Altamirano CC PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE QUMICA, INGENIERA QUMICA INGENIERA

AGROINDUSTRIAL
E.A.P. DE INGENIERA QUMICA
Optimizacin de un Mtodo para la Produccin

deBiomasa de Saccharomyces cerevisiae empleada en la
etapade Fermentacin del Mosto de Cerveza, desde un
nivel deLaboratorio a un nivel Piloto
TESIS
Para optar el Ttulo Profesional de Ingeniero Qumico
AUTOR
Carlos Alberto Altamirano Cahuancama
ASESOR
Jorge Luis Cardenas Ruiz
Abad Flores Paucarima
Lima Per
2013
El presente trabajo se realiz en las instalaciones del laboratorio de Microbiologa

Ambiental y Biotecnologa de la facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.
DEDICATORA
A mis padres Dora y Aquilino

por su preocupacin permanente en
Mi formacin y superacin personal.
Siempre perduraran en mi corazn
A mi esposa Rosario por su tolerancia y respaldo
en cada uno de los actos de mi vida.
A mis hijos Jos y lvaro, que la presente estimule

el sendero que transiten en sus vidas.
A mis hermanos Jadsn, Marco, Lino por su constante apoyo

y estimulo en cada uno de los actos de mi vida .Mi eterno
afecto y agradecimiento.
Al Dr. Abad Flores Paucarima, Maestro y amigo

por su brillantes intelectual y calidad humana mi
admiracin y eterno agradecimiento por
servirme de ejemplo como hombre de Ciencia y
formador del pensamiento crtico.
AGRADECIMIENTOS
Mi eterna gratitud:
Dr. ABAD FLORES PAUCARIMA, Catedrtico de la UNMSM responsable del

Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Biotecnologa Facultad de Ciencias
Biolgicas. Co-Asesor de Tesis.
Dr. JORGE CHVEZ PREZ, Catedrtico y Director del Instituto de Investigacin en

Bioqumica y Biologa Molecular de la UNALM. Revisor Externo
Mg. GILBERTO SALAS COLOTTA, Catedrtico y Director de Escuela de Ing. QUMICA

de la UNMSM. Presidente del jurado de Tesis.
Mg. LEONCIO REYNA MARIAS, Catedrtico y Director de Escuela de Ing. QUMICA

de la UNMSM. Revisor de Tesis.
Ing. QUMICO JORGE LUS CRDENAS RUZ, Catedrtico de la Facultad de Qumica

Ingeniera Qumica e Ingeniera Agroindustrial de la UNMSM. Asesor de Tesis
RESUMEN
La Esterilizacin es un proceso fsico por el cual se consigue eliminar la carga
microbiana acompaante y sus esporas que contaminan un medio de cultivo e
instrumentos de laboratorio as tambin en la planta de procesos. Las caractersticas
del material problema a esterilizar son de relevante importancia al momento de elegir
entre los distintos mtodos de esterilizacin, que se pueden emplear como son:
Esterilizacin por calor seco, Esterilizacin por calor hmedo, Esterilizacin por
Radiacin Gama y UV, Esterilizacin por Filtracin.
El aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae a partir de un cultivo
contaminado es una prctica de gran relevancia para obtener un cultivo axnico. Las
metodologas que se emplean son los sub cultivos directos, medios selectivos,
sustancias qumicas inhibitorias o el uso de discos de antibitico, luego se identificar
las unidades formadoras de colonia de Saccharomyces cerevisiae por su morfologa
caracterstica debido a su comportamiento cultural de manera que todos los
individuos del mismo cultivo tengan la misma composicin gentica, es decir un clon
de clulas. Para posteriormente aislarlo y elegir la mejor metodologa de conservacin
de cepas a largo plazo, conservacin por congelacin, conservacin por liofilizacin o
mtodos de conservacin a corto plazo, para conservar convenientemente el cepario
de clulas de Saccharomyces cerevisiae.
Para llevar a cabo de manera ptima la produccin del mosto de malta de cebada se
utiliza la relacin ms conveniente de Agua/Malta de cebada (Cuadro 3) Los distintos
perfiles de temperatura (Cuadro 4) y la (Figura 17) que actan sobre la papilla de
Agua/Malta de cebada para activar el complejo enzimtico (Amilasa-Proteasa) que
hidrolice las cadenas lineales y ramificadas de polisacridos del almidn y de las
protenas. El pH ptimo (Cuadro 5) que active el complejo enzimtico para que las
enzimas adquieran la conformacin tridimensional que reconozca a su sustrato
unindose e hidrolizando los enlaces glucosdicos y peptdicos de la malta. El grado de
hidrlisis enzimtico es funcin del Tiempo de actividad enzimtica (Cuadro 6). Todas
estas variables de operacin actan de manera sinrgica para obtener de manera
ptima un caldo enriquecido (Cuadro 8) y (Cuadro 9) llamado mosto de malta de
cebada.
La propagacin de clulas de levadura a nivel de laboratorio (Figura 21) se realiza en
caldo estril de extracto de levadura, glucosa y peptona (YPG) bajo condiciones
aerbicas empleando aire estril, control estricto de la temperatura para que la
levadura Saccharomyces cerevisiae lo metabolice y sintetice su material celular
propagndose en el medio de cultivo. El criterio aplicando de escalamiento (Figura22)
por lo general es empleando un factor de alrededor de 1:10 para cada trasegado, y

una concentracin celular de 10-15x106 clulas/mL.
La dilucin sucesiva de una suspensin clulas de Saccharomyces cerevisiae (Figura28)
es un procedimiento que permite bajar la carga de clulas en un rango que se pueda
contar en cmara de Neubauer de manera cmoda y poder reportar de manera
confiable el nmero de clulas que se encuentran en dicha suspensin celular.
La Tincin vital de Clulas de Saccharomyces cerevisiae (Figura 43) se fundamenta en
la Bioqumica y es una tcnica rpida que permite discriminar en un cultivo celular
entre clulas que se encuentran en condicione de vitalidad o activas metablicamente
frente a las clulas muertas que coexisten en el mismo cultivo celular (Figura 38).
El Recuento de levaduras totales y viables en cmara de Neubauer Improved(Figura44)
es una tcnica de conteo celular directo en una celdilla cuadriculada subdividida en la
cual se deposita un cultivo celular diluido para ser enfocado al microscopio ptico, y
proceder al recuento de clulas y reportar el nmero de clulas por campo y as
obtener un promedio de clulas que se encuentran en la suspensin celular, por este
tcnica no discriminamos entre clulas vivas de las muertas, pero si combinamos esta
tcnica con la de Tincin vital podramos observar al microscopio las clulas
decoloradas (clulas vivas) de las clulas no decoloradas (clulas muertas ) y poder
hacer un recuento en cmara de Neubauer y saber cul es la concentracin viable con
que se est contando y si esta es ptima para ser utilizado como inoculo en la
fermentacin del Mosto de malta de cebada a nivel piloto (Figura 45).
La Propagacin de levaduras en la planta piloto de Cervecera es una actividad donde
confluyen la formacin de Ingeniero Qumico en sinergia con la Microbiologa
Industrial para poder disear y controlar de manera ptima minimizando los riesgos
de contaminacin del cultivo celular propagando la Biomasa de levadura hasta
alcanzar un volumen del 10% del volumen del mosto de malta de cebada a inocular
con una concentracin celular de 10-15x106 clulas vitales/mL para un ptimo
proceso fermentativo del mosto de malta de cebada.
INDICE GENERAL
Pg.
Resumen
ndice de cuadros
IX
ndice de figuras
XI
Lista de abreviaturas
XIII
1. INTRODUCCIN
2. FUNDAMENTOS TERICOS
2.1 LA CLULA DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae

2.1.1 Dimensin de las Clulas
2.2 CITOLOGA DE LA CLULA DE Saccharomyces cerevisiae
2
3
5
2.2.1 La pared celular
2.2.2 Espacio Periplasmtico
2.2.3 Membrana Citoplasmtica
2.2.4 El Ncleo Celular
10
2.2.5 Estructura de las Mitocondrias
11
2.3 OTRAS ESTRUCTURAS CITOPLASMTICAS
13
2.3.1 Las Vacuolas
13
2.3.2 Peroxisomas
13
2.3.3 El Retculo endoplasmtico
13
2.3.4 El aparto de Golgi
13
2.3.5 El Citosol
13
2.3.6 El Citoesqueleto
14
2.4 EL MICROSCOPIO PTICO
15
2.5 LAS ENZIMAS
18
2.5.1Factores que modifican la velocidad de las Reacciones Enzimticas
17
2.6 METABOLISMO CELULAR OXIDATIVO
20
2.7 VAS ANAERBICAS
22
2.7.1 Fermentacin alcohlica.
22
2.7.2 La fermentacin lctica
24
2.8 LA CIENCIA DE LA MACERACIN DEL MOSTO DE MALTA
24
2.8.1 Preparacin de la malta
24
2.8.2 Produccin del mosto de malta.
24
2.8.3 Fermentacin
25
2.8.4 Procesamiento final
26
2.9 CONCEPTO DE DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN
31
2.9.1 Desinfeccin
32
2.9.2 Esterilizacin
32
2.10 MTODOS DE ESTERILIZACIN
31
2.10.1 Esterilizacin por calor seco
31
2.10.2 Esterilizacin por calor hmedo
32
2.10.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV
33
2.10.4 Esterilizacin por Filtracin.
33
2.11 CONCEPTO DE CULTIVO PURO
34
2.11.1 Mtodo de aislamiento de Levaduras Saccharomyces cerevisiae
34
2.11.2 Caractersticas culturales de la colonia de Saccharomyces cerevisiae
36
2.12 METODO DE CONSERVACIN DE CEPA

2.12.1 Mtodos a largo plazo
36
37
2.12.1.1 Conservacin por congelacin
37
2.12.1.2 Conservacin por liofilizacin
37
2.12.2 Mtodo de conservacin a corto plazo
37
2.13 CULTIVO Y PROPAGACIN CELULAR
38
2.13.1 Propagacin de levadura en el laboratorio
39
2.13.2 Propagacin de levadura en la planta de cervecera
40
2.13.3 Efecto Pasteur
42
2.13.4 Efecto Crabtree
43
2.14 CONCEPTO DE CULTIVO CELULAR VIABLE Y VITAL
43
2.14.1 Evaluacin de la viabilidad de un cultivo de clulas de levadura
43
2.14.2 Evaluacin de la vitalidad de un cultivo de clulas de levadura
44
2.15 MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIN DE

MICROORGANISMOS VIABLES
45
2.15.1 Recuento directo
45
2.15.2 Medida de la masa de clulas
45
2.15.3 Recuento de viables
45
2.15.4 Medida del nmero de partculas
46
2.15.5 Medida de parmetros bioqumicos
46
2.15.6 Medida de actividad metablica de las bacterias
46
2.16 TINCIN VITAL DE CLULAS DE Saccharomyces cerevisiae
46
2.17 DILUCIN SERIADA DE LAS SUSPENSIONES CELULARES
47
2.18 CAMARA DE NEUBAUER IMPROVED PARA EL RECUENTO DE LEVADURAS
48
2.19 CRECIMIENTO DE LA POBLACIN CELULAR DEL INCULO
49
2.19.1 Ciclo de crecimiento para el cultivo por lotes
49
2.19.2 Cintica de crecimiento en un cultivo intermitente
51
2.20 ECUACIONES DE DISEO PARA EL BIORREACTOR IDEAL DISCONTINUO
53
2.20.1 Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes
54
2.20.2 Ventajas de un Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes
56
2.20.3 Desventajas de un Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes
56
3. HIPTESIS
57
4. OBJETIVOS
57
4.1 Objetivo general
57
4.2 Objetivos especficos
57
5. METODOLOGA
58
5.1 Plan de trabajo
59
5.2 Materiales y Mtodos
60
5.2.1 Mtodos de esterilizacin
60
5.2.1.1 Esterilizacin por calor seco
60
5.2.1.2 Esterilizacin de medios de cultivo por calor hmedo
60
5.2.1.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV
61
5.2.1.4 Esterilizacin por Filtracin
61
5.2.2 Aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae
62
5.2.3 Produccin de mosto de malta de cebada
65
5.2.4 Propagacin de clulas de levadura a nivel Laboratorio
65
5.2.4 Propagacin de levaduras en la planta de Cervecera
67
5.2.5 Dilucin de una suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae
67
5.2.6 Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae
70
5.2.7 Recuento de levaduras totales y viables en cmara de

Neubauer Improved
71
5.2.8 Determinacin de Azucares Reductores
77
5.2.8.1 Titulacin del Estndar de Glucosa
78
5.2.9 Modelo de regresin simple
79
6. RESULTADOS Y DISCUCIN
80
6.1 Mtodos de esterilizacin
80
6.1.1 Esterilizacin de instrumentos por calor seco
80
6.1.2 Esterilizacin de medios de cultivo por calor hmedo
80
6.1.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV.
81
6.2 Aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae
81
6.3 Produccin de mosto de malta de cebada
83
6.4 Reactivacin y propagacin de clulas de levadura a nivel Laboratorio
83
6.5 Dilucin de una suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae
91
6.6 Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae
91
6.7 Recuento de levaduras totales y viables en cmara de Neubauer Improved
94
6.8 Propagacin de levaduras en la planta piloto de Cervecera
95
7. CONCLUSIONES
104
8. ANEXO
105
8.1 LOS ORGANISMOS SON TRANSFORMADORES DE ENERGA
105
8.1.1 La Primera ley de la Termodinmica
106
8.1.2 La Segunda ley de la Termodinmica
107
8.1.3 Desequilibrio Metablico: Clave de la vida
108
8.1.4 El Adenosn Trifosfato (ATP)
109
8.1.5 La clula puede realizar tres clases principales de trabajo
111
8.2 LAS ENZIMAS
112
8.2.1 Clasificacin de las Enzimas
113
8.2.2 Sitio Activo
115
8.2.3 Mecanismo de Accin
116
8.2.4 La Gluclisis
116
8.2.5 Respiracin aerbica
118
8.2.6 Ciclo de Krebs
118
8.2.7 Transporte de electrones o Cadena respiratoria.
120
8.2.8 Fosforilacin Oxidativa
121
8.2.9 Hiptesis Quimiosmtica

8.3 OTRAS VAS CATABLICAS
125
8.4 FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL

METABOLISMO CELULAR
126
8.4.1 Temperatura
126
8.4.2 Actividad de agua (aw)
127
8.4.3 Potencial de Hidrogeniones (pH)
128
8.4.4 Potencial Redox
129
8.5 MEDIOS DE CULTIVO.
122
130
8.5.1En funcin de su consistencia:
130
8.5.2 En funcin de sus componentes nutricionales
131
8.5.3 Diseo de un medio de fermentacin
131
8.5.4 Requerimientos Nutricionales
132
8.6 MICROBIOLOGA Y CONTROL MICROBIOLGICO

EN LA INDUSTRIA CERVECERA
133
8.7 PRINCIPALES PUNTOS DE CONTAMINACIN MICROBIOLGICA
136
8.7.1 En las Materias primas
136
8.7.2 Durante la Fermentacin
137
8.7.4 En el Equipo de Dispensado
138
8.8 BUENAS PRCTICAS DE MANUFACTURA (BPM)
138
8.8.1 Limpieza e Higiene
139
8.8.2 Control sanitario de personal e instalaciones
140
8.9 ASEGURAMIENTO DE LA SEGURIDAD DE LA CERVEZA

8.10 ANLISIS DE PELIGROS MEDIANTE EL CONTROL DE
PUNTOS CRTICOS (APCPC)
144
146
8.10.1 Materias primas
147
8.10.2 Durante el proceso
151
8.11 SEGURIDAD MICROBIOLGICA
152
8.11.1 Envasado
152
8.11.2 Manejo de aguas residuales
153
8.11.3 Manejo de desechos
153
8.11.4 Sabotajes
154
8.12 ALERGENOS
9. BIBLIOGRAFA
154
156
INDICE DE CUADROS
CUADRO 1. Poder de resolucin del Microscopio

