplos. Luego se describen los transposones eucariotas y sus ejemplos, as como los retrotransposones. En base a la complejidad del ADN se describe la llamada paradoja del valor c, y las caractersticas que presentan los genes interrumpidos. Por ultimo, se describe el genoma mitocondrial humano como ejemplo de genoma extra-nuclear en eucariotas. OBJETIVOS. 1. Sealar las caractersticas ms resaltantes del genoma eucariota. 2. Sealar los tipos de secuencias que pueden encontrarse en el genoma eucariota. 3. Definir los Elementos mviles en eucariotas. 4. Definir curvas COT, sealando su importancia. 5. Estudiar los genes interumpidos sealando su importancia. 6. Describir los elementos extra nucleares mas comunes en eucariotas. 7. Sealar las caractersticas de la gentica mitocondrial. El genoma eucariota presenta caractersticas muy importantes que debemos recordar: 1. Presenta una membrana nuclear, que define la compartamentalizacin, que sealar la separacin de los procesos que all se realicen. 2. Existe una cantidad de DNA variable. 3. El DNA est organizado en cromosomas, unido a protenas llamadas histonas. 4. El nmero de cromosomas es variable. 5. Los genes pueden estar interrumpidos y la integridad modificada. Pueden haber una o varias copias de una secuencia en particular, y

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3 estas pueden estar ubicadas en grandes bloques de DNA que no codifican para protenas. 6. Dada la existencia de un ncleo se observa divisin celular y nuclear, por lo que la expresin de los genes ha de ser distinta. 7. Dada la complejidad del proceso hay que aclarar: a) Nmero de genes y b) Tipos de genes a) Definiendo el nmero de genes en trminos de nmero de protenas codificadas, por supuesto, el genoma contiene secuencias regulatorias que actan en cis. b) Si un gen es esencial o no. Qu le sucede a un mutante que le falta un gen funcional?. Si es letal o se observa defecto se puede concluir que el gen es esencial o al menos confiere una caracterstica selectiva. Cmo explicamos la existencia de genes no indispensables?, Por qu no limitan el curso de la evolucin?. En el genoma eucariota podemos conseguir diferentes tipos de genes: Aquellos que se presentan como Genes de copia nica y aquellos Genes que se presentan en ms de una copia. Dentro de los Genes que se presentan en ms de una copia, puede hacerse una sub-clasificacin: a) Secuencias funcionales 1. Familias de genes que codifican productos (y pseudogenes relacionados). 2. Familia de genes dispersos 3. Familia de genes dispuestos en tndem 4. Secuencias funcionales que no cifran producto b) Secuencias sin funcin conocida 1. Repeticiones presentes en la heterocromatina centromrica. 2. Repeticiones en tndem de nmero variable (VNTRs) 3. Secuencias derivadas de transposicin 1. Transposones que se desplazan como DNA 2. Elementos retrotransferibles 3. Secuencias relacionadas con retrovirus c) DNA separador Vistos desde el punto de vista de sus exones, pocos genes estn solos en el genoma eucariota. Si realiza una hibridacin para identificar un gen especfico, probablemente se encuentren otras copias relacionadas. Si se estudian las protenas codificadas en los mismos, probablemente se encuentren que tambin estn relacionadas, pero pueden cumplir funciones diferentes. Cuando esto se observa hablamos de Familias de Genes. Los miembros de familias de genes estructurales usualmente tienen funciones relacionadas o idnticas, aunque ellos pueden ser expresados en tiempos diferentes o en diferentes tipos de clulas.
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4 Dentro de las secuencias repetidas funcionales se encuentran las Familias de genes dispersos, las Familias de genes dispuestos en tndem y las secuencias funcionales que no codifican ningn producto. 1. Familias de genes dispersos. Varios tipos de protenas estn codificadas en familias de genes homlogos distribuidos por todo el genoma. Tales familias pueden estar compuestas por solo unos pocos genes o por muchos de ellos. Ejemplos. Actinas (5 a 30 genes), Queratinas (> 20), tubulinas (3 a 15), globinas (hasta 5), protenas de la envoltura del huevo de insectos (50), histonas (100 a 1000). En este caso las secuencias exactas de nucletidos pueden variar, por ejemplo las globinas humanas, y los distintos genes homlogos pueden llegar a tener funciones ligeramente diferentes. Algunos genes de familias han llegado a perder su funcin, dando origen a los pseudogenes no transcritos. 2. Familias de genes dispuestos en tndem. La clula requiere gran cantidad de productos de ciertos genes, llegando a formar familias de estos genes dispuesto en tndem. El ejemplo ms estudiado es el organizador nucleolar (NO). En los aos 60, se sugiri que los Nos podran ser agrupaciones en tndem de genes que cifran ARNr. Mediante hibridacin de ARNr radiactivo con cantidades conocidas de DNA homlogo al ARNr, se encontr una relacin lineal entre el Nos por clula y la cantidad de ARNr 18S y 28S que hibridaba, indicando as que los loci del ARNr se encuentran codificados en

