UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

Facultad de Ciencias Químicas

Informe de Microbiología Industrial

Integrantes:

♣ Bastidas Tania
♣ Ibarra Danilo
♣ Serrano Sebastián
♣ Salgado David
♣ Benítez Vicente

I. TEMA:

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACION DE CEPAS PARA LA OBTENCION

DE BIOETANOL A PARTIR DEL RECHAZO DE BANANO

II. OBJETIVOS:

II.1. OBJETIVO GENERAL

♣ Aislamiento, selección y preservación de cepas para la obtención de bioetanol a partir del

rechazo de banano

II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

♣ Recolectar los sustratos (desechos de banano) provenientes del rechazo en la industria

♣ Diseñar el medio de cultivo más adecuado para el crecimiento óptimo de los
microorganismos para la producción de bioetanol a partir de los desechos de banano y
formación del producto
♣ Aislar los grupos de poblaciones microbiológicas de cepas que cuenten con la capacidad
para obtener bioetanol
♣ Seleccionar las cepas con la mejor capacidad de formación de bioetanol
♣ Preservar las cepas seleccionadas con características biotecnológicas a las condiciones
adecuadas obtenidas al final del bioproceso, mantenga las características biotecnológicas
mediante la técnica de crioconservación.
♣ Preservar a condiciones adecuadas, las cepas seleccionadas e identificadas para la
producción de bioetanol

III. INTRODUCCION:
El Ecuador produce 3.9 millones de toneladas de banano anual, convirtiéndose en el primer
exportador y segundo productor de banano en el mundo. Basándose en las estadísticas el
92% del banano ecuatoriano se utiliza para el consumo alimenticio, generando un 8% de
banano de desecho. El resultado de este porcentaje de rechazo es por causa de la mala
utilización de técnicas agrícolas y correcto manejo de producto ya sea en la cosecha o al ser
empacado (fallas en la materia prima). La descomposición de una parte de este ocasiona una
contaminación ambiental causando daño al medio ambiente que en la actualidad es una
problemática mundial. Otra parte del banano de rechazo también se ha dirigido a ser utilizado
como piensos de animales. El banano de rechazo por ser rico en almidon puede ser utilizado
como sustrato para procesos fermentativos que permitan el máximo aprovechamiento
energético a través de la generación de bioetanol.

La producción de banano en el país se concentra en las regiones costaneras el cual

representa el 89% de la producción y la diferencia en otras regiones que poseen características
climaticas similares que son adecuadas para la producción de esta fruta, concentrándose los
mayores índices de producción en las provincias de Los Ríos con el 35 % y Guayas con el
32%.

En base a la existencia de un alto porcentaje de banano de rechazo el trabajo investigativo se

orienta a aprovechar el desecho y producir un biocombustible amigable con el medio ambiente,
sirviendo para la producción de bioetanol el cual se produce por la fermentación de los
azúcares contenidos en la materia orgánica del banano de rechazo. En este proceso se obtiene
el alcohol hidratado, con un contenido aproximado del 5% de agua, que tras ser deshidratado
se puede utilizar como combustible.

El alcohol es una fuente de bioenergía que no produce emisiones de gas, analizado desde el
punto de vista vital.

Una alternativa de disposición final de los desechos que permite tener un producto con optimas
calidades sanitarias, aplicando técnicas agrícolas en base a procesos fermentativos para
dichos sustratos que permiten obtener sustancias como alcohol etílico, convirtiéndose en fuente
de energía alternativa para el futuro.

IV. MARCO METODOLOGICO:

MEDIO DE ENSAYO

En los medios que se describen a continuación se ha reemplazado el contenido de glucosa, por

un polvo obtenido del banano, el mismo que fue triturado, secado a 600C para evitar que
sustancias volátiles necesarias
 Tabla 1. Medio Mínimal para desarrollo de cepas con capacidad de obtener bioetanol a
partir de residuos de banano

NOMBRE NOMENCLATURA CANTIDAD

Sulfato de Magnesio
MgSO4.7H2O 0,5g
Heptahidratado
Fosfato ácido de Potasio KH2PO4 1.0 g
Sulfato Ferroso FeSO4 0.05 g
Cloruro de Calcio CaCl2 0.02 g
Cloruro Mangánico Mg2Cl 0.002 g
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 1g
Molibdato de Sodio NaMoO 0.001 g
Agar – Agar 20g
Extracto de Levadura 5g
Peptona 5g
Banano 100g
Cicloheximida 0,08g

*Se agregan 100 g de banano procesado como se describió anteriormente, ya que se requerían
20g de glucosa en el medio original

FERMENTACIÓN DEL BANANO DE RECHAZO:

Todos los biorreactores se colocan a 300C, temperatura óptima de crecimiento de Zymomona

Título: Descripción de los 9 biorreactores

N.- Código Descripción Temperatura (0C)