CUADRO 2. Esquema bioqumico del proceso de fermentacin
Pagina
15
24
CUADRO 3. Tabla de la relacin (Agua/Malta) del empaste en el mosto
26
CUADRO 4. Tabla Temperatura ptima para algunos procesos de empaste
26
CUADRO 5. Tabla Valores ptimos de pH en la empaste de infusin
27
CUADRO 6. Tabla de Cambios en los rendimientos con el tiempo de extraccin.
27
CUADRO 7. Extractos y extractos de fermentacin
28
CUADRO 8. Composicin de carbohidratos en el mosto
29
CUADRO 9. Los aminocidos libres en mosto de cerveza
30
CUADRO 10. Composicin de Agar YPG suplementado con antibitico
35
CUADRO 11. Condiciones de esterilizacin en auto clave
35
CUADRO 12. Caracterstica cultural de Saccharomyces cerevisiae
36
CUADRO 13. Materias primas del mosto
58
CUADRO 14. Insumos para el aislamiento y propagacin de biomasa
58
CUADRO 15. Plan de trabajo
59
CUADRO 16. Procedimiento de propagacin de la levadura en el laboratorio
66
CUADRO 17. Propagacin N1 de Clulas de Saccharomyces cerevisiae

a nivel laboratorio
85
CUADRO18. Linealizacin N1 de la funcin
86

a nivel laboratorio
87
CUADRO 20. Linealizacin N2 de la funcin
88

a nivel laboratorio
89
CUADRO 22. Linealizacin N3 de la funcin
90
CUADRO 23. Tincin vital N1 de clulas Saccharomyces cerevisiae
91
92
92
92
93
93
CUADRO 29. Concentracin celular en (clulas/mL) por el mtodo de Neubaur
94
CUADRO 30. Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae

en Biorreactor de Tanque Agitado
98
CUADRO 31. Linealizacin de la funcin
99

100
101

102
103
CUADRO 36. Diferencias entre catalizadores biolgicos y qumicos
113
CUADRO 37. Vitaminas hidrosolubles, sus coenzimas derivadas y sus funciones
114
CUADRO 38. Clasificacin de las Enzimas
115
CUADRO 39. Ecuacin de la Gluclisis
118
CUADRO 40. Balance parcial de la respiracin
120
CUADRO 41. Resumen de la gluclisis y de la respiracin
123
CUADRO 42. Clasificacin de los Microorganismos en funcin

de su temperatura Metablica
126
CUADRO 43. Clasificacin de los Microorganismos en funcin pH
128
CUADRO 44. El efecto bactericida Concentracin -Temperatura-Tiempo
142
INDICE DE FIGURAS
Pgina
FIGURA 1. Micrografa de clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae
FIGURA 2. Relacin entre rea superficial y el volumen celular
FIGURA 3. Simplificacin de la pared celular de la clula de

Saccharomyces cerevisiae
FIGURA 4. Membrana plasmtica de la clula de Saccharomyces cerevisiae
FIGURA 5. Molcula de Fosfolpido
FIGURA 6. Microfotografa electrnica de una mitocondria
11
FIGURA 7. Esquema de la ultra estructura de una mitocondria
12
FIGURA 8. Componentes estructurales de la clula de

14
FIGURA 9. Componentes del microscopio ptico
16
FIGURA 10. Esquema de un Microscopio ptico
16
FIGURA 11. Velocidad de reaccin enzimtica Vs Concentracin de sustrato
18
FIGURA 12. Efecto de la temperatura (a) y el pH (b) sobre la actividad enzimtica
19
FIGURA 13. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor competitivo y sin
Inhibidor
19
FIGURA 14. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor no competitivo y sin
Inhibidor
FIGURA 15. Resumen del metabolismo de los glcidos en clulas eucariotas
22
FIGURA 16. Esquema de una clula de levadura Cerveza en fermentacin.
23
FIGURA 17. Curva de maceracin Temperatura Vs. Tiempo
28
FIGURA 18. Tincin del Mosto de cerveza con solucin de Yodo en Yoduro
29
FIGURA 19. Absorcin de carbohidratos por la Levadura Saccharomyces cerevisiae 30

FIGURA 20. Cepario de clulas de Saccharomyces cerevisiae en medio Agar YPG
38
Pgina
FIGURA 21. Componentes de un equipo Biorreactor a nivel de laboratorio
39
FIGURA 22. Escalamiento del cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae
40
FIGURA 23. Dos tanques del sistema de propagacin levadura cervecera
42
FIGURA 24. Dilucin seriada de suspensin celular
48
FIGURA 25. Cmara de Neubauer Improved
48
FIGURA 26. Ciclo de crecimiento intermitente
51
FIGURA 27. Operacin del sistema de fermentacin por lote
54
FIGURA 28. Estriado por agotamiento sobre agar YPG
64
FIGURA 29. Metodologa de la Dilucin
69
FIGURA 30. Con nmero de Objetivo 4x
72
FIGURA 31. Con nmero de objetivo 10x
73
FIGURA 32. Con nmero de objetivo 40x
74
FIGURA 33. Sentido de conteo de clulas en cmara
75
FIGURA 34 Cultivo primario de Clulas contaminadas de

82
FIGURA 35 Aislamiento de Saccharomyces cerevisiae en placa Petri
Sobre Agar YPG suplementado con antibitico Tetraciclina

FIGURA 36 Cepario e Inoculo de clones de Clulas de Saccharomyces cerevisiae
82
84
FIGURA 37. Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae

Safale S-40 en medio de cultivo Mosto Cervecero en frasco Carlsberg. 84
FIGURA 38. Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel Laboratorio
85
FIGURA 39. Grafica de Concentracin [s] Vs T (h) a nivel Laboratorio
86
FIGURA 40. Grafica Ln N Cel/ml Vs T(h) a nivel Laboratorio
87
88
Pgina
FIGURA 42. Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel Laboratorio
89
90
FIGURA 44. Micrografa de la Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae 93

FIGURA 45. Muestra de Clulas de Saccharomyces cerevisiae sobre placa
95
FIGURA 46. Birreactor Batch modelo Tanque Agitado de capacidad
Operativa de 1hL
96
FIGURA 47. Vista de perfil del Birreactor Batch modelo Tanque Agitado
97
FIGURA 48. Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel piloto
98
FIGURA 49 Grafica de Concentracin [s] Vs T (h) a nivel piloto
99
FIGURA 50 Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel piloto
100
101
FIGURA 52 Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel piloto
102
103
FIGURA 54 Flujo de energa y materia en un ecosistema
106
FIGURA 55 Molcula de (ATP)
109
FIGURA 56 El ciclo del ATP
109
FIGURA 57 Oxido-reduccin de la coenzima NAD+
111
FIGURA 58 Tipos de trabajo celular que utilizan ATP
111
FIGURA 59 Perfil de energa de una reaccin exergnica
112
FIGURA 60 Mecanismo de accin de una enzima
116
FIGURA 61 Resumen de las dos etapas de la gluclisis
117
FIGURA 62 Esquema simplificado del Ciclo de Krebs
119
FIGURA 63 Diagrama de la cadena respiratoria y de la Fosforilacin

Oxidativa asociada
FIGURA 64 Esquema comparativo de la quimiosmosis en la
mitocondria y el cloroplasto.
121
123
Pgina
FIGURA 65 Resumen de la Gluclisis y de la Respiracin
124
FIGURA 66 Vas principales del catabolismo y anabolismo en la clula
125
FIGURA 67 Diagrama de flujo de la planta de produccin de Cerveza
147
Universidad Nacional mayor de San Marcos
Facultad de Qumica e Ingeniera Qumica
1. INTRODUCCIN
Es un reto para el Ingeniero Qumico desarrollarse en el campo de la Industria
Cervecera en la cual debe mantener un control total del proceso fermentativo
orientado o dirigido, que garantice la estabilidad qumica y microbiolgica as como
las caractersticas sensoriales de la cerveza final, no basta solo con emular las
condiciones ptimas de operacin. Un problema operacional frecuente es no contar
con una metodologa para cuantificar adecuadamente el requerimiento de un
inculo de clulas de Saccharomyces cerevisiae su volumen y la concentracin de
clulas/mL vitales y viables necesarias para la fermentacin ptima de un mosto de
malta de cebada. Un defecto en el volumen y concentracin del inculo necesario
para fermentar un mosto de malta de cebada, con una baja concentracin de
clulas vitales y viables, trae como consecuencia prolongados tiempos de
conversin y deficiente fermentacin, incompleta o truncada. Un exceso en el
inoculo con alta concentracin de clulas vitales y viables, acelerara el procesos
fermentativo pero le transfiere a la cerveza un sabor desagradable por la liberacin
del material intracelular, como consecuencia de la autolisis que sufre el excesivo
nmero de clulas de levadura. El proceso de fermentacin del mosto de malta de
cebada implica un alto riesgo de contaminacin por el manipuleo de biomasa
celular de levadura empleada como inoculo sobre un mosto de malta de cebada.
Las clulas de Saccharomyces cerevisiae contaminadas con bacterias acido lcticas
causan problemas grabes de turbidez, olores y bouquet anmalos en la cerveza
final, El presente trabajo de Tesis propone como soluciones a estos problemas en el
proceso de fermentacin durante la produccin de cerveza lo siguiente:
- El Ingeniero Qumico dedicado a la Industria Cervecera adquiera un conocimiento
bsico de Microbiologa Industrial que le permitan minimizar los riesgos de
contaminacin microbiolgica y concebir a las clulas de levadura Saccharomyces
cerevisiae como micro factoras las cuales bajo condiciones controladas de
fermentacin, metabolizan el mosto de malta de cebada en un producto final
comercialmente llamado cerveza.
- Estandarizar una tcnica de reactivacin, escalamiento y mtodo cuantificacin de
un cultivo Axnico de clulas de Saccharomyces cerevisiae empleada como inculo
para la fermentacin ptima del mosto de malta de cebada, en la produccin de
cerveza.Para la realizacin del siguiente trabado de tesis se complement la
formacin profesional en Ingeniero Qumica con una segunda carreara profesional
en Biologa Microbiologa y Parasitologa en la misma casa de estudios. Para llevar a
cabo el desarrollo experimental se dise y construy dos Biorreactores uno a nivel
de laboratorio de 4L de capacidad, tipo Airlift y el segundo Biorreactor con
capacidad de 100L tipo Tanque Agitado, para los estudios de reactivacin,
propagacin y escalamientos sucesivos de los cultivos de clulas de Saccharomyces
cerevisiae. Dichos equipos se encuentran en el Laboratorio de Microbiologa
Ambiental y Biotecnologa de la Facultad de Ciencia Biolgicas de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.
2.FUNDAMENTOS TERICOS
2.1-LA CLULA DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae
Las Levaduras comprenden a la actualidad, 39 gneros y 350 especies. Se identifican
y clasifican basndose en caractersticas morfolgicas y fisiolgicas .Entre los
aspectos morfolgicos considerados, se encuentran el tamao y las formas de las
clulas, en medio slido y liquido especificados ya que pueden presentar
Dimorfismo, el modo de reproduccin y si forma velo en la superficie o sedimenta
en un medio lquido.Dentro de las caractersticas fisiolgicas consideradas, se
encuentra si puede crecer y fermentar en un determinado carbohidrato y si puede
usar o no determinadas fuentes de nitrgeno como los nitratos. Las clulas de
levadura pueden ser ovales, esfricas, tener forma de limn o de cigarro puro,
pueden dividirse mediante gemacin. La levaduras Saccharomyces cerevisiae son
hongos unicelulares Eucariticos, hetertrofos, osmotrficos (no ingieren sus
alimentos lo absorben por digestin externa del sustrato empleando exoenzimas) se
reproducen por gemacin. Los Hongos son un grupo aparte no son consideradas
clulas animales por que presentan pared celular externa que la recubre compuesta
polisacridos de celulosa y quitina, tampoco son consideradas clulas vegetales ya
que carecen de cloroplastos y no realizan fotosntesis.Una clula de una levadura de
cerveza tpica tiene, cuando se halla completamente desarrollada entre 8 y 14 m
de dimetro y una masa de materia seca de aproximadamente 40pg. Por tanto 10 12
clulas desecadas pesan unos 40g. En vivo prensado, ese nmero de clulas pesan
unos 200g. TUBB y HAMMOND en (1987)definieron las caractersticas ms
importantes para una levadura de cervecera:
- Una fermentacin rpida pero sin exceso de crecimiento en biomasa de la levadura
- Una buena conversin de la maltosa y de la maltotriosa en etanol
- Resistencia al etanol
- Resistencia a la presin osmtica
- Perfiles aromticos equilibrados y reproductibles
- El carcter de flocular eventualmente
- Una buena estabilidad gentica a lo largo del tiempo
Figura 1 .Micrografa de clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae a mil

aumentos (Gracias a Alastair Pringle AnheuserBusch,Inc.) - La barra representa 5
mm. Figura 284 Manual de elaboracin de la cerveza
2.1.1 Dimensin de las Clulas. Las clulas procariotas presentan tamaos que van
desde 0.1- 0.2 mde ancho sin embargo las dimensiones de un Eucariota de tipo
medio, como Saccharomyces cerevisiae .A efectos comparativos, una clula
Eucariota puede variar de 2 a ms de 200 m De dimetro, por lo tanto las clulas
procariotas son ms pequeas que las Eucariotas. Las clulas deben captar alimento
y otros materiales a travs de su membrana plasmtica y deben eliminar los
productos de desecho, generados en las distintas reacciones metablicas
rpidamente antes de que estos se acumulen hasta niveles txicos para la
supervivencia celular. Por lo tanto, las clulas son pequeas, de modo que en ellas
las molculas recorren distancias cortas, lo que acelera las actividades celulares.
Adems, a mayor superficie celular, mayor es el transporte de molculas a travs de
la membrana, siendo importante para la continuidad de los procesos metablicos
laproporcin superficie celular sobre volumen celular. Por lo tanto, el volumen
celular aumenta ms que su superficie a medida que la clula crece, determinando
el lmite superior al tamao de la clula en cuestin. Est clula slo podr iniciar el
proceso de divisin celular (previa duplicacin de su ADN) o perecer.
Con respecto a su tamao las clulas pequeas tiene ms superficie relativa

disponible respecto de las grandes .Esto se hace ms patente en el caso de
los cuerpos esfricos en los que el volumen es una funcin del cubo del
radio, mientras que la superficie es una funcin del cuadrado del radio en
relacin de la superficie/volumen (S/V) de una esfera puede ser expresado
como 3/r por lo tanto una clula de radio pequea pose una relacin (S/V)
mayor Por otra parte, debemos recordar que en las clulas el material
Gentico (localizado en el ncleo, en clulas eucariontes), posee un rea
limitada de influencia sobre el citoplasma circundante, que es el que
incrementa marcadamente su tamao durante el crecimiento celular, siendo
otra limitante del tamao celular la relacin ncleo/citoplasma.
Figura 2.Relacin entre rea superficial y el volumen celular. El tamao del volumen
celular implica una disminucin de la relacin superficie/volumen
2.2 CITOLOGA DE LA CLULA DE Saccharomyces cerevisiae

2.2.1 La pared celular. La pared celular de los hongos posee diferentes
constituyentes qumicos como polisacridos, protenas, lpidos y otras sustancias.
La constitucin vara entre las diferentes especies. Tambin vara con la edad del
hongo, ya que sustancias que pueden estar presentes en las hifas jvenes,
desaparecen en las ms viejas o depositar otros materiales y enmascarar la
presencia de constituyentes iniciales, tambin la composicin del medio, el pH y la
temperatura, influyen en la composicin de las paredes de los hongos (Foster,
1949).Una clula de levadura de cerveza cuando se halla plenamente desarrollada
tiene, una masa de materia seca, entre 8 y 14 pg. Por tanto 10 12 clulas desecadas
pesan unos 12g. El examen de microscopia revela que cada clula est rodeada de
una pared y que en el interior de la misma se pueden distinguir pocas estructuras
salvo una o ms vacuolas .Para observar su ncleo y varios otros orgnulos es
necesario recurrir a las preparaciones teidas o a la microscopia de contraste de
fases.Las clulas de Saccharomyces cerevisiae presenta una humedad de 70-80% y
pared celular similar a las clulas de los vegetales la cual representa el 30% del peso
seco total y tiene un grosor de 100-200nm. Est constituida aproximadamente de
un 40% de glucano, 40% de mananos, 8% de protenas, 7% de lpidos,3% de
sustancias inorgnicas,2% de hexosamina y quitina. El glucano est unido a una
protena y representa el componente estructural ms abundante, se halla
fundamentalmente en la cara interna de la pared. El manano tambin se encuentra
ligado a la protena, a veces a travs de hexosamina, y tiende a localizarse en la
superficie de la clula se encuentra cargada, debido a la presencia de grupos
carboxilo y fosfato que al pH de la cerveza, la confieren una fuerte carga neta
negativa y tiene hidrofobicidad, la carga negativa se atribuye a las cadenas fosfato
localizadas en la pared externa de manoprotenas y puede demostrarse por tincin
con Azul de cian. La hidrofobicidad es debida a los lpidos de la pared externa y a los
grupos fosforilados del complejo de manoprotenas. Tambin se encuentran grupos
amino, pero slo les confieren regiones locales de carga positiva .Las paredes
celulares se pueden disolver mediante el uso de una preparacin enzimtica
mixta.La pared celular es permeada por alguna de las enzimas secretadas por la
levadura, el ms importante es la Invertasa, que hidroliza la sacarosa antes de que
penetre a la clula, entre ellos se encuentra tambin la fosfatasa. Saccharomyces
carlsbergensis segrega la melibiosa, pero Saccharomyces cerevisiae no. Algunas
levaduras segregan cantidades apreciables de proteasas, pero las del gnero
Saccharomyces slo tiene una actividad de este tipo limitada. La superficie celular
de la levadura de fermentacin alta (ale) est cubierta por pequeas protuberancias
microfibrilares (al parecer de manoprotenas) que les confiere una aspereza que le
permite que las clulas asciendan a la superficie durante lafermentacin entre la
capa externa de manoprotenas y la capa interna en la que predomina el glucano,
existen una serie de capas intermedias compuestas de ambas especies qumicos.
5
Molculas estructurales de la pared celular -D-Manosa y -D-N-Acetilglucosamina
Figura 3. Simplificacin de la pared celular de la clula de Saccharomyces cerevisiae