Familia de genes dispersos (Globina) los NOs. Un NO humano contiene unas 250 copias del ARNr. Otro ejemplo que cumple las mismas caractersticas son los genes de los ARNt. Existiendo en el hombre unos 50 sitios cromosmicos que corresponden a distintos tipos de ARNt y en cada uno de ellos se encuentran de 10 a 100 copias de esos genes. Otro ejemplo muy estudiado es el de las histonas. 3. Secuencias funcionales que no cifran un producto. Los telmeros, puntas de los cromosomas, estn formados por copias en tndem de
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5 secuencias sencillas de DNA que no cifran un ARN o una protena, pero no obstante, cumplen una funcin definida. En el hombre esta secuencia es TTAGGG. Las terminaciones telomricas estn all para resolver un problema funcional inherente a la replicacin de las molculas lineales de DNA. Dentro de las secuencias sin funcin conocida, se incluyen secuencias de DNA de las que, en general, existen muchas ms copias por genoma que de las secuencias funcionales. El tamao combinado de esta clase de DNA es sorprendente, se calcula, que alrededor del 20% del genoma humano consiste en estas secuencias. Aqu se encuentra el DNA centromrico muy repetido, las VNTRs y las secuencias derivadas de transposicin. 1. DNA centromrico muy repetido. Es un tipo de DNA satlite, que puede consistir en mltiples repeticiones en tndem de secuencias cortas de DNA que llegan a alcanzar una longitud de centenares de kilobases. La mayora del DNA satlite resulta estar localizado en las regiones heterocromticas que flanquean a los centrmeros. Pueden haber una o varias unidades bsicas, pero normalmente su longitud no es mayor de 10 bases. 2. VNTRs. Una clase especial de repeticiones en tndem que muestra variacin del nmero en distintos loci y en distintos individuos. Las repeticiones en tndem de nmero variable en humanos estn formadas por tramos de 1 a 5 Kb, construidos por un nmero variable de una unidad repetida de 15 a 100 nucletidos de largo. 3. Secuencias derivadas de transposicin. Aqu se incluyen aquellos que se consideran verdaderos transposones y los que corresponden a los retrotransposones. Los elementos mviles se propagan en eucariotas como en procariotas. El background gentico de eucariotas incluye una variedad de elementos que poseen la habilidad de moverse, seleccionando nuevas localizaciones dentro del genoma en el cual reside. Se asume que transportan los genes necesarios para la transposicin, no se conoce si transportan informacin adicional sobre funciones no relacionadas con el propio evento de la transposicin. a. Transposones genuinos. Comparable al transposon en bacterias. Emplean mecanismos que capacitan a las secuencias de DNA para moverse directamente o por generacin de copias del genoma. Los elementos terminan en cortas secuencias repetidas invertidas y generan cortas secuencias repetidas directas en el DNA blanco donde se han insertado. Como los transposones en bacterias, estos elementos no tiene vida fuera del genoma. Si los componentes valorables juegan un papel en la supervivencia celular o como parsitos, no se sabe, funcionan solo para su propia supervivencia. Ellos no tiene existencia independiente y no generan molculas de DNA libres. Ejemplo ms conocido el transposon del Maz b. Elementos retrotransponibles. El paradigma de otro tipo de evento de transposicin es la habilidad de los retrovirus para insertar copias del DNA (Provirus) de un genoma viral de RNA dentro del cromosoma de la clula hospedadora.
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6 TRANSPOSONES EUCARIOTAS En eucariotas, los elementos de clase I ms conocidos a nivel molecular son los del maz y los de Drosophila porque son los ms estudiados desde hace ya varias dcadas. Al igual que en procariotas, estos transposones se han encontrado en prcticamente todos los genomas donde se han encontrado. Maz En el maz, los ms conocidos pertenecen a las familias En/Spm (enhancer/Supressor-mutator) y Ac (Activator). Son transposones relativamente sencillos, no muy diferentes a los de una IS bacteriana y tienen repeticiones invertidas en los extremos. Adems tambin hay elementos defectivos de las dos familias, conocidos como dSpm y Ds. Estas copias defectivas pueden ser complementarias en trans por sus patrones silvestres. Algunos elementos defectivos Ds pueden funcionar como intrones, y por lo tanto, ser eliminados del mRNA. Este detalle probablemente los emparienta con los intrones, especialmente por los intrones mviles descritos por Bernard Dujon.

Drosophila Alrededor del 10% del genoma de Drosophila podra estar compuesto de secuencias de DNA repetitivas que se mueven como elementos discretos. Se han caracterizado tres tipos de transposones: los elementos P, copia-like y FB. Elementos P En Drosophila, los transposones ms intrigantes y tiles para los genetistas son los elementos P, que fueron descubiertos como resultado del estudio de la DISGNESIS HBRIDA, un fenmeno que ocurre cuando hembras de laboratorio son cruzadas con machos de poblaciones naturales. En estos cruces, las hembras tienen un citotipo M (sin transposasa ni su receptor), y los machos un citotipo P (con transposasa y su respectivo receptor). hembras M F1 : estriles La progenie muestra un sorprendente fenotipo que se manifiesta en la clulas germinales, incluyendo esterilidad, un alto nivel de mutacin, y una alta frecuencia de aberraciones cromosmicas y no disyuncin. Esta progenie hbrida es disgnica, o biolgicamente deficiente ( de aqu la expresin disgnesis hbrida ). A la vez, el cruce recproco de hembras P x
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machos P