1 J1-30 Tratamiento 1 Jipijapa 30

2 J2-30 Tratamiento 2 Jipijapa 30

3 J3-30 Tratamiento 3 Jipijapa 30

4 Q1-30 Tratamiento 1 Quinindé 30

5 Q2-30 Tratamiento 2 Quinindé 30

6 Q3-30 Tratamiento 3 Quinindé 30

7 ST1-30 Tratamiento 1 Santo Domingo 30

8 ST2-30 Tratamiento 2 Santo Domingo 30

9 ST3-30 Tratamiento 3 Santo Domingo 30

Se realizó la fermentación durante 15 días, en ciertos biorreactores se paró la fermentación
antes de los 15 días, los resultados se muestran a continuación.

Tabla de resultados con porcentaje de alcohol alcanzado durante la

fermentación

Código % de alcohol máximo alcanzado T ( días en que se detuvo la

fermentación)

J1-30 13,5 14

J2-30 9,5 10

J3-30 8 10

Q1-30 10 12

Q2-30 6 8

Q3-30 6 7

ST1-30 8,5 10

ST2-30 5 7

ST3-30 7 7

Se determinó el contenido alcohólico periódicamente, no se incluyen los datos de la cinética de

producción de alcohol de cada biorreactor.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las técnicas empleadas normalmente
en microbiología, siguiendo el esquema a partir de una muestra de banano de rechazo.

Una vez identificadas las zymomonas en 5 cajas petri: J1-30, J2-30, Q1-30, ST1-30, ST3-30, se
resiembra por estriado en el mismo medio en placa, y se obtuvieron los cultivos axénicos.

TÉCNICAS DE SELECCIÓN

Las cepas purificadas se dispondrán para pruebas que consisten en someterlas al medio
diseñado a partir medio minimal con inhibidor (cicloheximida), al cual se someterán a diferentes
concentraciones de etanol para permitirles inicialmente adaptarse a las condiciones y
posteriormente se seleccionarán las mejores cepas, es decir las que han sobrevivido a las
concentraciones más adecuadas.
Las cepas aisladas se pasan a cajas con Agar Banano, adicionado de diferentes
concentraciones de etanol de 6, 8, 10 ,12 % y se obtienen los siguientes resultados

Tabla de concentraciones de etanol

Concentraciones de Etanol

Cepas (%)

6% 8% 10% 12%

J1 + + + +

J2 + + - -

Q1 + + - -

ST1 + + - -

ST3 + - - -

+ = se observa crecimiento
- = no se evidencia crecimiento

Se selecciona a la cepa J1 que es la que resiste a concentraciones más altas de etanol, por lo
tanto es la que mejor resultados nos dará en la producción de bioetanol.

FUNDAMENTO DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS

Para aislar y seleccionar las mejores cepas se debe obtener el banano de rechazo se realizo
distintos tratamientos

PRIMER TRATAMIENTO:

Licuar 200g de pulpa y 200g de cáscara con 1000ml de agua destilada*

Añadir a la solución anterior 20g de extracto de levadura, 5g de peptona**, 1g K2HPO4, 0,5g

KH2PO4***.

Colocar la mezcla en un recipiente plástico de 1,25 L.

Retirar el aire remanente del recipiente****

Tapar de manera hermética, inmediatamente. La tapa previamente tiene un orificio del cual sale
una manguera que conecta con un recipiente lleno de agua.

SEGUNDO TRATAMIENTO:

Licuar 400g de pulpa con 1000 ml de agua destilada.

Repetir los pasos seguidos en el primer tratamiento.

TERCER TRATAMIENTO:

Licuar 400g de cáscara con 1000 ml de agua destilada.

Repetir los pasos seguidos en el primer tratamiento.

Cada uno de las tratamientos se realiza 2 veces con cada muestra de banano ( 3 localidades)

*Se utilizó agua destilada para evitar presencia de sustancias que posiblemente pudieran inhibir
el crecimiento de las bacterias.

** Requerimiento 2% extracto levadura y 0,5% de peptona como fuente de nitrógeno

( Zymomonas gran requerimiento de aminoácidos)

*** Se debe mantener el pH, ya que el metabolismo de bacterias fermentadoras tiende a

disminuir pH, se añade cantidades adecuadas de cada fosfato (monoácido y diácido) para
formar el buffer necesario

**** La aireación disminuye el rendimiento de etanol, aumenta la producción de ácido acético.

TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN
Los tubos positivos en la etapa anterior, se siembran en cajas de Petri con el medio de
enriquecimiento y se incuban a 30°C por 24 a 48h.