2.2.2 Espacio Periplasmtico. El espacio Periplasmtico es la zona fina entre la
superficie externa de la membrana plasmtica y la superficie interna de la pared
celular. Las protenas secretadas, que no son capaces de impregnar la pared celular
se encuentran aqu .Esto incluye las enzimas como la Invertasa, fosfatasa cida y
melibiosa .Por ejemplo, la sacarosa se descompone en el espacio Periplasmtico por
accin de la enzima Invertasa en sus componentes fructosa y glucosa.
2.2.3 Membrana Citoplasmtica. Estructuralmente est compuesta por una bicapa
fosfolipdica. El colesterol est presente en las clulas animales, pero est ausente,
en general, en plantas, hongos y procariontes (salvo micoplasmas). La membrana
plasmtica tambin contiene mltiples protenas con diversas funciones. Podemos
dividirlas en dos grandes grupos:

a) Protenas integrales de membrana, atraviesan la membrana de lado a lado
b) protenas perifricas de membrana, estn en contacto con la membrana, pero no
la atraviesan.
Algunas son enzimas reguladoras, otros receptores hormonales. Existen tambin
protenas transportadoras y canales reguladoras del movimiento de iones y
molculas a travs de la membrana plasmtica, de all su enorme especificidad.
Otra funcin importante de la membrana es la comunicacin intercelular y el
reconocimiento de diversos tipos de molcula (hormonas, virus, anticuerpos,
toxinas, etc.) que interactan con ella. En general esta funcin es llevada a cabo por
glucoprotenas y glucolpidos, que se encuentran solo en el lado externo de la
membrana plasmtica. Se cree que los glcidos juegan un importante papel en la
adhesin entre clulas. A esta capa, de glucolpidos y glucoprotenas se la denomina
glucoclix. La membrana Celular citoplasmtica de Saccharomyces cerevisiae es una
estructura fina que rodea completamente a la clula. Es una estructura vital de tan
slo unos 8nm. De espesor que constituye labarrera que separa el interior de la
clula (el citoplasma) del exterior. Si se rompe la membrana, se destruye la
integridad de la clula liberndose al medio los componentes que la integran y
producindose la muerte celular o autolisis. La membrana citoplasmtica acta
tambin como una barrera muy selectiva, permitiendo que en el interior de la clula
se concentren determinados metabolitos y se excreten las sustancias de desecho.
-Composicin Qumica de la Membrana :
La estructura general de la mayora de membranas biolgicas es una bicapa lipdica.
Los fosfolpidos poseen tanto regiones altamente hidrofbicas (cidos grasos) como
regiones relativamente hidroflicas (glicerol) y pueden presentarse en mltiples
formas qumicas
distintas debido a la variacin en la composicin de cidos grasos y de los
compuestos fosforilados que se unen al esqueleto de glicerol.Cuando los
fosfolpidos se agregan en soluciones acuosas tienden a formar bicapa de manera
espontnea, los cidos grasos se orientan hacia el interior, mantenindose en un
ambiente hidrofbico,mientras que las porciones hidroflicas son expuestas a la fase
acuosa la estructura de bicapa en la membrana representa probablemente la
organizacin ms estable que puedan alcanzar la molculas lipdicas en un entorno
acuoso. Esta unidad de membrana ,como se denomina, consta de una bicapa
fosfolipdica en la que existen protenas embebidas las principales protenas de
membrana poseen una regin altamente hidrofbica que interacciona con las zonas
apolares de los cidos grasos, y atraviesan las membranas presentes de regiones
superficiales tanto en el exterior como en el interior de la clula, la estructura global
de la membrana citoplasmtica se estabiliza mediante puentes de hidrgeno e
interacciones hidrofbicas. Adems algunos cationes como el Calcio y el Magnesio
tambin contribuyen a la estabilidad de la membrana a travs de las interacciones
inicas con los grupos polares de carga negativa presentes en los fosfolpido.
7
La capa externa de la membrana citoplasmtica contacta con una variedad de

protenas implicadas en la unin del sustrato y el procesamiento de grandes
molculas para el transporte al interior celular (protenas periplasmticas) la cara
interna de la membrana citoplasmtica se orienta hacia el citoplasma e interacciona
con protenas involucradas en reacciones de obtencin de energa y otras
importantes funciones celulares. A pesar de que las representaciones esquemticas
de la membrana tiene un aspecto rgido la membrana citoplasmtica es en realidad
bastante fluida, pues los fosfolpidos y las protenas presentan una considerable
libertad de movimiento dentro de la membrana la medida de viscosidad de la
membrana demuestran que su viscosidad es semejante a la de los aceites de bajo
grado. Por tanto las membranas pueden ser consideradas como mosaico fluido en el
existen protenas globulares con orientaciones especficas que atraviesan la bicapa
lipdica, que presenta a la vez una estricta organizacin y una elevada movilidad.
Este tipo de organizacin confiere importantes propiedades funcionales a las
membranas.
Figura 4. Membrana plasmtica de la clula deSaccharomyces cerevisiae
Estructura qumica de Fosfolpido
Figura 5. Molcula de Fosfolpido

-Funcin de la membrana citoplasmtica: Desde luego, si la biomenbrana fuera una
barrera impermeable por completo, la clula estara totalmente aislada del medio y
los organelos de su interior estaran incomunicados entre s. Por el contrario si las
9
membranas fueran del todo permeables todas las sustancias podran pasar
indistintamente de una regin a otra.
En realidad no ocurre ninguno de tales extremos. Ms bien las propiedades de
transporte de membrana son intermedias, se trata de divisiones semipermeables,
algunas sustancias pueden atravesarlas pero otras no. Segn la sustancia y
membrana de que se trate, adems la membrana es el lugar donde se asientan
muchas protenas, muchas de las cuales son enzimas o estn implicadas de una u
otra manera en el transporte de sustancias hacia el interior y hacia el exterior de la
clula, tambin la membrana celular es el sitio donde se produce energa en la
clula la membrana puede estar en una forma energticamente cargada en la que
existe separacin de los protones (H+) y de los iones hidroxilo (OH-) a travs de su
superficie esta separacin de carga es una forma de energa potencial presente en
una batera cargada ,este estado energtico de la membrana se conoce como Fuerza
Motriz de Protones (FMP) Es el responsable del mantenimiento de muchas de las
funciones celulares que requieren energa, tales como alguna forma de transporte,
la movilidad y la biosntesis de la Moneda energtica de la clula es decir el ATP.
En el interior de la clula (el citoplasma) contiene una solucin en fase acuosa de
sales, azcares, aminocidos, vitaminas, coenzimas y una gran variedad de otras
sustancias solubles. Las caractersticas hidrofbicas de la membrana le permiten
funcionar como una barrera estricta .Aunque algunas pequeas molculas
hidrofbicas, pueden pasar la membrana por difusin, las molculas hidroflicas y
cargadas no lo atraviesan y deben ser transportadas de modo especfico.Incluso,
una sustancia tan pequea como el ion de hidrgeno (H+) no es capaz de pasar la
membrana citoplasmtica por difusin. El transporte de las sustancias hacia adentro
y hacia afuera de las clulas, as como su traslado entre el citoplasma y las diversas
organelassubcelulares (mitocondria, ncleo, etc.) est determinada por la
membrana y constituye una de las funciones ms importantes de stas.
2.2.4 El Ncleo Celular. Las diversas partes de una clula eucaritica interactan de
forma integrada. Esto es posible porque existe un centro primordial de control: el
ncleo celular. Una membrana doble, la envoltura nuclear (constituida por dos
unidades de membrana), controla el transporte, muy selectivo, de sustancias entre
el ncleo y el citoplasma. El pasaje se realiza a travs de los poros nucleares. La
envoltura nuclear posee ribosomas adheridos a la cara citoplasmtica y una
estructura proteica en su parte interna llamada lamina nuclear, que sirve como
esqueleto al ncleo. En el interior del ncleo, se encuentra el material gentico
(ADN) asociado a protenas bsicas llamadas histonas, formando una estructura
fibrilar muy enrollada denominada cromatina y el nuclolo, sitio de ensamblaje de
los ribosomas (estructuras esenciales para la sntesis de protenas, formados por
ARN ribosomal y protena). El ARN ribosmico se sintetiza en el nuclolo, y las
protenas ribosmicas en el citoplasma, para pasar despus al ncleo y de all al
nuclolo, donde se unen al ARN ribosomal para formar los ribosomas. Rodeando al
ncleo encontramos el citoplasma, coloide donde predominan como constituyentes
agua, iones, enzimas y donde se encuentran incluidos los organelos celulares.
10
El citoplasma se encuentra separado del ambiente exterior por la membrana

plasmtica.
2.2.5 Estructura de las Mitocondrias. Las mitocondrias estn rodeadas por dos
membranas, una externa que es lisa y una interna que se pliega hacia adentro
formando crestas. Dentro del espacio interno de la mitocondria en torno a las
crestas, existe una solucin densa (matriz o estroma) que contiene enzimas,
coenzimas, agua, fosfatos y otras molculas que intervienen en la respiracin.
La membrana externa es permeable para la mayora de las molculas pequeas,
pero la interna slo permite el paso de ciertas molculas como el cido pirvico y
ATP y restringe el paso de otras. Esta permeabilidad selectiva de la membrana
interna, tiene una importancia crtica porque capacita a las mitocondrias para
destinar la energa de la respiracin para la produccin de ATP.La mayora de las
enzimas del ciclo de Krebs se encuentran en la matriz mitocondrial. Las enzimas que
actan en el transporte de electrones se encuentran en las membranas de las
crestas. Las membranas internas de las crestas estn formadas por un 80 % de
protenas y un 20 % de lpidos. En las mitocondrias, el cido pirvico proveniente de
la gluclisis, se oxida a dixido de carbono y agua, completndose as la degradacin
de la glucosa. El 95 % del ATP producido se genera, en la mitocondria. Las
mitocondrias son consideradas organoidessemiautnomos, porque presentan los
dos cidos nucleicos (del tipo procarionte)
Figura 6. Microfotografa electrnica de una mitocondria. Se observan las

invaginaciones de la membrana interna que forman las caractersticas crestas, que
identifican esta Organela.
11
Figura 7. Esquema de la ultraestructura de una mitocondria. (a) Esquema

tridimensional, (b) Esquema de un corte al M.E.T. (c) Cresta mitocondrial (detalle).
Como puede apreciase en la fig.7 (c), las crestas mitocondriales aparecen cubiertas
por partculas en forma de hongo, que tienen un tallo ms fino que las unen a la
membrana. Estas estructuras son las llamadas partculas F1 y representan una
porcin de la ATPasa especial que interviene en el acoplamiento entre la oxidacin y
la fosforilacin. Las partculas F1 se encuentran en la membrana interna, del lado
relacionado con la matriz; le confieren una asimetra caracterstica relacionada con
la funcin de la ATPasa (este punto se ver ms detalladamente al referirnos a la
hiptesis Quimiosmtica).Para concluir, es importante destacar que el ciclo de Krebs
se lleva a cabo en la matriz mitocondrial; mientras que el transporte de electrones y
la fosforilacin oxidativa se producen a nivel de las crestas mitocondriales. Ingreso al
ciclo de Krebs.
12
2.3 OTRAS ESTRUCTURAS CITOPLASMTICAS

2.3.1 Las Vacuolas. Las Vacuolas son parte de un sistema intramembranoso que
incluye el retculo endoplasmtico, y son fcilmente visibles con el microscopio de
luz. Ellos sirven de almacenes dinmicos de nutrientes y ofrecen un lugar para la
degradacin de las macromolculas. Tambin son claves en las protenas
intracelulares .El trfico de las levaduras. La forma y el tamao de las vacuolas
durante el ciclo celular .Las clulas maduras contienen grandes vacuolas que se
fragmentan en pequeas vesculas en la formacin de yemas, se inicia ms tarde el
ciclo celular, las pequeas vacuolas se funden para formar producir una vacuola
nica en la clula madre e hija. Las vacuolas estn delimitadas por una sola
membrana llamadatonoplasto que contiene proteasas e hidrolasas, y que tiene
metabolitos como aminocidos. El retculo endoplasmtico, el complejo de Golgi y
vescula, esta secuencia permite el transporte de las protenas solubles y unidas a la
tanto para secrecin extracelular y para el manejo de vacuolas.
2.3.2 Peroxisomas. Los Peroxisomas son vesculas rodeadas por una sola
membrana .los Peroxisomas en las levaduras realizan una variedad de funciones y
son tambin los sitios de los cidos grasos, y de los cidos hidrolticos de
degradacin celular, El nmero y el volumen de Peroxisomas es variable y depende
de las condiciones externas.
2.3.3 El Retculo endoplasmtico. El retculo endoplasmtico es un orgnulo
grande formado por una red de tbulos y sacos comunicados entre s, que se
extiende desde el ncleo. Interviene en las funciones relacionadas con la sntesis de
protenas, metabolismo de lpidos y algunos esteroidesas como el transporte
intracelular, est conformado por el Retculo endoplasmtico rugoso por el alto
nmero de Ribosomas adheridos a su membrana, el Retculo endoplasmtico liso no
tiene Ribosomas y participa en el metabolismo de lpidos.
2.3.4 El aparto de Golgi. Son sculos aplanados rodeados de membrana y apilados
unos encima de otros, cuya funcin es completar la fabricacin de algunas
Protenas. Funciona como una planta empaquetadora, modificando vesculas del
Retculo endoplasmtico rugoso.
2.3.5 El Citosol. El Citosol es la sede principal de la sntesis de protenas y de la
degradacin .El citosolest contenido dentro de la membrana plasmtica y rodea al
Ncleo, representams de la mitad del volumen celular y est conformado de
Ribosomas libres y de proteosomas que son los responsables de la digestin de las
protenas que pueden ser perjudiciales para la clula, el citosol junto con las
organelos excepto el ncleo constituye el citoplasma
13
2.3.6 El Citoesqueleto. El citoesqueleto es un entramado tridimensional de

Protenas que provee soporte interno en lasclulas, organiza las estructuras internas
de la misma e interviene en los fenmenos de transporte, trfico y divisin celular,
consta demicrofilamentos, filamentos intermedios y microtbulos.
Figura 8. Componentes estructurales de la clula de Saccharomyces cerevisiae
14
2.4 EL MICROSCOPIO PTICO.

El descubrimiento y estudio temprano de la microbiologa progres con la
invencin y mejora de los microscopios en el siglo XVII. Los microscopios de varios
tipos son an herramientas indispensables para el estudio de las clulas.Los
microscopios primeramente usados en el Renacimiento tanto como los que son
utilizados en los laboratorios hoy, son microscopios pticos. La luz visible pasa a
travs de la muestra y de las lentes de vidrio por donde la luz es refractada
(doblada) de tal manera, que la imagen del espcimen es amplificada cuando se
proyecta en el ojo. Dos valores importantes en microscopia son el aumento y el
poder de resolucin. Entendemos por aumento a las dimensiones aparentes de los
objetos comparados con su tamao real. El poder de resolucin es la medida de la
nitidez de la imagen; es la capacidad del instrumento para brindar imgenes
distintas de dos puntos cercanos.El microscopio ptico nunca puede resolver
detalles menores a 0,2nm, la medida de una pequea bacteria. Esta resolucin es
limitada por la longitud de onda de la luz visible usada para iluminar la muestra. Los
microscopios pticos o de luz pueden aumentar efectivamente alrededor de 1000 a
1500 veces el tamao de la muestra real; si se incrementase el aumento la imagen
proyectada sera borrosa. La mayora de las mejoras en microscopia de luz del
comienzo de este siglo ha involucrado nuevos mtodos para aumentar el contraste.
Sin estas tcnicas sera imposible para el ojo humano el conocimiento del mundo
celular. La mayora de las organelas son demasiado pequeas para ser visualizadas
por la microscopia de luz. El poder de resolucin est inversamente relacionado con
la longitud de onda (l) de la radiacin que un microscopio usa y un haz de
electrones tiene longitudes de onda mucho ms cortas que la luz visible.
Cuadro 1. Poder de resolucin del Microscopio

En cualquier tipo de microscopio, el poder de resolucin
depende de la longitud de onda (l) y de la apertura numrica
(AN) del objetivo (la capacidad de colectar la luz). As, el lmite de
resolucin, que es la distancia mnima que debe existir entre dos
puntos para que puedan ser discriminados como tales, y
responde a la siguiente ecuacin:
Lmite de resolucin=0,61 l /AN
A su vez,
AN = n . seno a
Donde, n es el ndice de refraccin del medio que atraviesa el
haz y a es el ngulo de apertura ntese que el lmite de
resolucin es inversamente proporcional al poder resolutivo del
instrumento, de modo tal que cuanto mayor sea ste, menor
ser el lmite de resolucin conseguido.
15
Figura9.Componentes del microscopio ptico
Figura 10 Esquema de un Microscopio ptico
16
2.5LAS ENZIMAS
Todas las reacciones que se efectan en los seres vivos son catalizadas por enzimas.
Estas hacen posible que las reacciones metablicas se desarrollen a un ritmo
razonable, compatible con la vida.
El trmino catalizador se emplea para referirse a cualquier sustancia que acelera el
transcurso de una reaccin qumica, sin intervenir en ella ni como reactivo ni como
producto. El catalizador no provoca la reaccin solo afecta la velocidad con que
ocurre la misma. Esto es posible porque los catalizadores disminuyen la energa de
activacin como lo indica el siguiente grfico
2.5.1 Factores que modifican la velocidad de las Reacciones Enzimticas.