7 machos M no produce disgnesis. Un alto porcentaje de los disgnicos induce mutaciones inestables, por ello revierten a un fenotipo salvaje o a otros alelos mutantes de frecuencia alta. Esta inestabilidad es restringida a la lnea germinal de citotipo M. Esto confirma la hiptesis de que las mutaciones son causadas por la insercin de DNA forneo en genes especficos, hacindolos inactivos. De acuerdo con esta hiptesis, la reversin resultara de la espontnea escisin de las secuencias insertadas. Esta observacin ha sido probada en el locus white de Drosophila, dando lugar a un cambio de color en los ojos. La slida explicacin de la disgnesis hbrida es que los elementos P tienen a la vez productos de transposasa y Prepresores. La transposasa es responsable de la movilizacin de los elementos P, mientras que el represor previene la produccin de la transposasa, bloqueando la transposicin del elemento. En el citotipo P, el nmero elevado de copias provoca una abundante produccin del represor, as que los elementos P son movilizados. Por esta razn, en el cruce de la disgnesis hbrida al no haber represor (citotipo M) se sintetiza mucha transposasa, ms que represor, y se moviliza por todo el genoma, entrando un cierto nmero de copias del elemento P en el vulo, causando dao que se manifiesta en la disgnesis hbrida. A parte de esto, los elementos P son la mayor herramienta para los gentica moderna de Drosophila, usados para etiquetar genes para clonacin e insertar genes transgnicamente.

Elementos copia-like Los elementos copia-like constituyen como mnimo siete familias,, de tamao entre 5 y 8.5 Kb. Aparecen de 10 a 100 posiciones y su estructura es similar a Ty de levaduras. Estos elementos pueden causar una duplicacin o insercin de un nmero caracterstico de pb. Por ejemplo, la mutacin whiteapricot para el color de los ojos es causado por la insercin de un elemento de esta familia en el locus white. Elementos FB Los elementos FB oscilan entre un tamao de 100 a 1000 pb. Estos elementos tienen secuencias homlogas, pero tambin tienen secuencias diferentes. Tambin poseen repeticiones invertidas en los extremos. A veces, todo el elemento consiste en repeticiones invertidas, pero una
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8 secuencia central separa las repeticiones en otros elementos. En cada caso, los FB pueden "fold back" (plegarse) sobre s mismos, de ah su nombre FB. Algunos FB pueden "saltar" del genoma y promover reordenaciones cromosmicas, de hecho, varias mutaciones en Drosophila son causadas por inserciones de FB interrumpiendo la secuencia. Mamferos Aqu es donde entra en escena la basura gentica que constituye el 95% del genoma humano. La mayor parte de esta basura es una autntica ruina: residuos de virus y transposones inactivados hace ms de 40 millones de aos. Pero hay una excepcin llamada Alu. Los Alu son pequeos transposones, de poco ms de 300 bases de longitud. Hay cerca de un milln de ellos en el genoma, y muchos siguen vivos: todava se les puede sorprender saltando. A diferencia de los otros transposones, los Alu tienden a insertarse en la proximidad de los genes. Y tienen la curiosa propiedad de activarse en respuesta a ciertas seales muy comunes en las clulas, incluidas algunas hormonas, y de extender su activacin a los genes adyacentes. Cientficos como Wanda Reynolds, del Centro Sidney Kimmel de San Diego (EEUU), han propuesto que los Alu pueden ser una fuente esencial de variabilidad evolutiva. Sus saltos pueden poner muchos genes dispersos por el genoma bajo un nuevo control que los active un poco ms, un poco menos o un poco ms tarde. Nunca falta quien tira un diamante a la basura. Ni quien lo encuentra. RETROTRANSPOSONES Los retrotransposones son elementos que se transponen mediante RNA, donde participa la TRANSCRIPTASA INVERSA. Por ahora, no podemos considerar a la retrotranscripcin como un proceso universal, ya que de momento, pertenece a eucariotas. Hay dos tipos de superfamilias como indica la clasificacin. En la superfamlia viral se incluyen los retrovirus y los retrotransposones derivados de stos o emparentados con ellos. SUPERFAMLIA VRICA