Se identifican colonias típicas de Zymomonas

Se toma en cuenta caracteres morfológicos y se realiza la comprobación con las pruebas

bioquímicas

CARACTERES MORFOLOGICOS OBSERVADOS:

Forma Bastoncillos

Color Blanca

Borde Regular

Elevación Ligeramente elevada

Tamaño Mediano

TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN

El metodo de eleccion para conservar la zimomona es la Congelacion

De la cepa seleccionada de Zymomona J1, se obtienen perlas.
Estas se colocan en un criovial, que contiene 1ml de BHI con dimetilsulfóxido al 10%, que
según revisión bibliográfica, es el mejor medio de preservación.

Se congelan en freezer a -800C.

V. RESULTADOS:

Zimomona spp

Tabla de concentraciones de etanol

Concentraciones de Etanol

Cepas (%)

6% 8% 10% 12%

J1 + + + +

J2 + + - -

Q1 + + - -

ST1 + + - -

ST3 + - - -

+  se observa crecimiento
-  no se evidencia crecimiento

Se selecciona a la cepa J1 que es la que resiste a concentraciones más altas de etanol, por lo
tanto es la que mejor resultados nos dará en la producción de bioetanol.

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE LA ZYMOMONA SSP

Tabla.- Pruebas bioquímicas de identificación de la zimomona spp

Prueba Zymomona ssp

Bioquímica
Catalasa +
Oxidasa -
Citrato -
D- Glucosa +
Fructosa -
Galactosa +
D- Xilosa +
Lactosa +
Sacarosa - VI. DISCUS
Maltosa -
IONES:
Manosa +
Indol -
Sorbitol -
Movilidad -
 ♣ Para realizar el proyecto de investigación se obtuvieron sustratos (banano de
rechazo), de tres sitios que son: Jipijapa, Quininde y Santo Domingo de los
Tsachilas

♣ No fue ensayada la concentración de 14 % de etanol, debido a que ningún

biorreactor alcanzó esa concentración.

♣ Para próximas investigaciones queda la posibilidad de determinar los factores

que pueden haber detenido el crecimiento de Zymomona al llegar al 13,5% de
etanol, en este experimento se cree que se debió a que a esta concentración
es la más alta a la que puede crecer.

♣ Realizamos la fermentación del banano del rechazo (cascara + pulpa) y

(cascara); con el objetivo de comenzar un aislamiento de cepas productoras de
etanol

♣ Se diseño unidades experimentales (biorreactores) con ciertos requerimientos

como metabolicos, de mezclado, de calor y masa, para realizar la fermentacion
las cuales llegaron a concentraciones de 13.5% de etanol.

♣ La fuente de carbono de la zimomona spp son los carbohidratos (glucosa,

fructosa, etc) del banano de rechazo en el medio minimo diseñado, la fuente de
nitrógeno es el extracto de levadura para la obtención del bioproducto.

♣ Se realizo una purificación de las cepas(Zimomona spp) en el medio minimal

diseñado, ya que al sembrar hubo crecimiento de mohos, con un inhibidor que
fue la cicloheximida

♣ Las cepas obtenidas a partir del banano de rechazo se sometieron distintas

concentraciones de etanol, en el que hubo un crecimiento optimo la cepa de
Jipijapa que la que resistio las mas altas concentraciones de etanol, por lo que
nos daria mejor y mayor produccion de bioetanol.

♣ El proceso de fermentación, aislamiento y selección se lo realiza en

anaerobiosis debido a que la aireación disminuye el rendimiento de etanol,
aumenta la producción de ácido acético.

VII. CONCLUSIONES:
♣ Se aislo, selecciono y preservo zimomona a partir del rehazo de banano,
sustrato obtenido de Jipijapa, con capacidad de resistencia de etanol del 12%
para obtener bioetanol.
♣ La cepa obtenida de la pulpa y cáscara de bananos de Jipijapa, muestra la más
alta resistencia a concentraciones de etanol (12%).
♣ En los biorreactores que usan como sustrato la cáscara y en la tierra, al
colocarlos en el caldo de detección no se evidenció desarrollo de la Zymomona
debido a la gran cantidad de flora acompañante que contenían dichas
muestras.
♣ En los biorreactores que usan como sustrato la pulpa tampoco se evidenció
crecimiento debido, a que la Zymomona se debe encontrar en la interfaz de la
cáscara y la pulpa y no específicamente en la pulpa
♣ En la tierra debido que aunque en condiciones naturales exista Zymomona, por
la falta de nutrientes requeridos, esta haya desaparecido.
♣ La recolección de los sustratos (banano de rechazo y suelo), provenientes de
las bananeras ubicadas en Santo Domingo, Quininde y Jipijapalas cuales
fueron exitosas
♣ Se lograron seleccionar las mejores cepas para la producción de bioetanol con
una concentración mayor del 12% de etanol
♣ Las cepas se preservaran por congelación en crioviales con 1 ml de medio BHI
y dimetilsulfoxido al 10% preservando la característica principal biotecnológica
que es de producir bioetanol