Una determinada reaccin qumica ocurre solo en condiciones termodinmicas
favorables, esto es cuando la energa de los reactivos o sustratos es mayor que la
energa de los productos. La velocidad con que dicha reaccin ocurrir depende de
distintos factores como ser la cantidad de reactivo o sustrato que interviene, la
temperatura, el pH, etc.
Como hemos mencionado, las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones
qumicas, sin embargo no las provocan, por lo tanto la concentracin de enzimas es
otro de los factores que modifican la velocidad de la reaccin as como tambin
aquellas sustancias que pueden inhibir la accin de la enzima (inhibidores).
1. Concentracin de sustrato.-En general a medida que aumenta la cantidad de
reactivos o sustratos la velocidad tambin aumenta. En el caso de las reacciones
qumicas conviene aclarar que la velocidad se mide como cantidad de producto
formado por unidad de tiempo, las unidades sern: g/s, mol/s, mol/min, etc. De este
modo cuanto ms reactivo tenemos, ms producto se formar. En el caso de las
reacciones catalizadas por enzimas, el efecto de la cantidad de sustrato es el
siguiente:
A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad aumenta en forma lineal
(zona proporcional), luego si bien la velocidad contina aumentando ya no lo hace
en forma lineal (zona mixta) hasta que finalmente la reaccin alcanza una velocidad
mxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona
de saturacin). Esto ocurre debido a que los sitios activos de las enzimas se
encuentran todos interactuando con las molculas de sustrato, por lo tanto hasta
que no finalice la reaccin la enzima no puede unirse a otro sustrato.
17
Figura 11.Velocidad de reaccin enzimtica Vs Concentracin de sustrato

2. Concentracin de enzimas.-La concentracin de enzimas es otro de los factores
que modifica la velocidad, cuanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor
ser la velocidad que se alcanzar, debido a que necesito ms cantidad de sustrato
para alcanzar la saturacin.
3. Temperatura.-En general las reacciones ocurren ms rpidamente cuando se le
otorga calor, ya que el aumento de la temperatura hace que aumente la energa
cintica de las molculas y de esta manera reaccionen con facilidad. Cuando las
reacciones estn catalizadas por enzimas se produce primero un efecto
complementario, es decir, la velocidad va aumentando conforme al aumento de
temperatura, sin embargo la velocidad llega a un punto ptimo a partir del cual la
velocidad comienza a decaer. No nos olvidemos que las enzimas son protenas, por
lo tanto son susceptibles a la desnaturalizacin, es decir que la velocidad decae
porque las enzimas pierden su actividad biolgica como consecuencia de la
desnaturalizacin. Algunas enzimas son termoestables, es decir su actividad
biolgica permanece an a temperaturas mayores a 90 C.
4. pH.-El grfico de actividad en funcin del pH es similar al de la temperatura, es
decir a pH extremos las protenas se desnaturalizan, por lo tanto la actividad
biolgica decae. Algunas enzimas no varan su actividad con el pH sino que esta se
mantiene constante en un amplio rango. Otra tendr el pH ptimo cido o bsico
teniendo en cuenta el medio en donde actan.
18
Figura 12. Efecto de la temperatura (a) y el pH (b) sobre la actividad enzimtica

5. Inhibidores.-Aunque hay muchos ejemplos de inhibidores, los mecanismos de
inhibicin pueden ser de dos clases: reversibles e irreversibles, tambin hay
mecanismos intermedios.
Figura 13. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor competitivo y sin

inhibidor
5.1. Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan con fuerza a la enzima,
generalmente se unen covalentemente a algn aminocido del sitio activo. Existen
algunos inhibidores que se conocen como sustrato suicida, que se enlazan al centro
activo y qumicamente se transforma en una especie reactiva que modifica en forma
irreversible al aminocido del sitio activo.
5.2. Inhibidores reversibles: este tipo de inhibidores se disocian fcilmente de las
enzimas, dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos y los no
competitivos.
5.2.1Los inhibidores competitivos:compiten con el sustrato por el sitio activo de la
enzima, y si aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se revierte
19
alcanzndose la velocidad mxima.
Figura 14. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor no competitivo y sin

inhibidor
5.2.2. Los inhibidores no competitivos:se enlazan a un sitio distinto del sitio activo,
de manera que el inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien al complejo
enzima sustrato, pero en ninguno de los casos obtendremos productos. El efecto de
estos inhibidores no se revierte por el agregado de mayor cantidad de sustrato, de
manera que se llega a una velocidad mxima menor que si no tuviera el inhibidor.
No es raro observar algunos inhibidores a los cuales no se les puede comprobar el
mecanismo exacto de inhibicin, siendo en algunos casos un tipo de inhibicin
mixta.
2.6 METABOLISMOCELULAR OXIDATIVO
El proceso por el cual las clulas degradan las molculas orgnicas alimenticias
llamada(Sustrato) para obtener energa recibe el nombre de Respiracin celular. La
respiracin celular es una reaccin exergnica, donde parte de la energa contenida
en las molculas de alimento es utilizada por la clula para sintetizar ATP. Decimos
parte de la energa porque no toda es utilizada, sino que una parte se
pierde.Aproximadamente el 40% de la energa libre emitida por la oxidacin de la
glucosa se conserva en forma de ATP. Cerca del 75% de la energa de la nafta se
pierde como calor de un auto; solo el 25% se convierte en formas tiles de energa.
La clula es mucho ms eficiente.La respiracin celular es una combustin biolgica
y puede compararse con la combustin de carbn, bencina, lea. En ambos casos
molculas ricas en energa son degradadas a molculas ms sencillas con la
consiguiente liberacin de energa.Tanto la respiracin como la combustin son
reacciones exergnicas.Sin embargo existen importantes diferencias entre ambos
procesos. En primer lugar la combustin es un fenmeno incontrolado en el que
todos los enlaces qumicos se rompen al mismo tiempo y liberan la energa en forma
sbita; por el contrario la respiracin es la degradacin del alimento con la
liberacin paulatina de energa. Este control est ejercido por enzimas
20
especficas.En segundo lugar la combustin produce calor y algo de luz. Este proceso
transforma energa qumica en calrica y luminosa. En cambio la energa liberada
durante la respiracin es utilizada fundamentalmente para la formacin de nuevos
enlaces qumicos (ATP).La respiracin celular puede ser considerada como una serie
de reacciones de xido-reduccin en las cuales las molculas combustibles son
paulatinamente oxidadas y degradadas liberando energa. Los protones perdidos
por el alimento son captados por coenzimas.El oxgeno interviene en la sntesis de
esteroles y del cido nicotnico, si estos compuestos estn presentes en el medio las
levaduras pueden desarrollarse en anaerobiosis total. En el caso contrario parta la
supervivencia de la levadura es necesario 0.0015mg. de oxigeno por gramo de
biomasa para llevar a cabo la sntesis de esteroles. La respiracin ocurre en distintas
estructuras celulares. La primera de ellas es la gluclisis que ocurre en el citoplasma.
La segunda etapa depender de la presencia o ausencia de O2en el medio,
determinando en el primer caso la respiracin aerbica (ocurre en las mitocondrias),
y en el segundo caso la respiracin anaerbica o fermentacin (ocurre en el
citoplasma).La oxidacin de la glucosa es una fuente principal de energa en la
mayora de las clulas. La primera fase de este proceso es la gluclisis, en la cual la
molcula de glucosa (6C), se escinde en dos molculas de cido pirvico (3C). Este
paso produce un rendimiento neto de 2 molculas de ATP y dos molculas de
NADH.La segunda fase de la degradacin de la glucosa es la respiracin aerbica
que ocurre en tres etapas: ciclo de Krebs, transporte de electrones y fosforilacin
oxidativa.En ausencia deO2 el cido pirvico de la gluclisis se convierte en etanol o
cido lctico mediante fermentacin. En el curso de la respiracin las molculas de
cido pirvico se fraccionan en grupos acetilos; los cuales ingresan al ciclo de Krebs.
En este ciclo los grupos acetilos se oxidan por completo a CO2, se reducen cuatro
aceptores de electrones (tres NAD+ y Un FAD) y se forma GTP.La etapa final de la
respiracin es el transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa (se dan
acopladamente). En este paso intervienen una cadena de transportadores de
electrones que transportan los electrones de alta energa aceptados por el NADH y
el FADH2 viajando cuesta abajo hacia el oxgeno. En tres puntos de su descenso por
toda la cadena transportadora, se liberan grandes cantidades de energa que
propulsan el bombeo de protones haca el espacio intermembranoso de la
mitocondria. Esto crea un gradiente electroqumico a travs de la membrana
interna. Cuando los protones atraviesan el complejo ATP sintetasa hacia la matriz, la
energa liberada se utiliza para sintetizar molculas de ATP. Este mecanismo por el
cual se cumple la fosforilacin oxidativa se conoce como hiptesis Quimiosmtica
21
Figura 15. Resumen del metabolismo de los glcidos en clulas eucariotas

2.7VAS ANAERBICAS
El cido pirvico puede tomar por una de varias vas. Dos son anaerbicas (sin
oxgeno) y se denomina fermentacin alcohlica y Fermentacin lctica.
A la falta de oxgeno, el cido pirvico puede convertirse en etanol (alcohol etlico) o
cido lctico segn el tipo de clula. Por ejemplo, las clulas de las levaduras
pueden crecer con oxgeno o sin l. Al inocular clulas de Saccharomyces cerevisiae
sobre un mosto cervecero y almacenarlos en forma anaerobia, las clulas de
levaduras convierten el mosto en cerveza al convertir la glucosa en etanol. Cuando
el azcar se agota las levaduras dejan de fermentar y en este punto la concentracin
de alcohol est entre un 5-8 %segn sea la concentracin de azucares y de la cepa
de levadura utilizada.La formacin de alcohol a partir del azcar se llama
fermentacin.
2.7.1 Fermentacin alcohlica. El cido pirvico formado en la gluclisis se
convierte anaerbicamente en etanol. En el primer caso se libera dixido de
carbono, y en el segundo se oxida el NADH y se reduce a acetaldehdo.Otras clulas,
como por ejemplo los glbulos rojos, las clulasmusculares y algunos
microorganismos transforman el cido Pirvico en cido lctico.En el caso de las
clulas musculares, la fermentacin lctica, se produce como resultado de ejercicios
extenuantes durante los cuales el aporte de oxgeno no alcanza a cubrir las
necesidades del metabolismo celular. La acumulacin del cido lctico en estas
clulas produce la sensacin de cansancio muscular que muchas veces acompaa a
esos ejercicios.
22
Mosto cervecero
Clula de levadura
Glucosa
Lpidos/esteroles
Biosntesis
Glucgeno
Glucosa
Ruta de
EmbdenMeyerhof
Componentes
de la membrana
Celular
Piruvato
Fermentacin
Alcohlica
Etanol
Dixido de
Carbono
Figura 16.Esquema de unaclula de levadura Cerveza en fermentacin. de la

glucosa enla hierba deasimilarpara producirsubproductos de la fermentacinde
etanolyCO2, el oxgeno se asimilaa laproduccin demembrana
23
Oxigeno
2.7.2 La fermentacin lctica. En esta reaccin el NADH se oxida y el cido pirvico

se reduce transformndose en cido lctico.
La fermentacin sea sta alcohlica o lctica ocurre en el citoplasma.

Cuadro 2.Esquema bioqumico del proceso de fermentacin
A)
Alcohlica : 2 cido pirvico + 2 NADH 2 etanol + 2 CO2 + 2 NAD+
B)
Lctica : 2 cido pirvico + 2 NADH 2 cido lctico + 2 NAD+
La finalidad de la fermentacin es regenerar el NAD+ permitiendo que la gluclisis

contine y produzca una provisin pequea pero vital de ATP para el organismo.
2.8LA CIENCIA DE LA MACERACIN DEL MOSTO DE MALTA
2.8.1 Preparacin de la malta.-Tiene como objetivo obtener un paquete rico en
enzimas azucares fermentesibles y polisacridos. Para hacer esto, el grano de
cebada tiene que ser puesto a germinar a una temperatura de 10 a 16 C, una
humedad de 42 a 46 % y un tiempo de 60 horas. Despus, la cebada germinada se
seca usando aire caliente iniciando con un calentamiento suave hasta alcanzar la
temperatura final dependiendo de las caractersticas que se deseen en la malta.
Normalmente las temperaturas de secado para maltas lager son de 55 a 70 Cy de
60 a 95 Cpara maltas ale. Finalmente se realiza la molturacin de los granos
tostados de la malta
2.8.2 Produccin del mosto de malta.Losgranos enteros de malta son sometidos a
la etapa de molturacin para obtener smolas y harinas acompaada de la cascara
que se debe ser conservada lo ms enteras posible, para ser utilizadas como medio
filtrante en el proceso de obtencin del mosto. La malta ya molida se mezcla con
agua formando la pasta (Cuadro3)y en ocasiones se adicionan entre un 10 y 20% de
otros tipos de granos no germinados como fuentes de almidn, tales como el arroz
o el maz, que proporcionan un sabor ms ligero. La mezcla se calienta
gradualmente empleando una distribucin de temperaturas, tiempo y pH que
24
figuran (Cuadros 4,6,5) con la finalidad de activar de forma ptima un consorcio de

enzimas como las proteasas, las -glucanasas la -amilasa y la - amilasa que se
encuentran en la malta para hidrolizar los componentes de la malta, formando una
papilla nutritiva. La solucin se filtra y al lquido obtenido se le aade el lpulo.
Finalmente la solucin se somete a ebullicin por una hora aproximadamente para
obtener el mosto.Las proteasas hidrolizan las protenas de la malta, dando como
resultado la formacin de pptidos y aminocidos, que ms adelante, durante la
fermentacin servirn como nutrientes para la levadura. Las -glucanasas hidrolizan
los glucanos presentes en la cebada; la degradacin de estos polmeros es
importante para disminuir la viscosidad del mosto. La -amilasa hidroliza la amilosa
y la amilopectina originando maltosa y dextrinas. Las amilasas que se activan entre
60 y 70 Chidrolizan los enlaces (14) de la amilosa y la amilopectina en diferentes
puntos del polmero sin acercarse a los puntos de ramificacin y a los extremos de la
cadena.Al llevarse la coccin del mosto se cubren 7 objetivos tecnolgicos:
(1) Concentracin de slidos en el mosto.
(2) Extraccin de los componentes del lpulo.
(3) Inactivacin de las enzimas de la malta.
(4) Esterilizacin del mosto.
(5) Eliminacin de compuestos voltiles indeseables.
(6) Formacin de los compuestos responsables del aroma, sabor y color de la
cerveza mediante reacciones de Maillard.
(7) Coagulacin de protenas y favorecimiento de la reaccin entre taninos y
protenas para la formacin de compuestos insolubles que precipitan clarificando as
el producto.
Despus de enfriar y filtrar la solucin se oxigena el mosto con aire estril hasta una
concentracin de 8-9 ppm de oxgeno disuelto. El mosto sirve como sustrato para el
crecimiento de las levaduras y en la produccin de etanol. As mismo es fuente de
precursores de aroma y sabor.
2.8.3 Fermentacin.En la elaboracin industrial de cerveza se emplean dos clases
diferentes de fermentacin:
(1) Fermentacin alta.- aplicada a la elaboracin de cerveza tipo ale. Durante esta
fermentacin las levaduras forman un aglomerado que flota en el lquido o pueden
flocular a inicios de la fermentacin y hundirse el lquido.
(2) Fermentacin baja.- aplicada a la elaboracin de cerveza tipo lager. En este
tipo de fermentacin las levaduras floculan al finalizar la etapa, en aglomerados que
floculan y sedimentan en el lquido. Estas fermentaciones operan bajo condiciones
de tiempo y temperatura diferentes, sin embargo en ambas la fermentacin se lleva
a cabo en dos pasos: la fermentacin primaria llamada simplemente fermentacin
y la fermentacin secundaria maduracin. Durante la fermentacin el mosto se
somete a temperaturas que van desde 15 a 22C para cervezas ale y desde 7 a
15C para cervezas lager. En esta etapa las levaduras metabolizan los
carbohidratos del mosto para la generacin de etanol y CO2predominantemente. El
25
proceso de maduracin consiste en someter al mosto fermentado a bajas

temperaturas que van desde 4 a 10Cpor un tiempo de 5 a 10 das. La maduracin
proporciona a la cerveza sus caractersticas finales de olor, color, sabor y brillantez.
2.8.4 Procesamiento final. Una vez concluida la maduracin, la cerveza es
clarificada, carbonatada, envasada y pasteurizada para su embalaje y distribucin.
Influencia de la relacin (Agua/Malta)del empaste en el mosto de macerados,
hechos a 60C (140 EF), con una duracin de 180 min. (Datos de Windisch, Kolbach y
Schild, a travs de Hopkins y Krause, 1947)
Concentracin de la masa (Agua/Malta)
Extracto(malta% de materia seca)
Extracto fermentable(malta% de materia
seca)
Extracto fermentable(extracto% del total)
Nitrgenosoluble enforma permanente(%
de maltaseca)
Nitrgenoformol(malta% de materia seca)
2:1
71.7
52.3
2.7:1
77.0
56.3
4.0:1
80.0
58.5
5.3:1
79.9
57.8
72.9
0.57
73.1
0.56
73.1
0.54
72.3
0.53
0.22
0.21
0.20
0.19
Cuadro 3.
Temperaturaptima para algunos procesos de empaste, llevada a cabo por 2-3 h.
Los datos de diversos las fuentes (Briggs et al, 1981;.Hind, 1950; Hopkins y Krause,
1947). Los valores pueden ser sustancialmente diferentes en diferentes condiciones
de maceracin
Proceso
Mayor extraccin (sobre todo para convertir el almidn)
Ms rpido sacarificacin (dextrinizacin)
Mayor rendimiento de azcares reductores
Mayor rendimiento de extracto fermentable
Porcentaje ms alto de fermentacin (%)
Mayor rendimiento de nitrgeno soluble en forma permanente
(Mash veces una temperatura de 1-3 h. Superior. ptimos para
purs ms concentrado)
Mayor rendimiento de formol-nitrgeno
Ms alto PSN menos N-formol
Mayor rendimiento de los buffers cidos
Mxima actividad de la amilasa
Mxima actividad de la fitasa
TemperaturaC
65-68
70
60-63
65
63
50-55
(60)
50-55
55-60
45-55
70
60
40
50-60
Cuadro 4.
Tabla Valores ptimos de pH en la empaste de infusin isotrmico hecho con maltas
plidas una duracin de 1 2 h. a 65,5 C (150 EF). Datos de diversas fuentes.
26
Medida de lo posible lastemperaturas(pur de temperatura, m, y el mosto fro, w),

en la que los valores de pH fueron determinados se indican
Cuadro 5
Cambios en los rendimientos con el tiempo de extraccin y de nitrgeno soluble de
forma permanente (PSN) en empastes hechos a dos temperaturas diferentes (datos
de HT Brown, a travs de 1950 Hind,)
Cuadro 6.
Extractos yextractosde fermentacin, obtenidoenempastes

isotrmicosdurantediferentesperodos de incubacin.(DatosdeWindisch,
27
KolbachundSchild, a travs deHopkinsyKrause, 1947
Cuadro 7.
Figura 17.Curva de maceracin Temperatura Vs. Tiempo
Tincin de polisacridos de la maceracin de la malta antes (color azul) y despus

de la hidrolisis enzimtica (coloracin anaranjado) con solucin de yodo en solucin
28
de yoduro
Figura 18
Cuadro 8
29
Cuadro 9
Figura 19.Absorcin de carbohidratos por la Levadura Saccharomyces cerevisiae
30
2.9CONCEPTO DE DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