Los retrovirus son virus de RNA de cadena sencilla que pueden fabricar copias de DNA a partir de su RNA a travs del enzima transcriptasa inversa. El genoma de RNA de los retrovirus acaba en repeticiones directas y el proceso de retrotranscripcin los convierte en repeticiones terminales largas (LTR), parecidas a repeticiones invertidas de los transposones de
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9 clase. Estas LTR permiten que el DNA lineal y bicatenario funcione como un transposn y se inserte en el genoma husped. Los retrovirus son una fuente importantsima de reordenaciones cromosmicas, y algunos como el MMTV o el RSV son responsables de la induccin de tumores cancergenos. Cuando el DNA se ha integrado el cromosoma husped, estos retrovirus se denominan provirus. Los provirus pueden ser considerados elementos transponibles porque tienen el poder de transposarse de un lugar a otro. Por otro lado, similitudes entre retrovirus y Ty de Saccharomyces cerevisiae, retrotransposn de 6 Kb, con repeticiones terminales directas de 330 pb, y los elementos copia like de Drosophila sugieren que stos ltimos son formas integradas de retrovirus-like. Otro ejemplo son las secuencias LINE (long interpsersed elements) de mamferos de 1 a 5 Kb presente entre 20.000 y 40.000 copias por genoma humano que carecen de secuencias repetidas terminales. SUPERFAMLIA NO VRICA Los elementos de la superfamlia no vrica no tienen repeticiones terminales y no codifican protenas de transposicin. Es decir, no tienen funcin conocida. Los miembros ms conocidos son las secuencias SINE (short interspersed sequences), como por ejemplo, las secuencias Alu de primates. Se denomina as porque contiene una diana para la enzima de restriccin Alu. El genoma humano contiene cientos de miles de secuencias Alu enteras y parciales, dispersas entre genes y sin intrones, y constituyen el 5 % del DNA humano. Toda la secuencia posee alrededor de unas 300 pb y tienen un gran parecido al 7SL RNA (un RNA que es parte de un complejo por el que se sintetizan polipptidos y se excretan al retculo endoplasmtico). Presumiblemente, las secuencias Alu se originaron como transcritos inversos de estos RNA. Otro ejemplo de esta clase son los pseudogenes que han sido creados por la transcripcin inversa, porque no contienen los intrones que normalmente contiene un gen funcional, es decir, carecen de intrones. Estos ejemplos son considerados como DNA repetitivo.

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La existencia de DNA sin funcin conocida es un dilema para los genetistas. Basndonos en el fenmeno de la seleccin natural el DNA no funcional (al que podramos caracterizarlo, pues, de DNA basura) sera purgado por seleccin. Por lo tanto, es de imaginar que es una carga gentica, pero este no es un trmino adecuado. Quizs la funcin es un tipo de lastre gentico que da volumen al cromosoma para permitir una eficiente divisin o quizs para separar genes para su perfecta regulacin. Al mismo tiempo este DNA repetitivo podra haber conseguido una forma de evitar la deteccin por las fuerzas de la seleccin natural. Este DNA ha sido calificado de DNA egosta, un tipo de DNA que slo existe por el hecho de existir y nunca es expuesto a los rigores del fenotipo. CLASIFICACIN DE ELEMENTOS TRANSPONIBLES CLASE I: MEDIANTE DNA Elementos IS (Is1, IS2, IS3, IS30, IS200, etc) Transposones compuestos (Tn5, Tn10, etc) Transposones de la famlia Tn3 Bacterifagos (Mu, lambda, P22, etc) Sistemas de inversin I.II. EUCARIOTAS Elementos controladores del Zea mays (Ac, Mu, Sm, etc.) Elementos P de Drosophila

I.I PROCARIOTAS

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11 CLASE II: MEDIANTE RNA Superfamlia vrica Retrovirus, LINE, Ty, ... II.II EUCARIOTAS Superfamlia no vrica SINE Alu y B1 de mamferos, pseudogenes procesados derivados de la polimerasa II

LA PARADOJA DEL VALOR C El Valor C se define como la cantidad total de DNA en un genoma haploide. Mientras que la Paradoja C se refiere a la incapacidad de contar el contenido del genoma en un trmino de funciones conocidas. Incongruencia, disparidad. Este problema se soluciona si hablamos del genoma mnimo para pertenecer a un grupo determinado, esto si dar una lnea recta. En una curva de reasociacin del DNA de acuerdo a su contenido de nmero de copias se pueden graficar aquellos genes que se presentan en copia nica, los que estn medianamente repetidos y los que estn altamente repetidos. En base a esta informacin se tiene que Cot es el Valor requerido para la mitad de la reasociacin del ADN. El Cot es el producto de la concentracin y el tiempo requerido para procesar la mitad del DNA. Un Cot alto indica una reasociacin lenta. Donde Co es la Concentracin de DNA y t: tiempo de incubacin. El Cot est directamente relacionado con la cantidad de DNA en el genoma. El Cot de una reaccin indica el total en longitud de secuencias diferentes que estn presentes. Estos se describe como complejidad y es usualmente dado en pares de bases (pb). Lo antes expuesto seala que las Curvas Cot Plotean o grafican la fraccin de DNA que esta asociado (1-C/Co) contra el log de Cot. Ejemplo: Genoma de Escherichia coli Cot (DNA de algn genoma) = Complejidad de algn genoma Cot (E. coli) = 4,2 x 106 pb Cot. La reasociacin del DNA es usualmente seguida en la forma de curvas