Controlar el crecimiento microbiano implica matar microorganismos o inhibir (sin
matar) el crecimiento de los mismos. Para esto se utiliza agentes fsicos y qumicos
.El nombre de los agentes que matan clulas llevan el sufijo cida como por
ejemplo bactericida, germicida, fungicida, viricida, etc. En cambio, el de los agentes
que inhiben el crecimiento de las clulas lleva el sufijo statico como
bacteriosttico, fungisttico, tuberculosttico, etc.
2.9.1 Desinfeccin: Se refiere a la eliminacin de virus y microorganismos pero no
a sus esporas en o sobre el material .El proceso para la desinfeccin implica el uso
de agentes qumicos denominados Desinfectantes sobre objetos inanimados debido
a que estos agentes son txicos para los tejidos vivos. Se pueden aplicar
desinfectantes a mesas, pisos, utensilios, etc. son ejemplo de desinfectantes los
hipocloritos (leja) formaldehido al 8% cloruro de mercurio, compuestos fenlicos
(fenol al 5%) sulfato de amonio y compuestos de amonio cuaternario a 0,25 1,6%
2.9.2 Esterilizacin: Se refiere a la destruccin completa o eliminacin de toda
forma de vida en o sobre un material o sustancia que est siendo esterilizada. No
hay grados de esterilizaciones es incorrecto decir que algo est un poco estril o
muy estril un objeto o sustancia esta estril o no lo est. Los procedimientos para
la esterilizacin involucran el uso del calor, radiacin, remocin fsica de clulas, y
sustancias qumicas.
2.10 MTODOS DE ESTERILIZACIN
2.10.1Esterilizacin por calor seco.La esterilizacin por calor seco destruye los
microorganismos oxidando sus constituyentes qumicos, desnaturalizando las
protenas y los cidos nucleicos de las clulas as como fragmentos de la membrana
celular, se aplica a materiales que deben permanecer secos y que no se alteren a la
temperatura y tiempo de esterilizacin tales como placas petri, pipetas, tubos de
ensayo, matraces balones, y otros de vidrio refractario. Tambin se esteriliza por
calor los materiales de metal como pinzas, tijeras, esptulas, etc. No se pueden
esterilizar por este mtodo los materiales de goma de plstico, las soluciones,
medios de cultivo, ni material orgnico.
Debido a que el calor seco no es tan eficiente se requiere aplicar altas temperaturas
y periodos de tiempo ms largos .As se necesitan 160C durante 2 horas 180C
durante 1 hora en el horno de conveccin. Otra forma de aplicar calor seco incluye
la incineracin para objetos y material orgnico que deben ser destruidos y el
flameado pasando materiales o instrumentos pequeos, como asas de siembra,
pinzas o esptulas de Drigalsky, a travs de la llama de un mechero Bunsen.
31
2.10.2 Esterilizacin por calor hmedo. Esterilizacin con vapor saturado y a

presin .Este es el mtodo de esterilizacin ms eficiente y efectivo. Se hace en un
equipo llamado autoclave .Los auto claves operan manejando dos variables
importantes: temperaturapresin y tiempo habitualmente se emplea 121C /15 psi
(lbf/in2) por 15 minutos pueden usarse tiempos mayores si la carga de material o
volmenes a esterilizar son grandes. Su efectividad se debe a que la alta presin que
se usa incrementa la temperatura del vapor de agua lo cual favorece la capacidad de
matar al microorganismo incluyendo las esporas que son sumamente termodricas.
El vapor a 100C tiene 7 veces ms calor que el agua a la misma temperatura por
que se requiere ms cantidad de calor, para convertir el agua en vapor que para
hacerla hervir.El calor hmedo mata a los microorganismos desnaturando sus
protenas esenciales. El auto clavado es ideal para esterilizar desechos biolgicos
peligrosos, vestimentas quirrgicas, materiales de vidriode jebe o goma, medios de
cultivo, soluciones, entre otros. Sin embargo, determinados materialesde plstico y
ciertos instrumentos mdicos (por ejemplo endoscopios de fibra ptica), no pueden
auto clavarse y se esteriliza con agentes qumicos y gases.
El TDT tiempo de muerte trmica (del ingls thermaldeath time) es el tiempo
requerido para matar una poblacin microbiana conocida en una suspensin
especfica a una temperatura particular. Cuando se incrementa la temperatura
disminuye TDT y viceversa es preferible realizar el proceso a alta temperatura por
cortos periodos de tiempo. Las condiciones ambientales tambin influyen en el TDT
.Cuando el pH es muy cido o muy bsico el TDT disminuye. Las grasas y aceites
hacen ms lenta la penetracin del calor incrementando el TDT. Los TDT son
importantes porque miden la efectividad y rapidez de un proceso de esterilizacin.
El auto clave a 121C /15 lb por 15 minutos excede al TDT de la mayora de
microorganismos. Otro concepto importante es el valor de D (tiempo de reduccin
decimal) que es el tiempo necesario para matar el 90% de una poblacin bacteriana
en condiciones especficas. Esto significa que un valor D, el proceso de esterilizacin
reducir el nmero de bacterias en un exponente o logaritmo. Por ejemplo si el
valor D para la bacteria dada es de 2 minutos ,significa que le tomara 2 minutos en
reducir la poblacin de 103a 102o que le tomara 4 minutos en reducir de 103a101, o
que sern 20 minutos para reducirla de 1010 a 1 clula bacteriana (100) La
temperatura del proceso se puede indicar como un subndice : D 121 El auto clave
consta de una cmara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de de aire
y se mantiene a la temperatura indicada y a la presin indicada durante el periodo
de tiempo determinado. El tiempo de funcionamiento para la esterilidad depende
de la naturaleza del material que se va esterilizar, del tipo de envase y del volumen
del material .Una temperatura de 100C es la suficiente para matar a todas las
formas bacterianas de 2 a 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a stas se
requiere una temperatura de 121C/15 psi por 15 minutos .El auto clave se puede
sustituir por la olla de presin.
32
2.10.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV.Las ondas de radiacin

electromagnticas transmiten energa, por ejemplo ,los rayos X, rayos gamma, luz
ultra violeta (UV) ,luz visible, luz infra roja, la energa que posee la radiacin
electromagntica es proporcional a la frecuencia de la radiacin (ondas por
segundo) . Por esta razn la irradiacin de materiales y sustancias con rayos gamma
y UV es una herramienta poderosa para el control del crecimiento microbiano y
esterilizar.Las microondas no matan por s mismo al microorganismo sino el calor
que generan.La radiacin gamma mata porque genera iones dainos para la salud
como el insuperxido (O2-)y radicales libres de hidroxilo (OH-) Se usa los radio
isotopos de cobalto -60 las endosporas con las formas ms resistentes a la radiacin
como control.La luz UV a una longitud de onda de220 a 300 nm mata a los
microorganismos daando su ADN debido a que se forman enlaces covalentes
entre timinas adyacentes formndose los dmeros de Timina .Las endosporas son
ms resistentes en tanto que las clulas vegetativas que se estn multiplicando
activamente son las ms susceptibles .Las lmparas UV y los materiales a esterilizar
deben estar limpios y no cubiertos para una adecuada esterilizacin
.Los parmetros que deben estandarizarse para la adecuada esterilizacin de un
material dado son las distancias de la lmpara UV hacia el material a esterilizar y el
periodo de tiempo o tiempo de exposicin. Las persona que realiza este trabajo
deben de proteger los ojos y la piel por gafas o cascos de proteccin, guantes,
mandil, para evitar que la luz UV queme la crnea o la piel o promueva cncer a la
piel.Este mtodo de esterilizacin es adecuado para materiales que se daan por el
calor por ejemplo: plsticos, equipos mdicos, entre otros .La esterilizacin por
rayos gamma, de medicamentos, alimentos como frutas verduras, granos, carnes
est aprobado por la FDA (Food and DrugAdministration)
2.10.4 Esterilizacin por Filtracin. Implica separar o excluir fsicamente a todos los
microorganismos del lquido o gases, al pasarlo a travs de filtros de membrana con
poros de 0,2 micras de dimetro para retener virus en el caso de los lquidos y a
travs de filtros HEPA (High EficciencyParticulate Air) en el caso de los gases y el aire.
Para La esterilizacin por filtracin principalmente
de soluciones de compuestos que se desnaturalizan con el calor se aplicafiltros de
membrana con poros de 0,45 micras de dimetro para retener bacterias por
filtracin de los antibiticos, aminocidos, vitaminas, factores de crecimiento,
carbohidratos, protenas, sueros, etc.Los filtros de membrana son de varios tipos,
los hay de nitrocelulosa, acetato de celulosa, policarbonato y PVDF
(Polyvinylidenefluorur) o Fluoruro de polivinilo.
33
2.11CONCEPTO DE CULTIVO PURO

Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismos
es decir desciende de una sola clula. Los cultivos puros supone unas condiciones
no naturales se inician a partir de colonias aisladas UFC, de manera que todos los
individuos del mismo cultivo tengan la misma composicin gentica (un clon de
clulas). Los cultivos puros de clulas se Saccharomyces cerevisiae son esenciales
para tener el control de la fermentacin etanlica ,dirigiendo su metabolismo bajo
condiciones controladas hacia los productos deseados como etanol y dixido de
carbono, cidos orgnicos (voltiles y no voltiles),alcoholes fusel,steres, aldehdos
y cetonas etc, que forman parte del aroma y bouquet de la cerveza.Es necesario
obtener un cultivo puro a partir de una placa de aislamiento primario, que suele ser
un cultivo mixto. En algunas ocasiones es fcil seleccionar las colonias aisladas para
sus subcultivos (volver a sembrar las colonias previamente aisladas a partir de una
muestra) pero en otras pueden presentarse colonias muy amontonadas (cultivo
confluente) de tal manera que es muy difcil elegir colonias individuales aisladas
.Ante esta situacin hay varias estrategias:
-
El subcultivo directo: Consiste en tocar con cuidado, la superficie de la

colonia deseada con el asa de siembra (en punta si las colonias estn muy
cerca entre s) y estriar una nueva placa para el aislamiento.
El uso de medios selectivos: Consiste en subcultivar la colonia de inters

sobre un agar que inhibir el crecimiento de las colonias no deseadas.
El uso de sustancias qumicas inhibidoras incorporadas dentro del Agar

(anlogo a un medio selectivo) que consiste en subcultivar la colonia de
inters sobre un Agar que contenga antibiticos o sustancias qumicas que
inhibirn el crecimiento de las colonias no deseadas.
El uso de discos de antibiticos (anlogo a una placa de Agar que contiene

antibitico, pero ms flexible) que consiste en subcultivar la colonias de
inters sobre la superficie de una placa con Agar y ubicar un disco
impregnado en antibitico diseado para inhibir las bacterias no deseadas.
2.11.1Mtodo de aislamiento de Levaduras Saccharomyces cerevisiae. El
aislamiento de clulas de Saccharomyces cerevisiae partir de un cultivo mixto se
realiza empleando la tcnica de Estriado sobre Agar YPG (extracto de levadura
,peptona ,glucosa) suplementado con antibitico, implica la separacin de clulas
de una asada de muestra de cultivo mixto, fsica y espacialmente estrindola
sistemticamente sobre una superficie de Agar YPG suplementado para la
formacin de colonias aisladas UFC (Unidad formadora de colonia).El xito en
obtener colonias aisladas est en funcin de la cantidad y densidad (poblacin
microbiana) del inculo, lo cual a veces es difcil de juzgar .El crecimiento explosivo
de las clulas de Saccharomyces cerevisiae permite producir un gran nmero de
34
ellas a partir de una nica clula inicial, los microorganismos no deseados se

denominan contaminantes , como bacterias que acompaan a las clulas de
levadura en el cultivo mixto estas son eliminados por el antibitico suplementado
al Agar en las condiciones de crecimiento adecuadas, luego tras un periodo de
incubacin de 48 a 72 horasa temperatura de 22-25, se produce una colonia
observable a simple vista y formada por individuos iguales (unclon de clulas).Las
colonias se forman durante el periodo de incubacin, en el que las clulas
microbianas individuales se reproducen rpidamente las colonias aparecen en un
lapso de 18 a 24 horas.
Composicin de Agar YPG suplementado con antibitico:
Componente
Extracto de
levadura
Peptona
Glucosa
Agar
Tetraciclina
peso en g.
3,0
10.0
20.0
18.0
-3
10 L
(1g/10gH2O)
1000.0
Agua desionizada
Cuadro 10.
Medio dosificado a un pH 6,8
Antibitico: Tetraciclina (Tetraciclina, pastilla 1g en 10 mL de agua desionizada

estril, disolver y tomar 1mL para 1L de medio) conservar en refrigeracin
Condiciones de esterilizacin en auto clave :
Condiciones de esterilidad
Temperatura
121C
Presin
15 lb/pul2
Tiempo
15 minutos
Cuadro 11.
35
2.11.2Caractersticas culturales de la colonia de Saccharomyces cerevisiae.Los

conceptos de cultivo primario, colonia, identificacin presuntiva. Son de gran
importancia para poder aislar y seleccionar una unidad formadora de colonia de
Saccharomyces cerevisiae de un cultivo mixto de microorganismos o tambin
llamado cultivo primario.
1)Una coloniade clulas de Saccharomyces cerevisiae.- es una masa de millones de
clulas procedentes de una nica clula, un clon celular que puede verse a simple
vista llamada unidad formadora de colonia UFC.
2) Identificacin presuntiva.- Tambin llamada preliminar lo primero que se realiza
es la inspeccin de las colonias para determinar sus caractersticas morfolgicas las
caractersticas que se deben describirson: tamao, forma, borde, textura de la
superficie, aspecto, elevacin, apariencia de la luz transmitida, y a la luz reflejada,
consistencia y pigmentacin.
Caracterstica cultural de Saccharomyces cerevisiae
Tamao UFC
Forma
Borde
Superficie
Aspecto
Elevacin
Luz transmitida
Luz reflejada
Consistencia
Pigmentacin
Cuadro 12.
3-5mm
Circular
Entero
Lisa
Butiroso (como mantequilla)
Convexa
Opaca (no hay transmisin)
Brillante
Blanda
Crema- blanco
2.12METODO DE CONSERVACIN DE CEPA

Es importante conservar con viabilidad durante un periodo de tiempo las cepas de
microbios aislados, se denomina Cepario a la coleccin de cultivos de un
laboratorio.
Los cultivos de microorganismos para con determinadas caractersticas son
esenciales para la mayora de los ensayos de microbiolgicos, los cultivos de
referencia o controles de alta calidad son utilizados en un amplio nmero de
determinaciones .Por todo esto solo una sola coleccin de cultivo bien mantenida es
un requisito indispensable para las buenas prcticas de laboratorio .los
microorganismos tiene una tendencia inherente a mutar cuando se le subcultiva con
frecuencia. La conservacin est encaminada al mantenimiento de las cepas durante
largos periodos de tiempo sin que se produzcan cambios en stas. Hay varios
mtodos para conservar microorganismos dependiendo el tiempo que se les desee
mantener viables y de sus caractersticas fisiolgicas. Se tiene mtodos de largo
plazo, mtodos de corto plazo.
36
2.12.1 Mtodos a largo plazo. Son los mtodos que se utilizan para poder
conservar los microorganismos, por un periodo largo de tiempo en aos de tal
manera que al ser requeridos para aprovechar sus propiedades enzimticas ,son
capaces de reaccionar metablicamente.
2.12.2Conservacin por congelacin.Se congelan las clulas en suspensin en un
lquido o caldo de cultivo crecido (joven) con un agente crioprotector (50% de
glicerol para congelar a -20C y al 14- 20% para congelar a -70 -80 C )Los
crioprotectores ms usados son el glicerol y el dimetilsulfnico (DMSO) cuando se
usa el glicerol debe tenerse la precaucin de mezclar las dos fases (glicerol/caldo)
con una micropipeta .Mediante este mtodo las clulas no disponen de agua en
forma lquida por lo tanto no hay crecimiento .Cuando se quiere trabajar con clulas
as
conservadas, se recuperan, subiendo la temperatura .Este es el mejor mtodo de
conservacin desde todos los puntos de vista. La viabilidad de los microorganismos
es de varios aos, Las desventajas son la de requerir congeladores que son costosos
y el riesgo que haya algn fallo del sistema elctrico que produzca una subida no
deseada de la temperatura durante el almacenamiento. El almacenamiento a largo
plazo se puede lograr tambin empleando temperaturas criognicas con nitrgeno
lquido a 196C.
2.12.3Conservacin por liofilizacin.La liofilizacin consiste en la eliminacin del
agua de una sustancia congelada por sublimacin del hielo al vaco. Este proceso
consta de tres etapas, la pre congelacin del producto para asegurar una estructura
completamente congelada; el secado primario con el que se elimina la mayor parte
del agua por sublimacin; y el secado secundario con el que se remueve el agua que
queda ligada.En las clulas conservadas por este mtodo no hay crecimiento puesto
que la actividad de agua es cero igual que la congelacin, pero a diferencia de la
primera, los lifilos no tiene agua en medio debido a la sublimacin. Para este
proceso se emplean los aparatos llamados liofilizadores.Este es un mtodo muy
renovable por su comodidad en el almacenamiento,pues una vez liofilizado las
cepas ,stas se pueden almacenar a una temperatura ambiente de 18-20C o bien
en refrigeracin 4-6C .El xito de la liofilizacin para la preservacin de los
microorganismos no slo depende de los pasos de esta tcnica (congelacin y
deshidratacin) sino tambin de las caractersticas fsico qumicas del medio de
suspensin, el tipo de microorganismos , el estado fisiolgico del cultivo las
condiciones del cultivo ,la concentracin de microorganismos ,entre otros.
2.12.4Mtodo de conservacin a corto plazo. Son los que se utilizan cuando no se
requiere la viabilidad por mucho tiempo o cuando no se pueden emplear los
mtodos anteriores por falta de los equipos necesarios o porque la cepa microbiana
no soporta dichos tratamientos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar
un nico mtodo de conservacin, sino varios. La conservacin de una cepa de
Saccharomyces cerevisiae se realiza en tubos de ensayo con tapa que contiene Agar
37
YPG o Agar Papa Dextrosa APD en plano inclinado sobre el cual se siembra la
suspensin de clulas por estriado, en condiciones de esterilidad y se conserva a
temperatura de 4C por un periodo de tiempo de 4-6 meses
Figura 20Cepario de clulas de Saccharomyces cerevisiae en medio Agar YPG

2.13CULTIVO Y PROPAGACIN CELULAR
El cultivo de microorganismos, consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,
qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada.
En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las
caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la
disponibilidad de nutrientes en el medio.Se entiende por crecimiento celular al
aumento del nmero microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos
referimos al crecimiento de un nico Microorganismo que denominaremos ciclo
celular, sino al demogrfico de una poblacin. En este tema nos centraremos en el
crecimiento celular de levaduras, el estudio que se hace puede servirTambin para
entender el crecimiento poblacional de bacterias y de otros hongos. Denominamos
ciclo celular al proceso de desarrollo de una clula de levadura aislada. A lo largo del
ciclo celular tiene lugar la replicacin del materialgentico, la sntesis de
componentes celulares. Las poblaciones de levaduras crecen de forma explosiva
acumulando grandes nmeros en un periodo de tiempo muy reducido, entender
cmo se produce el crecimiento microbiano esimportante para poder controlarlo y
adems poder potenciar sus beneficios y aplicaciones.
38
2.13.1 Propagacin de levadura en el laboratorio.- El objetivo de la propagacin

de clulas de levadura a nivel de laboratorio consiste enobtener un volumen de
cultivo puro con una concentracin celular ptima para ser utilizado en la primera
escala de fermentacin cervecera. El proceso se realiza utilizando tcnicas
tradicionales microbiolgicas. Esta etapa es de suma importancia, asegurando de
que el cultivo que provee el laboratorio es puro (Axnico) y libre de contaminacin
para poder ser utilizado en la fase de produccin. Para generar en el laboratorio la
propagacin celular de levaduras Saccharomyces cerevisiae es necesario realizar
una serie de cultivos intermedios, un escalamiento de medio de cultivo
progresivamente creciente. Un protocolo tpico se muestra en la figura 36.
Realizando el escalamiento aplicando por lo general un factor alrededor de 1:10
entre cada cultivo. El medio de cultivo adecuado para esta etapa de propagacin es
el caldo estril de extracto de levadura, glucosa y peptona (YPG). Todo el proceso
toma alrededor de dos semanas. El crecimiento de las clulas de levadura en el
medio nutritivo es estimulado por la continua aireacin estril y por un agitador
magntico requerido para alcanzar una ptima tasa de transferencia de oxgeno,
alcanzndose una concentracin celular por el mtodo de Recuento de clulas de
levadura en cmara de Neubauer dentro del rango de 150200x106 clulas/mL con
una vitalidad y viabilidad superior al 98% en el medio de propagacin destinado
como inculo o estrter.
Figura 21.Componentesde un equipo Biorreactor a nivel de laboratorio. Para llevar a

cabola fase depropagacincelular de Saccharomyces cerevisiae. El equipo tiene un
volumen de operacin de 3L y un volumen total de 4L
39
Figura 22.Escalamiento del cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae
2.13.2 Propagacin de levaduras en la planta de Cervecera.-El estrter, inculo o

cultivo semillero proporcionada por el laboratorio, en un depsito pequeo es
propagado a travs de una nueva serie de trasegados y escalando el volumen de
cultivo hasta que la Biomasa de levadura alcance el volumen y la concentracin
celular adecuada para un ptimo proceso fermentativo del mosto de malta de
cebada. Desde un punto de vista microbiolgico la propagacin est lleno de
riesgos, Cualquier contaminacin en esta etapa tendr profundas consecuencias
adversas. El diseo de la planta, su funcionamiento y su acabado interior debe
cumplir los ms altos estndares de higiene. En la planta de produccin de cerveza
La propagacin celular de Saccharomyces cerevisiae deben estar ubicadas dentro de
una habitacin diseada para minimizar el riesgo de contaminacin. El acceso est
limitado a los servicios esenciales del personal, todas las superficies internas estn
hechas de materiales higinicos, el aire de la habitacin es filtrado y la atmsfera
interna se mantiene bajo una presin ligeramente positiva. El mosto utilizado como
medio de propagacin celular durante el escalamiento, preferiblemente debe ser
de la misma calidad que el utilizado en la fermentacin industrial, donde la levadura
debe coincidir en caractersticas con el mosto empleado al inicio, en el cual est
produciendo sus metabolitos deseados. Esto generalmente no es esencial en la fase
de propagacin de la levadura a nivel de laboratorio. La levadura no debe ser
propagada con mostos de alta gravedad (Cahill y Murray, 2000). Para las cepas de
cerveza ale y lager se propagado en 7,5, 11,5 y 17,5 mostos PE. Teniendo en cuenta
que las clulas en crecimiento activo son los ms sensibles y que el etanol es txico
disminuyendo la Viabilidad Celular.
40
El crecimiento de la levadura es estimula por las lneas equipadas con filtros

microbiolgicos de suministro de aire u oxgeno estril al sistema, lneas de escape
o purga, puertos para el muestreo y la inoculacin, capaz de operar en condiciones
aspticas. El rendimiento de la primera fermentacin debe estar dentro del rango
normal en trminos de duracin y el grado de crecimiento de la levadura, la cerveza
resultante debe estar dentro de los parmetros de especificacin. Estos objetivos no
siempre se logran, los Propagadores tradicionales operan sobre el principio
microbiolgico de que la levadura en la medida de lo posible, est en las mismas
condiciones fisiolgicas en cada proceso fermentativo, este supuesto asegurar que
el nuevo ciclo de propagacin de clulas de levadura producir el rendimiento
estndar de fermentacin anterior. Cuando se transfiere el primer mosto, la
concentracin de clulas de levadura generalmente es baja no ms de lo que se
obtiene a partir de un mosto convencional de fermentacin (tpicamente, 50 60x
106 clulas por ml). Los rendimientos bajos de concentracin celular asociados con
los sistemas tradicionales de propagacin, requieren normalmente varios pasos para
generar suficiente biomasa de clulas para iniciar la primera fermentacin. Por otra
parte los factores de escalamiento hacia arriba, entre cada fase, son modestos no
ms de 1:5. Un rgimen tpico requiere cuatro etapas de 1.5, 6.0, 30.0 y 150 hl,
respectivamente, para generar la biomasa de levaduras suficiente para inocular
hasta 800 HL (500 barriles Reino Unido) de mosto cervecero. La duracin de todo el
proceso, incluyendo
la fase de laboratorio, demanda varias semanas de trabajo
el proceso eslento y el uso de mltiples fermentadores eleva el coste de
instalacinmantenimiento y de operacin, los riesgos de contaminacin son
proporcionales al nmero defermentadores, Para satisfacer la creciente demanda
de biomasa celular en las grandes fbricas cerveceras ha sido necesario introducir
mtodos para incrementar el rendimiento de la levadura y acelerar el proceso. El
cultivo de la levadura a una temperatura superior a la utilizada durante la
fermentacin acelera el proceso de propagacin. Los altos rendimientos de biomasa
se pueden obtener
asegurando las condiciones totalmente aerbicas. La
propagacin del inculo aerbico se realiza por lo general en un rango de
temperatura de 2025 C produciendo una Biomasa de concentracin celular de
levadura de 180- 220x106clulas / mL. La fase de crecimiento requiere un periodo
de tiempo de 24 - 48 horas en completarse. Todas las condiciones operativas son
orientadas a asegurar en el medio de cultivo las ms altas tasas de transferencia de
oxgeno que pueda lograrse. Esto requiere del control de dos condiciones
operativas. En primer lugar, un sistema para suministrar oxgeno estril al mosto de
cerveza donde se propaga la levadura, por lo general un anillo de aspersin y en
segundo lugar, una eficiente agitacin mecnica para asegurar que el oxgeno se
dispersa y solubilice por todo el cultivo de propagacin . Las caractersticas
esenciales de los equipos se muestranen la (figura23).El volumen de operacin
debe estar alrededor de 8 hl. El segundo recipiente debe estar dimensionado para
lograr la tasa de concentracin celular deseada en la primera fermentacin. Por
ejemplo, una propagacin celular en un tanque con un volumen de operacin de
100 hL y un recuento de clulas de 200x106 clulas/ml generara la levadura
41
suficiente para inocular 1.300 hL de mosto con una concentracin celular final de
15x106 clulas / ml. En contraste con las tradicionales grandes plantas de
propagacin los factores de escalamiento para la propagacin celular pueden
utilizarse tpicamente 1:10 a 1:20.
Figura 23.Dostanques del sistema de propagacin levaduracervecera.Las

capacidadesde trabajo decada tanque es de 5BRL (8HL) y 85 BRL (136hl), (tomado
deBoulton yQuain, 1999).
2.13.3Efecto Pasteur. Aclarada definitivamente la cuestin del origen de la
fermentacin y ya establecido que las levaduras a partir de una cantidad dada de
azcar y bajo condiciones aerbicas, forman aproximadamente veinte veces ms
biomasa celular que bajo condiciones anaerbicas. EI hallazgo de que el oxgeno
reprime la fermentacin etanlica, es conocido como "Efecto Pasteur", es un
ejemplo modelo de la regulacin metablica.EI proceso de fermentacin de la
glucosa por las levaduras es un proceso anaerbico; no obstante, las levaduras son
aerbicas. Bajo condiciones anaerbicas las
levaduras fermentan de una forma muy intensa pero casi no crecen. Con la aireacin
se reduce la fermentacin en favor de la respiracin. En algunas levaduras la
fermentacin puede reprimirse casi totalmente mediante una aireacin intensa
.Louis Pasteur descubri este efecto hace ya ms de cien aos en sus
investigaciones acerca de los procesos de fermentacin. Desde el punto de vista
42
energtico la clula apuntan a un mecanismo extraordinariamente inteligente, en

condiciones anaerbicas solo se forman 2 moles de ATP por cada mol de glucosa
mientras que en condiciones aerbicas se forman 38 moles de ATP por mol de
glucosa. La clula se ajusta pues a la efectividad en la produccin de energa en
ambas condiciones mediante la regulacin en la transformacin del sustrato.
2.13.4Efecto Crabtree. Descubierto por el bioqumico Crabtree de Herberto, es un
efecto contrario al efecto Pasteur, describe el fenmeno por el cual la levadura
Saccharomyces cerevisiae, en presencia de altas concentraciones externas de
glucosa en un medio aerobio, realiza el ciclo de la Glucolisis como fuente de energa
produciendo etanol con una mnima produccin de biomasa. El aumento de las
concentraciones de glucosa en el medio reprime la sntesis de RNAm de los genes
involucrados en la en la respiracin y el metabolismo oxidativo,interrumpiendo el
siguiente catabolismo energtico, el ciclo de los cido tricarboxlicos, reduciendo la
necesidad del Fosforilacin Oxidativa va el sistema del transporte de electrn, ruta
metablica que produce cantidades apreciables de ATP y por lo tanto disminuye el
consumo del oxgeno. El fenmeno se cree haberse desarrollado como mecanismo
de la competicin (debido a la naturaleza antisptica del etanol). La presencia de
azcares asimilables superiores a 0.16 g/l produce inevitablemente la formacin de
alcohol en el proceso de crecimiento de levadura Saccharomyces cerevisiae an en
presencia de exceso de oxgeno. Es por ello que la produccin de levadura se debe
llevar a cabo con sistemas de "Batch" alimentado con alimentacin programada de
azcares para maximizar la formacin de biomasa e impedir la formacin de alcohol.
Es otro ejemplo de la influencia de un efector externo o de naturaleza qumica sobre
la actividad metablica de un microorganismo
2.14CONCEPTO DE CULTIVO CELULARVIABLE Y VITAL
2.14.1 Evaluacin de la viabilidad de un cultivo de clulas de levadura.El mtodo
clsico para la evaluacin de la viabilidad microbiolgica de un inculo se realiza en
placa sobre un soporte slido en el cual se siembra una determinado volumen del
cultivo celular (Suspensin celular) y luego de un perodo de incubacin, se
contabiliza las colonias resultantes. Cada colonia es un clon de clulas que se deriva
de una clula viva individual. Por lo tanto,la proporcin de colonias formadas en
relacin con el nmero total de clulas presentes en la muestra original,
proporciona una medida de la viabilidad. Es posible acelerar el procedimiento
mediante el conteo de micro-colonias por su comportamiento cultural sobre placas
diapositivas, sin embargo, el mejor mtodo es el de incubacin quese necesita
varias horas para obtener un resultado confiable. (ASBC Comit de anlisis de 1981,
Pierce, 1970).Estos procedimientos requieren mucho tiempo para satisfacer las
necesidades de elaboracin de la cerveza, una respuesta rpida es esencial. Un
mtodos rpidos para la evaluacin de viabilidad en la industria de la cerveza se
basan en el uso de colorantes vitales, el procedimiento ms comnmente utilizado
es la tincin de azul de metileno, aunque muchos otros han utilizado otros
43
colorantes vitales como , cristal violeta, el azul de anilinaRodamina B y eosina Y

(King et al, 1981;. Evans y Cleary, 1985;. Koch et al,1986; Hutcheson et al, 1988). En
particular, una prueba como la tincin de azul de metileno es de gran utilidad como
base de una simple decisin de utilizar o no un determinado lote de levadura como
inculo. Las pruebas de este tipo tambin puede ser til, siempre y cuando la
viabilidad es alta (> 90%) en el establecimiento de un factor de correccin para
asegurar que las tasas viables lanzando por todos los fermentaciones son los
mismos. Estas pruebas son menos tiles en la identificacin de las variaciones
fisiolgicas en levadura de inculo, que pueden producir inconsistencias en el
desempeo de la fermentacin y la cerveza de calidad. Con respecto a las clulas de
levadura, no existe una definicin nica que abarque la viabilidad.
Caractersticas de las clulas viables:
(1) la capacidad de proliferacin celular (la progresin del ciclo celular);
(2) la capacidad de crecimiento celular (metabolismo anablico)
(3) metabolismo detectable en reposo (captacin de oxgeno y la evolucin de
dixido de carbono);
(4) la posesin de la integridad de la membrana (la asimilacin de control selectivo
de la exgena metabolitos y excrecin de los productos derivados).
2.14.2 Evaluacin de la vitalidad de un cultivo de clulas de levadura. Es obvio
que en el seno de una poblacin de clulas de levadura empleadas como inculo no
todas las clulas poseen las mismas caractersticas de Viabilidad, pero todava
tienen un papel activo en la fermentacin. Porejemplo, la clula pierde por
cualquier razn la capacidad de reproduccin, sin embargo, todava puede
contribuir a la fermentacin por la asimilacin de nutrientes y la produccin hacia el
mosto de los componentes de la cerveza. No est claro qu parte de estas
poblaciones es detectados por las pruebas de viabilidad estndar. Tambin se puede
argumentar de que las pruebas sobre la placa o diapositivas para la determinacin
de la viabilidad de un inoculo celular, son consideradas como un mtodo estndar
de referencia, la prueba como tal,que se aplica al inoculo de clulas de levadura no
equivale necesariamente a un crecimiento posterior y rendimiento ptimo de la
fermentacin.Las pruebas simples de viabilidad no son capaces de proporcionar
informacin sobre posibles diferencias en el estado fisiolgico de la fraccin viable
de la poblacin de levaduras.
Estas diferencias podran abarcan todo el espectro de las clulas que coexisten en el
mismo inoculo,a travs de las clulas que se encuentran muy estresadas y tambin
muertas hasta las que se encuentran en una condicin fisiolgica que permitan la
"super-performance en la fermentacin. Por ejemplo, las clulas que contienen
esteroles con alta concentracin
se puede predecir que tiene la capacidad de realizar ms ciclos de reproduccin
durante la fermentacin,que aquellos con niveles basales de
Esteroles. Varias pruebas de vitalidad se han propuesto, presentando informacin
de la condicin fisiolgica de toda la poblacin de clulas de levadura dentro de una
suspensin. La Vitalidaduna eleccin desafortunada de la terminologa, debido a
44
que no tiene sentido estricto, otros cientficosla consideransinnimo de viabilidad.