Lo que confiere complejidad no es el tamao del genoma sino todos y cada uno de sus constituyentes. Cot = 1/k: La reasociacin de una DNA particular puede ser descrito por el Cot (dado en nucletidos-moles x sec/lt) o en la forma de la tasa reciproca de la constante k (en unidades de litro-nucletidos-moles -1. Sec-1). La complejidad de un genoma (DNA) puede ser calculada por comparacin de su Cot con DNA estndar de complejidad conocida.
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12 La reaccin de asociacin gentica de un DNA eucariota muestra 3 tipos de componentes. Un plato separa las primeras 2 fases, pero la 2da y la 3era se solapan ligeramente. Cada una de estas fases representa un componente cintico diferente del genoma: 1. El componente rpido es la primera fraccin en reasociarse. Corresponde al DNA altamente repetitivo, DNA satlites (Forman una banda satlite muy clara en centrifugacin en ClCs, centrmero y telmero), genes con papel estructural. Son utilizados para pruebas de paternidad. Este DNA generalmente consiste de muy cortas secuencias repetidas muchas veces en tandem en grandes grupos. Debido a sus cortas unidades repetidas algunas veces son descritas cono DNA de secuencias simples. Este tipo de componente esta presente en casi todos los genomas de eucariotas superiores, pero sus cantidades son extremadamente variables. 2. La 2da fraccin es llamada componente intermedio, corresponde al DNA medianamente repetitivo. Consiste en una variedad de familias de secuencias que no son exactamente las mismas, pero si estn relacionadas. Los miembros de cada familia consisten en un set de secuencias de nucletidos que son suficientemente similares para renaturalizar con otra. Estn presentes en una variedad de grados de repeticin y con diferentes relaciones internas. Los miembros de esas familias frecuentemente estn esparcidas en una forma ms o menos regular con longitudes cortas de DNA no repetitivo. 3. El componente ms lento es la ltima fraccin en renaturalizarse, corresponde al DNA de copia nica, incluye la mayora de los genes estructurales. La presencia de DNA no repetitivo implica que los grandes genomas no son generados simplemente por incrementos del nmero de copias de la misma secuencia presente en genomas ms pequeos. La habilidad para relacionar secuencias complementarias pero no idnticas para reconocerla de otra puede ser controlada por la rigurosidad de las condiciones impuestas para reasociacin. Una condicin altamente rigurosa es impuesta por ejemplo por un incremento en la temperatura, la cual requiere de un alto grado de complementaridad para permitir el apareamiento de bases. La paradoja C describe nuestra incapacidad de relacionar la cantidad de ADN en el genoma eucariota en trminos de funciones codificadas por protenas necesariamente. Para concluir se puede decir que la Paradoja del valor C expresa dos rasgos definitivos: 1. Hay un exceso de DBA comparado con la cantidad que podra esperarse codifique para protenas. Los genes son ms largos que las secuencias necesarias para codificar protenas. 2. Hay una gran variacin en los valores C, entre ciertas especies cuya aparente complejidad no varia mucho, ejemplo los anfibios. EXPERIMENTO CON HIDROXIAPATITA. Experimento realizado por Britten y Kohne en 1970, que permiti dilucidar los tipos de DNA antes citados. La hidroxiapatita es una forma cristalina del

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13 fosfato de calcio. Las cadenas simples de DNA pasa y no se adhiere a la columna. La doble cadena si se adhiere. Condiciones del experimento: 60C se absorbe poca cantidad de simple cadena de DNA, la doble cadena queda unida. La temperatura est 25C por debajo de la temperatura de disociacin, lo que impide la formacin de dobles cadenas unidas por regiones complementarias muy cortas o muy imprecisas. ESTRUCTURA DE UN GEN EUCARIOTA. INTRONES Y EXONES. PSEUDOGENES. Definiciones. Intrn: Es un segmento de DNA que es transcrito, pero removido dentro del transcrito por splicing o empalme junto a las secuencias que est a su lado (exones). Exn: Es algn segmento de un gen interrumpido que es representado en el producto del RNA maduro (RNAm, RNAr, RNAt). Pseudogenes: Son compuestos inactivos pero inestables del genoma derivados por mutacion de un gen activo ancestral. Los exones son las secuencias representados en el RNA (Pueden ser RNAm, RNAr, RNAt) de tal forma que los exones pueden o no tener una funcin que codifique a una protena. Los intrones son las secuencias de DNA que son reconocidas cuando el transcrito primario es procesado para dar un RNAm. Un gen comienza y termina con exones (correspondientes a los extremos 5y 3del RNA), pero pueden tener un nmero de intrones dentro. Cuando un gen es interrumpido, el mapa de restriccin de su DNA corresponde exactamente con el mapa de su RNAm (RNAmcDNA). Cuando un gen posee un intrn, en el mapa se observa que cada extremo del gen corresponde con los extremos de la secuencia del mensajero. Pero dentro del gen, el mapa diverge. Una regin adicional est presente dentro del gen, que contiene una serie de sitios reconocidos que no estn dentro del mensaje. Ej: mapa de restriccin de la -globina (gen RNAm), se observan dos intrones. Algunos rasgos de los genes interrumpidos: 1. El orden de las partes de un gen interrumpido es el mismo en el genoma como en su RNA maduro. Los genes son separados ms que dispersados. 2. Un gen interrumpido retiene la misma estructura en todos los tejidos, incluyendo la lnea germinal y la lnea somtica en los cuales sean o no expresados. As la presencia de un intrn es un rasgo invariable. 3. Los intrones de genes nucleares generalmente tiene codones de terminacin en todos los marcos de lectura, y no codifican funcin alguna. Los genes interrumpidos estn ausentes solo en genomas eubacteriales, estn presentes en Arqueobacterias en adelante. El proceso mediante el cual el intrn es removido se denomina RNA splicing.
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14 Ejemplos de genes interrumpidos: 1. Gen de la amilasa en hgado y de las glndulas salivales. La secuencia del exn L es parte de un gran intrn que es removido por ruptura y empalme en las glndulas salivales. La utilizacin de promotores alternantes permite un empalme diferencial para generar 2 RNAm de amilasa a partir de un gen en ratn. 2. Un empalme alternativo o diferencial puede generar protenas con secuencia solapadas a partir de un ADN simple estrecho. Ejemplo: Troponina, Gen T del msculo de rata. La mitad 3del gen contiene el exon 5, pero el 4 solo es utilizado para construir un RNAm individual. Tres exones, wxz, son los mismos en ambos patrones de expresin. Sin embargo, en un patrn el exon es usado y colocado entre x y z; en el otro patrn, el exon es utilizado. Patrones de empalme alternativo existen de varios genes celulares, por sustitucin de un exon por otro, el cambio en la secuencia de aa genera protenas relacionadas, las cuales presumiblemente tienen funciones diferentes. El uso econmico del DNA contrata con el aparente exceso de DNA postulado por la paradoja del valor C. Los intrones aceptan cambios de tamao y sustituciones de bases. En algunos genes los exones son homlogos mientras que los intrones tienen divergencia tanto que las secuencias no pueden ser reconocidas. Las mutaciones ocurren tanto en exones como en intrones pero son removidas ms eficientemente de un exon por seleccin adversa. Exon S Exon 3 Promotor Saliva Exon L Promotor Higado Exon 2