Por supuesto, se da a entender un mtodo que identifica las clulas de levadura
que produce un rendimiento vigoroso de rpida fermentacinen trminos de
crecimiento de la levadura y etanol. Peroladefinicin ms precisa y til es de
"Pruebas de prediccin de fermentacin. Sin embargo, la prueba de vitalidad se ha
convertido en parte de la literatura cervecera establecida.
Los requisitos de las pruebas de vitalidad son:
(1) Debe ser rpido
(2)Debe ser sencillo
(3) Utilizar los aparatos disponibles en el laboratorio cervecera tpica.
Los resultados de taleslas pruebas son tiles para llegar a una decisin simple que
permita la seleccin preferente de un tipo de inculo adecuado y de los
requerimientos de oxigenacin del mosto cervecero, lo que proporcionara un
rendimiento ptimo del proceso de fermentacin.
2.15MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIN DE MICROORGANISMOS
VIABLES
La importancia de conocer la densidad de un cultivo celular radica en que nos
ayuda a lograr ptimos resultados en la fermentacin porque nos permite predecir
la cintica de crecimiento y por medio de esto podemos determinar cul es el
tiempo necesario para obtener los metabolitos deseados. Existen diferentes
sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los principales
se enumeran a continuacin:
2.15.1 Recuento directo.Se emplea la cmara de Neubauer Improved esta cmara
se utiliza para conteo celular y viabilidad de las levaduras as como el uso de las
frmulas correspondientes en cada caso. Es un proceso sencillo pero requiere de
una determinada paciencia para no equivocarse y conseguir un buen resultado.
2.15.2 Medida de la masa de clulas. El sistema se basa en que las clulas en
suspensin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de
la masa en
Suspensin por tanto, midiendo esta absorbancia se puede estimar aquella. Este es
el parmetro demedida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad
de clulas debe serdel orden de 105/ml.
2.15.3 Recuento de viables. Consiste en sembrar un volumen determinado de
cultivo omuestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero
de viablescontando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de
estas deriva deuna clula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de
vista estadstico, esnecesario contar ms de 300 ufc. En ciertas ocasiones en las que
la densidad de microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por
filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior
colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuadopara que se formen las
colonias.
45
2.15.4 Medida del nmero de partculas. Usando contadores electrnicos de

partculas,
estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o
muertas; pero
nos pueden dar una idea del nmero de las partculas.
2.15.5 Medida de parmetros bioqumicos: tales como la cantidad de ADN,
ARN,Protenas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.
2.15.6 Medida de actividad metablica de las bacterias: como que respiran
producenuna disminucin del potencial Redox del medio en que se encuentran
como consecuenciadel consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a
oxidacin y reduccin talescomo el azul de metileno)
2.16TINCIN VITAL DE CLULAS DE Saccharomyces cerevisiae
Un cultivo celular el cual ser empleado como estrter para la inoculacin en el
mosto cervecero, se observa a simple vista como una suspensin densa y
homognea compuesta de biomasa celular. Es de importancia relevante cuantificar
el nmero de clulas vivas con las que se cuenta para poder ser utilizada como un
inoculo para fermentacin de un mosto cervecero. Al ser llevada una muestra de
inoculo al microscopio no se puede discriminar por observacin directa entre clulas
vivas o muertas. Es necesario emplear la tcnica de Tincin vital con azul de
metilenola cual se fundamenta en
reacciones Bioqumicas intracelulares
especficamente en una Organela llamada mitocondria siendo esta la central
energtica de la clula, donde se
lleva a cabo la oxidacin de los sustratos oxidables por el Oxigeno molecular. El flujo
de electrones en la cadena transportadora donde participa el sistema citocromo, se
encuentra presente en microorganismos aerobios, es una tcnica confiable de
discriminar entre una clula viva de otra muerta. El citocromo oxidasa activa la
oxidacin del citocromo reducido cediendo un electrn al oxigeno molecular el que
a su vez acta como un aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de
transferencia de electrones el oxgeno es el aceptor final del hidrogeno,
reducindolo a dos molculas de agua.El azul de metileno, es una sal bsica, es un
indicador de Oxido-Reduccin, en estado oxidado es de color azul (azul de metileno)
en estado reducido incoloro (Azul de leucometileno). Cuando se agrega como
sustrato artificial, el colorante sinttico reducible azul de metileno sobre las clulas
de Saccharomyces cerevisiae vivas y muertas estas quedan teidas de color azul, el
cual sustituye al aceptor natural de electrones en cualquier parte de la cadena
transportadora de electrones, actuando como reductores del citocromo c del
sistema citocromo oxidasa en las clulas vivas de Saccharomyces cerevisiae,
reduciendo y decolorando la tincin azul de metileno. Las levaduras muertas no
generan flujo de electrones en la cadena transportadora, por lo tanto seguirn
46
teido de color azul. Un cultivo Celular para ser considerado como estrter o inoculo
la tasa recomendada de levaduras como mnimo es del 85% de clulas vivas.El azul
de metileno cuyo nombre cientfico es cloruro de metiltionina es un compuesto
heterocclico aromtico con formula molecular C1C16H18ClN3S
6H18ClN3S.
Molcula de azul de metileno

Composicin de la solucin Azul de Metileno al 1% (w/v)
Azul de metileno.................... 0,3g
Alcohol etlico..................... 30 mL
2.17DILUCIN SERIADA DE LAS SUSPENSIONES CELULARES
Para poder realizar un conteo celular en cmara de Neubauer de una suspensin la
cual tiene una alta densidad celular se debe realizar la tcnica de diluciones seriadas
para evitar las estimaciones errneas y crecimientos confluentes en placas.
Tambin es importante que cuando se hacen cultivos en placa petri el nmero de
colonias no sea demasiado bajo para que el clculo sea estadsticamente
significativo. En la prctica el nmero de colonias por placa oscila entre 30 y 300
para obtener el nmero apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra
.Como raramente se sabe de antemano que el nmero de clulas viables,
normalmente se hace ms de una dilucin, lo ms frecuente es realizar diluciones
decimales de la muestra. Para hacer una dilucin 10-1 se mezclan 0.5 mL de muestra
con 4.5mL de diluyente o 1mL de muestra con 9mL de diluyente, si se necesita una
dilucin de 10-2 se puedemezclar 0.05mL de la muestra con 4.95 mL de diluyente o
0.1mL con 9.9 mL por otra parte, una dilucin de 10-2 se puede hacer de modo
seriado haciendo dos diluciones de tipo 10-1 .En la mayor parte de los casos se
realizan dichas diluciones hasta alcanzar la dilucin deseada. As si se quiere dilucin
10-6 se puede lograr haciendo diluciones sucesivas de 10-2o seis diluciones de 101
.Procedimiento para determinacin de viables usando las diluciones seriadas de la
muestray el mtodo de vertido en placa, el lquido usado para hacer las diluciones
es una solucin salina equilibrada. El factor de dilucin es el inverso de la dilucin en
muestras de 0.1 mL
caso de siembra por extensin puede ser necesario ms diluciones para extender
47
Figura 24. Dilucin seriada de suspensin celular

2.18CAMARA DE NEUBAUER IMPROVED PARA EL RECUENTO DE LEVADURAS
Consiste en la observacin al microscopio de volmenes muypequeos de
suspensiones de clulas. Se usan unos portaobjetos especiales denominados
cmaras de Neubauer Improved. Est diseada de manera de contener una cantidad
fija de suspensin celular lquida. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado
dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos est, a su vez, dividido en 16
cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre
dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos,
queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cmara. Esto determina
que el lquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Para que la medida sea
correcta es necesario que ladensidad de clulas sea del orden de 105 clulas/ml.
Figura 25. Cmara de Neubauer Improved.
48
2.19CRECIMIENTO DE LA POBLACIN CELULAR DEL INCULO

El crecimiento se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes
qumicos de un organismo.Un aumento en el nmero de clulas microbianas de una
poblacin, tambin se puede medir como un incremento de la masa celular, la
velocidad de crecimiento es el cambio en el nmero de clulas o en la masa celular
experimentado por unidad de tiempo .Durante el ciclo de divisincelular, todos los
componentes estructurales de la clula se duplican. El intervalo para la formacin
de dos clulas a partir de una supone una generacin, y el tiempo transcurrido para
que esto ocurra se llama tiempo de generacin, por lo tanto el tiempo de
generacin es el tiempo que se requiere para que la poblacin se duplique, razn
por la cual a veces el tiempo de generacin se llama tiempo de duplicacin.
Durante cada generacin, tanto el nmero de clulas como la masa celular se
duplican.
2.19.1 Ciclo de crecimiento para el cultivo por lotes.En un cultivo Batch o
intermitente en sistemacerrado o cultivo en medio no renovado puesto que no se
aade medio nuevo de cultivo, tambin conocido como cultivo monofsico. Si se
inoculan microorganismos unicelulares en un medio fresco esterilizado y se mide la
densidad del nmero de clulas con respecto al tiempo se puede observar que hay
una curva de crecimiento tpica,no aplicable a una clula asilada sino a poblaciones
de clulas .Esta curva de crecimiento puede dividirse en distintas fases llamadas
fase de latencia,fase exponencial,fase estacionaria y fase de muerte.
A) Fase de latencia: Cuando se inocula una poblacin microbiana en un medio
fresco,por lo general el crecimiento no comienza inmediatamente sino slo
tras unperiodo de tiempo que constituye la fase de latencia, la cual puede
ser breve o larga dependiendo de la procedencia del cultivo y de las
condiciones de crecimiento. Si un cultivo exponencial se inocula en el mismo
medio y en las mismas condiciones de cultivo, no se experimenta un retraso
y el crecimientoexponencial se inicia inmediatamente. Sin embargo si el
inoculo se toma de un cultivo viejo, (fase estacionaria) y se inocula en el
mismo medio se observa normalmente un retraso aunque todas las clulas
del inculo sean viables, es decir sean capaces de reproducirse. Este se debe
con frecuencia a que las clulas carecen de varios componentes esenciales
para dividirse y se requiere tiempo para la sntesis .Tambin se aprecia un
retraso cuando las clulas del inculo han sido daadas parcialmente con
calor, radiaciones y compuestos txicos debido al tiempo requerido para
recuperarse y repara los daos. La fase de latencia tambin ocurre cuando se
transfiere una poblacin de un medio rico a otro ms pobre. Para que ocurra
crecimiento de un medio de cultivo particular, las clulas deben tener un
equipo enzimtico completo que permita la sntesis de metabolitos
esenciales ausentes en el medio .Al pasar a otro medio, se necesita tiempo
para la sntesis de las nuevas enzimas.
49
B) Fase de aceleracin: En esta fase el nmero de clulas vitales y viables se

reproducen hasta alcanzar una tasa mxima de divisin
C) Fase exponencial: Las poblaciones microbianas muestran un modelo tpico
de crecimiento. El modelo del incremento de la poblacin, en el que en cada
periodo fijo de tiempo se duplica el nmero de clulas, se denomina
crecimiento exponencial. En general las clulas en crecimiento exponencial
estn en el estado fisiolgico ms sanos y por ello, las clulas tomadas en el
punto medio del crecimiento exponencial son a menudo las ms indicadas
para estudios enzimticos y estructurales. La mayora de los
microorganismos unicelulares crecen exponencialmente pero estas
velocidades son muy variables siendo estas velocidades influenciadas por las
condiciones ambientales (Temperatura, Composicin del medio de cultivo,
etc.) as como por las caractersticas genticas del organismo. Cuando en un
sistema de coordenadas se representa aritmticamente el nmero de
clulas de un experimento en funcin del tiempo transcurrido, se obtiene
una curva cuya pendiente aumenta de manera constante.Sin embargo es
difcil obtener informacin sobre el crecimiento a partir de ese tipo de
curvas. Si representamos el nmero de clulas en una escala (log10) y el
tiempo en una escala aritmtica (resultando una grficasemilogaritmica)
obtenemos una lnearecta. Esta funcin lineal es un indicador inmediato de
que las clulas estncreciendo exponencialmente adems, las
grficassemilogaritmicas son adecuadas y simples de usar para determinar
tiempos de generacin a partir de una serie de resultados.
D) Fase de desaceleracin: Despus de que el crecimiento celular alcanzara una
tasa mxima de crecimiento es seguida por la desaceleracin de la tasa de
crecimiento y la tasa de divisin.
E) Fase estacionaria: En un sistema de cultivo cerrado, en medio no renovado
o monofsico, como por ejemplo un tubo o un matraz, el crecimiento
exponencial no se puede prolongar de modo indefinido. Es obvio que algo
debe pasar mucho antes de ese tiempo que limite el crecimiento de la
poblacin. Lo que generalmente sucede es que :
A) Un nutriente esencial del medio de cultivo se usa y llega a ser un factor
limitante del crecimiento
B) Acumulacin en el medio de fermentacin de algunos productos de
desecho hasta niveles inhibitorios que hacen que cese el crecimiento
exponencial.
Frecuentemente ocurren ambas cosas. Al producirse esto, la poblacin
alcanza la fase estacionaria, donde no hay aumento ni descenso neto en el
nmero de clulas.Aunque no suele haber crecimiento en la fase
estacionaria,muchas funciones celularescontinan como el metabolismo
50
energtico y algunos procesos biosintticos.En algunos casos puede ocurrir

un lento crecimiento en la fase estacionaria, algunasclulas de la poblacin
crecen pero otras mueren y los dos procesos se equilibran de modo que no
hay aumento ni disminucin netadel nmero de clulas.
F) Fase de muerte: Si una poblacin se incuba despus de que la poblacin
haya alcanzado la fase estacionaria, las clulas pueden continuar vivas y
metablicamente activas, perotambin pueden morir .Si ocurre esto ltimo,
se dice que la poblacin est en fase muerte en algunos casos la muerte se
acompaa de una lisis celular. La fase de muerte de la curva de crecimiento
tambin es exponencial, no obstante la mayora de los caso de velocidad de
muerte celular es mucho ms lenta que la velocidad de crecimiento
exponencial.
Figura 26. Ciclo de crecimiento intermitente
x=Representa la concentracin celular(nmero de clulas/mL)

t= Periodo de incubacin en horas
2.19.2 Cintica de crecimiento en un cultivo intermitente
Crecimiento logartmico o exponencial:
Suponiendo que se utiliza un inculo activo puede acortarse el tiempo de la fase de
latencia y la velocidad de crecimiento de las clulas aumenta progresivamente.
Trascurrido un periodo de tiempo, las clulas crecen a una velocidad mxima
constante, a esta etapa se denomina fase logartmica o exponencial y puede
describirse por la ecuacin:
51
dx = .X..(1)
dt
Dnde:
X = es la concentracin de clulas (mg/mL)
t = es el tiempo de incubacin(h)
= es la velocidad especfica de crecimiento(h-1)
Al integrarse la ecuacin (1) se transforma en :
Xt = X0.et..(2)
Dnde:
X0es la concentracin de clulas en el tiempo 0
Xt es la concentracin de clulas despus de un tiempo t en horas
Tomando logaritmos naturales en la ecuacin (2) se obtiene:
Ln Xt = ln X0 +t
El crecimiento microbiano unicelular es auto cataltico, de modo que la velocidad de
crecimiento celular es proporcional a la concentracin de clulas ya presente. El
crecimiento de un microorganismo en un cultivo puede describirse tambin
mediante el simple clculo algebraico usando el trmino de tiempo de
duplicacintd, que es el tiempo necesario para dividir una clula. Si en un medio de
cultivo se inoculara una clula viable y esta clula creciera a velocidad mxima sin
pasar por la fase de latencia, el crecimiento secuencial del nmero de clulas que se
observara sera: 1, 2,4, 8,16,32,64,128etc. Este crecimiento secuencial puede
representarse expresando el nmero de clulas en base dos. Entonces el resultara:
21,22,23,24,25,26,27,28 etc. Los exponentes (o potencias o ndices)en dicha serie
representa el nmero de generaciones que han ocurrido, por lo que despus el
nmero de generaciones que han ocurrido, por lo que despus de n generaciones
el nmero de clulas del cultivo ser 2n. Si el medio se inocula con N0 clulas, l
nmero de clulas, Ntpresente despus de n generaciones sera:
Nt= N02n.(3)
Nt= N02t/td. (4)
Al tomar logaritmo en base 2 la ecuacin(4) se transforma en :
Log2 Nt= Log2N0 + t/td