Exon

Exon

Exon

RNA m de Glndula Salival

Exon L

Exon

RNA m de Hgado Gen de la amilasa

Exon 3

3. Leghemoglobina y globina donde en el exon 2 hay un intron que lo divide en 2 en el caso de leghemobglobina, hay un ancestro en comn. W X Z

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Gen de la Troponina

La mitocondria humana:
MAPA GENETICO MITOCONDRIAL La mitocondria es un orgnulo celular al que tempranamente se asign el papel de "horno" de la clula donde se obtiene energa tras el proceso oxidativo que ocurre sobre distintos metabolitos. Adems, posee en su membrana esos magnficos mecanismos de la cadena transportadora de electrones y de la ATPasa, que permiten la transformacin de la energa de oxidacin en la llamada "moneda energtica universal" de la clula; esto es, el ATP. Todo esto, con ser crtico en la vida de la clula eucarionte, no habra sido suficiente para despertar el inters de la gentica molecular, la antropologa gentica, o la misma oncologa. Hay otros elementos que contribuyen a dar a la mitocondria un papel relevante en la gentica molecular y otras ciencias que utilizan las poderosas herramientas gentico-moleculares: 1) Las mitocondrias son heredadas de la madre: esto tiene importantes consecuencias genticas; pero adems se puede utilizar por los antroplogos moleculares en sus estudios sobre la evolucin, aportando una informacin decisiva en el anlisis del proceso evolutivo del que resulta el hombre actual. 2) La mitocondria posee un DNA circular propio, de un tamao de 16569 pares de bases, conteniendo un pequeo nmero de genes, distribuidos entre la cadena H y la cadena L. Estos genes mitocondriales son: genes de tRNAs, genes de rRNAs, genes de mRNAs, codificando para diversas protenas. La zona del DNA circular conocida como D-Loop o lazo D, aloja el origen de replicacin de la cadena H, el origen de transcripcin de la cadena H, y el origen de transcripcin de la cadena L, adems de una secuencia codificadora de RNA 7S. Hemos visto como el DNA circular mitocondrial humano posee informacin muy compactada; sin embargo, con este pequeo nmero de genes no se puede construir un orgnulo de las caractersticas de la mitocondria. Se necesitan muchas ms protenas, y por lo tanto muchos ms genes. Existe
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16 ms de un centenar de genes formando parte del genoma nuclear, ubicados en distintos cromosomas que codifican protenas mitocondriales.

Por ltimo, se puede decir que una de las ms prometedoras aproximaciones a la carcinognesis en humanos, y a una posterior accin teraputica radica en el conocimiento del papel de la mitocondria en el desarrollo de tumores humanos. Cuando la clula pierde el control de los acontecimientos que causan la proliferacin celular, debe entrar en accin ese mecanismo de "autodestruccin programada" que llamamos apoptosis. No sera por lo tanto excesivo decir que la tumoracin nace tanto de la prdida del control proliferativo como del fallo en el programa apopttico. El programa apopttico se desarrolla en gran medida tomando como objetivo la mitocondria. Esto es, una etapa clave de la autodestruccin celular es la eliminacin de la capacidad de la mitocondria para producir ATP, lo que conlleva la prdida de funciones vitales para la clula como son la capacidad de transporte de metabolitos, de biosntesis de metabolitos y macromolculas precisos para el mantenimiento de las estructuras celulares, la capacidad electrognica de la membrana plasmtica, la capacidad de relacin mediante los sistemas transduccionales, etc. Esta incapacidad para producir ATP es debida a la accin de protenas proapoptticas que actan sobre la mitocondria causando una disminucin drstica de su potencial de membrana.

CADENA H y transcritos de la cadena H En el siguiente dibujo podemos ver el Mitomapa; es decir, el mapa gentico del DNA mitocondrial humano. Observamos que tiene 37 genes, que podemos agrupar por sus productos:
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17 - 13 genes que codifican para ( RNAs mensajeros ), y por lo tanto para 13 protenas. - 22 genes que codifican para los 22 tRNAs ( RNAs de transferencia, que se representan simblicamente como hojas de trebol, por denominarse la estructura secundaria de " hoja de trebol " ). - 2 genes que codifican para los dos rRNAs mitocondriales ( RNAs ribosmicos ) En la molcula de DNA circular de mitocondria las dos cadenas complementarias tienen una proporcin de C y G muy dispar, y por ello tienen un peso molecular muy distinto. Para distinguirlas hablamos de cadena H o pesada ( heavy ) y cadena L o ligera ( light ). Cadena L Composicin en bases (total bases : 16569): 5122 A ; 5180 C ; 2171 G ; 4096 T Peso molecular: 5.060.609 daltons Cadena H Composicin en bases (total bases : 16569): 4096 A ; 2171 C ; 5180 G ; 5122 T Peso molecular: 5.168.726 daltons Numeracin de las bases del genoma mitocondrial: A diferencia de lo que ocurre con el genoma nuclear, en el caso del DNA mitocondrial no se numeran los pares de bases de los genes, sino que se numera todo el genoma desde la posicin 1 hasta la ltima, que en el caso de la " secuencia Cambridge " es la posicin 16569.

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18 En el dibujo siguiente vemos como se realiza la numeracin

Aunque existen genes sobre ambas cadenas, la cadena que se representa por convenio, y sobre la que se realiza la numeracin del genoma mitocondrial es la cadena L. La numeracin se realiza de 1 a 16569; no existiendo, al contrario de lo que ocurre en los genes nucleares, valores negativos. Que genes se encuentran sobre cada cadena ? Los denominados genes transcritos de la cadena H tienen como cadena codificadora la cadena L; por ello la secuencia de los RNAs transcritos de H tienen la secuencia y direccin que se asigna por convenio al conjunto del genoma mitocondrial, y las ORFs (Open Reading Frames) tienen esa misma direccin "sense". Es decir, estos genes tienen como cadena codificadora la cadena L, y como cadena molde la H. Genes transcritos de la cadena H : la cadena H es el molde para la transcripcin de los siguientes genes: genes cuya transcripcin origina mRNAs ( RNAs mensajeros ), y como consecuencia su producto final es una protena : NADH deshidrogenasa: subunidad 1 (MTND1) / subunidad 2 (MTND2) / subunidad 3 (MTND3) / subunidad 4 (MTND4) / subunidad 4L (MTND4L) / subunidad 5 (MTND5) Citocromo oxidasa: subunidad 1 (COI) / subunidad 2 (COII) / subunidad 3 (COIII) ATPasa: subunidad 6 (ATPasa 6) / subunidad 8 (ATPasa 8) Citocromos: citocromo b

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19 genes cuya transcripcin origina rRNAs mitocondriales ( RNAs ribosomicos mitocondriales ) : RNA ribosomal 12S / RNA ribosomal 16S genes cuya transcripcin origina tRNAs mitocondriales ( RNAs de transferencia ) : tRNA-Phe; tRNA-Val; tRNA-Leu (1 y 2); tRNA-Ile; tRNA-Met; tRNA-Trp; tRNAAsp; tRNA-Lys; tRNA-Gly; tRNA-Arg; tRNA-His; tRNA-Ser ( 2 ); tRNA-Thr Esto hace que el nmero de genes transcritos por la cadena H sea de 12 codificando para protenas, 2 codificando para RNAs ribosmicos, y 14 codificando para RNAs de transferencia. Ello totaliza 28 genes de los 37 que tiene la mitocondria humana. Hay que sealar aqu que cuando se habla de genes mitocondriales cuyo producto es una protena tradicionalmente se ha llamado gen a la parte del genoma que origina una protena. De tal forma que con frecuencia se utiliza un lenguaje confuso : el gen de MTND4L y el gen de MTND4 se mencionan como 2 genes; sin embargo usan el mismo RNA mensajero, y por ello se habla en otras ocasiones del gen policistrnico de MTND4L y MTND4. Tambin puede llevar a confusin al lector la forma de expresar si un gen pertenece a la cadena H o a la cadena L. La nomenclatura de los genes mitocondriales hace que hagamos referencia a la cadena cuya transcripcin origina el RNA ( cadena molde ); es decir, lo contrario de lo que es usual en los genes nucleares, donde se hace referencia a la cadena codificadora como la cadena donde se encuentra el gen. Cada cadena tiene su propio origen de replicacin y de transcripcin. Cada cadena se transcribe " en una sola pieza " ; es decir, se produce una sola molcula de RNA al que se denomina transcrito primario de esa cadena. En la prctica no se encuentran los transcritos primarios de longitud total porque son troceados simultaneamente al proceso de transcripcin. En las siguientes figuras vemos esquematizado el proceso de transcripcin y formacin de los transcritos (RNAs ).

El promotor de la transcripcin de la cadena H se encuentra entre las posiciones 531 y 568 del DNA mitocondrial. Este promotor dirige la
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20 formacin del complejo de transcripcin que formar la burbuja donde se sintetiza el RNA denominado transcrito primario de la cadena H.

El transcrito primario de cada cadena sufre un proceso de corte por accin de nucleasas (RNAsas ) muy especficas, que producen una coleccin de RNAs. Estos RNAs reciben el nombre de " precursores ", y no son funcionalmente activos. Para ser funcionales deban sufrir un proceso de maduracin.

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Estos RNAs " precursores " sufrirn procesos de maduracin consistentes en transformaciones catalizadas enzimticamente, y originarn las formas maduras de los tRNAs, mRNAs, y rRNAs.

CADENA L y sus transcritos Que genes se encuentran sobre esta cadena? Los denominados genes transcritos de la cadena L tienen como cadena codificadora la cadena H; por ello la secuencia de los RNAs transcritos de L tienen la secuencia complementaria, y direccin contraria a la que se asigna por convenio al conjunto del genoma mitocondrial, y las ORFs (Open Reading Frames) tienen esa misma direccin "antisense". Es decir, estos genes tienen como cadena codificadora la cadena H, y como cadena molde la L. Genes transcritos de la cadena L : la cadena L es el molde para la transcripcin de los siguientes genes :

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22 genes cuya transcripcin origina mRNAs ( RNAs mensajeros ), y como consecuencia su producto final es una protena : NADH deshidrogenasa: subunidad 6 (MTND6) genes cuya transcripcin transferencia ) : origina tRNAs mitocondriales ( RNAs de

tRNA-Ala; tRNA-Asn; tRNA-Gln; tRNA-Cys; tRNA-Tyr; tRNA-Ser ( 1 ); tRNA-Glu; tRNA-Pro A estos genes habra que aadir un gen que origina un pequeo RNA mitocondrial: RNA-7s En buena lgica habra tradicionalmente se obvia. que aadir el gen del RNA-7s, aunque

Esto hace que el nmero de genes transcritos de la cadena L sea de 1 codificando para protenas, y 8 codificando para RNAs de transferencia. Ello totaliza 9 genes de los 37 que tiene la mitocondria humana. Cada cadena tiene su propio origen de replicacin y de transcripcin. Cada cadena se transcribe " en una sola pieza "; es decir, se produce una sola molcula de RNA al que se denomina transcrito primario de esa cadena. En la prctica no se encuentran los transcritos primarios de longitud total porque son troceados simultneamente al proceso de transcripcin. En las siguientes figuras vemos esquematizado el proceso de transcripcin y formacin de los transcritos ( RNAs ).

El promotor de la transcripcin de la cadena L dirige la formacin del complejo de transcripcin que formar la burbuja donde se sintetiza el RNA denominado transcrito primario de la cadena L.

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El transcrito primario de cada cadena sufre un proceso de corte por accin de nucleasas (RNAsas) muy especficas, que producen una coleccin de RNAs. Estos RNAs reciben el nombre de " precursores ", y no son funcionalmente activos. Para ser funcionales deban sufrir un proceso de maduracin.

Estos RNAs " precursores " sufrirn procesos de maduracin consistentes en transformaciones catalizadas enzimticamente, y originarn las formas maduras de los tRNAs, mRNA, y RNA-7s.

Estrategias de aprendizaje: Ser una estrategia socializada, El estudiante deber estudiar los conceptos sealados luego del desarrollo de la clase terica para posteriormente discutir junto al profesor sobre los elementos aqu sealados.

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24 AUTOEVALUACIN 1. Enumere cuatro caractersticas del genoma eucariota. 2. Seale la clasificacin de los genes de ms de una copia. 3. Defina secuencia funcional y secuencia sin funcin conocida. 4. D dos ejemplos de secuencias funcionales. 5. D dos ejemplos de secuencias sin funcin conocida. 6. Seale ejemplos de familias de genes dispersos, de genes dispuestos en tndem, y de secuencias funcionales que no cifran un producto. 7. Explique todo lo referente a DNA sin funcin conocida, cite ejemplos. 8. Seale las diferencias entre Transposones genuinos y retrotransposones. 9. Defina Paradoja C, valor C y Curvas Cot. 10. Cmo realizara el experimento de reasociacin del DNA, para estudio de tipos de secuencias de DNA?. 11. Defina Intron, Exon, Pseudogen. 12. Seale los rasgos ms resaltantes de los genes interrumpidos. 13. Explique con un ejemplo las caractersticas de los genes interrumpidos. 14. Seale las caractersticas ms resaltantes del genoma mitocondrial. BIBLIOGRAFIA Libros 1. Griffiths A., Miller J., Suzuki D., Lewontin R. and Gelbart W. An introduction to Genetic Analysis. W. H. Freeman New York. Seventh Edition, 2000. 2. Lehninger A., Nelson d., Cox M. Principles of Biochemistry. 2da. Edicin. Worth Publishers, New York, 1993. 3. Lewin B .Genes V. Oxford University Press. 1994. 4. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. Molecular Cell Biology. W. H. Freeman and Company New York, Fourth edition, 2000. 5. Puertas M. Gentica: Fundamentos y perspectivas. Interamericana. McGraw-Hill, Segunda edicin, 1999. 6. Suzuki D., Griffiths A., Miller J. and Lewontin R. Gentica: Introduccin al anlisis gentico. Interamericana. McGraw-Hill, Cuarta edicin, 1992.

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