Luego entonces
td= t
Log2Nt Log2N0
52
Aunque el trmino de tiempo de duplicacin se utiliza relativamente poco, puede ser til
para convertir la velocidad especfica de crecimiento en el tiempo de duplicacin para lograr
una mejor apreciacin el significado de estos valores. La ecuacin que deriva del tiempo de
duplicacin utilizando el trmino nmero de clulas puede obtenerse tambin
usando el trmino concentracin de clulas. Entonces:

td= t
Log2xt Log2x0
Ya se ha mostrado que:
ln Xt= ln X0 + t
Si en esta ecuacin t = td , entonces Xt= 2X0
ln 2X0 = ln X0 + td
= ln 2
y
td= ln 2
td
Por lo tanto
= 0.693
td
De donde la velocidad especfica d crecimiento de 1 h-1 equivale a un tiempo de
duplicacin de 0.693horas. La velocidad mxima es una caracterstica propia de
cada microrganismos.
2.20 ECUACIONES DE DISEO PARA EL BIORREACTOR IDEAL DISCONTINUO
Modelamiento de
la tasa de crecimiento celular
para un Biorreactor
perfectamente agitado, discontinuo e isotrmico. La utilizacin del sustrato y la
formacin de Biomasa celular de clulas de Saccharomyces cerevisiae. Efectuando
un balance de materia referido. Un sistema fermentativo se define como el volumen
de reaccin limitado por un contenedor fsico (Biorreactor). Donde se lleva a cabo la
degradacin biolgica anaerobia de molculas orgnicas mediante la accin de
ciertas enzimas que actan directamente o como componentesde ciertas bacterias
y levaduras. En el sistema de fermentacin por lote inicialmente se aade al
Biorreactor una solucin rica en nutrientes (concentracin de sustrato, S 0) la cual se
inocula con microorganismos (concentracin de Biomasa, X) que producen un
determinado producto de inters (concentracin de producto, P). A medida que
procede la fermentacin se tiene un estado no estacionario de los componentes del
sistema (S, X y P). La multiplicacin celular cesa por limitacin de nutrientes y/o
53
acumulacin de productos txicos de excrecin celular. Una vez que se ha

alcanzado el nivel deseado de fermentacin (S, X, P), el Biorreactor se vaca, se lava,
se esteriliza y el proceso se repite. Los cambios en los componentes del medio de
fermentacin dentro del Biorreactor producen a su vez cambios en el metabolismo.
El comportamiento del crecimiento de la levadura en el tiempo se representa por
una curva de crecimiento (Figura 41).
2.20.1 Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes
Figura 27.Operacin del sistema de fermentacin por lote.

Balance de Biomasa:
[[1]
[1]
[[D
D]
Definiendo:
[2]
Y Dividiendo entre V se tiene
[3]
Dnde:
V= volumen del medio en el Biorreactor
X= concentracin de microorganismos (Biomasa)
t= tiempo
= velocidad especfica de crecimiento celular
54
Balance de Sustrato:
[4]
Definiendo:
[5]
[6]
Dnde:
S= concentracin de sustrato
qs = velocidad especfica de consumo de sustrato
Balance de Producto:
[7]
Definiendo:
[8]
[9]
Dnde:
P = concentracin de producto y
qp= velocidad especfica de formacin de producto.
55
2.20.2 Ventajas de un Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes:

Dentro de las principales ventajas de un proceso por lote se tienen: bajo riesgo de
contaminacin, flexibilidad operacional cuando el fermentador se utiliza para
distintos productos, manejo eficiente entre lote y lote y costos de operacin bajos.
2.20.3 Desventajas de un Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes:
Las principales desventajas de este modo de operacin son tiempos muertos largos
que se presentan al momento de vaciar, limpiar y esterilizar el Biorreactor para la
siguiente fermentacin; adicionalmente, este proceso requiere de mucha mano de
obra. Dado que se trata de un proceso no estacionario requiere de un mayor
cuidado por parte de los operadores. Por otra parte el control y optimizacin del
proceso se vuelven complejos y existe el riesgo de mayor variabilidad entre lotes.
56
3. HIPTESIS
Es posible optimizar el proceso fermentativo del mosto de malta de cebada en la
produccin de cerveza empleando un inoculo axnico de levadura
Saccharomycescerevisiae, con una concentracin ptima de clulas vitales y viables,
bajo condiciones controladas y dirigidasque gobiernen el proceso fermentativo.
4. OBJETIVOS
Objetivo general
Estandarizar la metodologa idnea en la reactivacin, propagacin y escalamiento
ptimode la biomasa de clulas Saccharomyces cerevisiae,y los fundamentos de
Bioprocesosque controlan y dirigen el metabolismo celular en la etapa de
fermentacin del mosto de cerveza,desde un nivel de laboratorio a un nivel piloto.
Objetivos especficos
1.- Adquirir conocimientos Bioqumicos y Microbiolgicos bsicos para la
comprensin del Bioproceso de reactivacin y propagacin de clulas de
Saccharomycescerevisiae
2.-Adquirir los conocimientos bsicos de Enzimologa, para controlar las condiciones
de la hidrlisis enzimtica ptima, en la produccin del mosto cervecero.
3.- Determinar una metodologa que nos permita conservar de maneraasptica y
estable genticamente elCepario de clulas de levadura Saccharomycescerevisiae.
4.- Determinar una metodologa que nos permita cuantificar la concentracin de
clulasde levadura Saccharomycescerevisiae vitales y viables y poder discriminar
entre clulas vivas de las muertas.
5.- Determinar a nivel de laboratoriola velocidad especifica de crecimiento y el
tiempo de generacin de la biomasa de Saccharomycescerevisiaeen condiciones
ptimaslas cuales sern replicadas a nivel piloto.
6.- Determinar una metodologa que permita lareactivacin, propagaciny el
escalamiento ptimo del inoculo de clulas de levadura Saccharomycescerevisiaeen
la fermentacin del mosto de malta cebada desde el nivel de laboratorio a nivel
piloto.
57
5.- METODOLOGA
Para llevar a cabo los experimentos de produccin de mosto se emplearon las

siguientes materias primas mostradas en la tabla
Materias primas
Malta de cebada
Lpulo
Agua tratada
Levadura Saccharomyces cerevisiae
Marca
MalteraCargill
Cascade 6.1% a.a (cidos alfa)
--------------------------Safale S-40
Cuadro 13.
Para lo composicin de los medios de cultivo de asilamiento y propagacin celular
de Biomasa se utiliz los siguientes insumos:
Insumos y medios de cultivo
Peptona
Glucosa
Extracto de levadura
Agar
Tetraciclina
Alcohol al 90%
cido fosfrico al 80%
Solucin de azul de lactofenol
Caldo YPG
Solucin Azul de Metileno al 1%
Cuadro 14.
Marca
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
5.1 Plan de trabajo

58
Mtodos de esterilizacin
Aislamiento primario de clulas de

Produccin de mosto de malta de

cebada
Propagacin de clulas de levadura a

nivel Laboratorio
Dilucin de una suspensin de clulas

de Saccharomyces cerevisiae
Tincin vital de clulas de

Recuento de levaduras totales y

viables en cmara de Neubauer
Improved
Propagacin de levaduras en la planta

piloto de Cervecera
Cuadro 15
5.2Material y mtodo
59
5.2.1 Mtodos de esterilizacin

5.2.1.1Esterilizacin de instrumentos por calor seco
Materiales y equipos:
-
Mechero Bunsen
Horno de conveccin con rango desde temperatura ambiente hasta 250
300C
Materiales de vidrio y de metal debidamente preparados.
Procedimiento:
1.- El material a esterilizar se deber poner en el horno frio, teniendo en cuenta las
siguientes recomendaciones:
Cada unidad deber quedar separada de los vecinas, los materiales no debern
estar en contacto con las paredes, piso ni techo del esterilizador para evitar que el
papel o los tapones de algodn se quemen. La carga no deber superar el 80% de la
capacidad total de la cmara interior del horno.
2.- Encender el horno y verificar que los instrumentos de medicin de tiempo (1
hora) temperatura(180C) se encuentren en posicin correcta .Esperar que la
temperatura llegue a los 180C o segn se halla seleccionado.
3.- Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzara a descontar el
tiempo de esterilizacin, en este caso 1 hora .Cumplido el tiempo de exposicin
apagar el horno. El material se sacar del horno una vez que este se haya enfriado.
4.- Durante el proceso de esterilizacin no deber abrirse la puerta del horno, de lo
Contrario se tendr que reiniciar el proceso. Adems, el cambio brusco de
temperatura podra romper el material de vidrio.
5.2.1.2Esterilizacin de medios de cultivo por calor hmedo
- Materiales de vidrio o metal
- soluciones y medios de cultivo debidamente preparados.
- Auto clave
Procedimiento:
1).- Colocar el agua destilada o desionizada necesaria para el auto clave hasta la
marca indicada.
2).- Introducir el material a esterilizar evitando de que este toque las paredes.
3).- Cerrar correctamente el autoclave ,cuidado de dejar abierta la vlvula de salida
60
de vapor por donde ser expulsado el aire contenido dentro y que ser desplazado
por el vapor que se va a producir .Si el aire no fue eliminado totalmente de la
autoclave , el manmetro aumentar a 15 libras pero la temperatura no habr
alcanzado los 121C
4).- Cerrar la vlvula cuando la salida de vapor es continua. Cuando el termmetro
indique 121C mantener la temperatura durante 15 minutos para que se efectu la
esterilizacin .Transcurrido este tiempo se corta la fuente de calor.
5).- Dejar enfriar hasta que el manmetro indique cero. Abrir la vlvula de salida de
vapor para expulsar el vapor restante .Abrir el auto clave y retirar el material.
6).-Si el material no est en estado lquido la vlvula se puede abrir rpido para
dejar salir el vapor, pero si es lquido la rpida perdida de presin los hace hervir o
pueden saltar los tapones por lo que es mejor dejar unos minutos a que se enfri
7).-Trasladar los medios de cultivo hacia la incubadora por un periodo de tiempo de
24 horas para la respectiva prueba de esterilidad.
5.2.1.3Esterilizacin por Radiacin Gama y UV
- Materiales de plstico y otros que se deterioran con el calor como el guante,
gradillas micropipetas.
- Cabina de seguridad con lmpara UV con longitud de onda germicida (220-300nm)
-Gafas y casco protector
Procedimiento:
1.- Verificar que la lmpara UV est apagada.
2.- Colocar el material a esterilizar limpio en la cabina de seguridad.
3.- Cerrar la cabina y encender la alampara UV.
4.- Dejar exponer el material a la luz UV durante el tiempo estandarizado en el
laboratorio en funcin de la distancia entre el material y la lmpara a menor
distancia se requiere menor tiempo de exposicin
5.- Debe anotarse en un registro el tiempo que estuvo encendido la lmpara de UV
cada vez que se le utilice .Este registro es importante porque la lmpara tiene un
periodo de vida medio y pasado este tiempo hay que reemplazar la lmpara.
6.- Apagar la lmpara y trabajar con la muestra con mucha asepsia.
5.2.1.4Esterilizacin por Filtracin
- Solucin a ser esterilizada
- Sistema de filtracin con embudo de 300ml, membrana de 0,2 micras
- Porta filtro de membrana
61
- Matraz Kitasato estril.

- Tubos de ensayo estril
- Bomba de vacio
- Manguera para conectar el Kitasato a la bomba de vaco.
- Mechero Bunsen.
Procedimiento:
1.- Colocar la membrana estril en el porta filtros del embudo con una pinza
2.- Poner el embudo sobre un kitasato estril ajustando con el tapn de jebe.
3.-Colocar 100ml a ser esterilizado en el embudo
4.- Encender la bomba de vaco y dejar que la presin negativa permita que el
lquido del embudo fluya hacia el frasco estril. Terminando la operacin apagar la
bomba de vaco.
5.- Trabajar de manera asptica con el lquido esterilizado.
5.2.2Aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae

- Muestra problema (Suspensin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae
contaminada)
- Peptona
- Glucosa
- Extracto de levadura
- Agar
- Tetraciclina
- Agua desionizada
- Alcohol al 90%
1.2 Materiales de Laboratorio:
- Balanza
- Baguetas
- Erlenmeyer de 250 mL
- Mechero bunsen
- Auto clave
- Cmara incubacin
- Esptula
- Etiquetas
- Gotero con cido fosfrico
- Gotero con una solucin de azul de lactofenol
- pH metro
- Algodn
- Probeta graduada 100 mL
62
- Propipeta
- Reloj
- Placas petri de 100x15
- Asa de siembra
- Cmara de Siembra
- Pipeta graduada de 1 mL al 0,01
- Rotulador
- Encendedor
Procedimiento:
1.- Desinfectar la cmara de de incubacin con algodn humedecido en alcohol
2.- Esterilizar las placas Petri desinfectadas y envueltas el papel kraft por el mtodo
de calor seco a 180 C por 1 hora y luego enfriar
3.- En funcin del volumen requerido del medio, suspender en el matraz de 250 mL
las cantidades calculadas de cada componente en agua desionizada.
4.- Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin
5.- Hervir durante un minuto.
6.- Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos
7.- Enfriar a una temperatura entre 45-50 C
8.- Disolver 1 gramo de antibitico tetraciclina en 10mL de agua desionizada estril,
tomar 1mL de la solucin para 1L de medio. Conservar en refrigeracin
9.- En condiciones de esterilidad adicionar por incorporacin la solucin de
tetraciclina y agitar
10.- En condiciones de esterilidad vaciar en placas Petri estriles por triplicado la
solucin de Agar YPG suplementado con antibitico aproximadamente 20mL del
medio por cada placa.
11.- llevar las placas a la cmara de incubacin a temperatura de 25C por espacio
de 48 horas. Se espera que no exista crecimiento en las placas (Prueba de
esterilidad)
12.- Flamear el asa de siembra hasta que todo el alambre de nicrn (o de platino) se
torne rojo
13.- Enfriar el asa de brevemente por unos 10 segundos cerca de la zona de
esterilidad
14.- Destapar el tubo o recipiente que contiene la muestra cerca de la zona estril
del mechero
15.- Introducir el asa en el tubo o recipiente para sacar una alcuota de la suspensin
16.- En condiciones de esterilidad depositar el inculo en un extremo de la placa en
el rea del primer cuadrante
17.- Sembrar por el mtodo de estriado por agotamiento haciendo estras paralelas
de ida y vuelta a lo largo de la placa cubriendo aproximadamente un tercio de ella.
Este es el primer cuadrante.
18.- Flamear el asa y dejar enfriar (como el paso 1y2) girar la placa y volver a hacer
una nueva serie de estras paralelas, a travs y en ngulo con respecto a las estras
63
del primer cuadrante .este es el segundo cuadrante.

19.- Flamear el asa y dejar enfriar (como el paso 1y2) girar la placa y volver a hacer
una nueva serie de estras paralelas, a travs y en ngulo con respecto a las estras
del segundo cuadrante. Este es el tercer cuadrante.
20.- Flamear el asa y dejar enfriar (como el paso 1y2) girar la placa y estriar
nuevamente arrastrando las clulas al tercer cuadrante .este es el cuarto cuadrante.
El objeto de este procedimiento es reducir el nmero de clulas que se estn
diseminando en cada serie sucesiva de estras (evitar el crecimiento confluente),
diluyendo de manera efectiva la concentracin de clulas en el cuarto cuadrante las
clulas deben estar lo suficientemente separadas como para distinguir colonias bien
separadas.
Figura 28. Estriado por agotamiento sobre agar YPG

Para el crecimiento del cultivo estriado por agotamiento se incuban las placas a
25C durante 48 horas
21.- Transcurrido el tiempo de incubacin se procede al aislamiento presuntivo de
las colonias empleando el criterio de comportamiento cultural.
22.- Realizar la tincin con azul de lactofenol, para relacionar la morfologa celular al
microscopio con las caractersticas morfolgicas de las colonias.
23.- Las colonias tpicas son transferidas a caldo YPG e incubadas de18 24 horas
5.2.3Produccin de mosto de malta de cebada

64
- Harina de malta de cebada
- Agua
- Recipiente de acero inoxidable de 20 litros con falso fondo perforado
- Cocina
- Lpulo
- Enfriador de mosto
- Oxigenador de mosto
- Termmetro
- Agitador manual
- pH metro
- Filtro de aire de 0.45micras de porosidad
- Compresor de aire
- Cronmetro
- Solucin de Iodo
Procedimiento:
Para la produccin del mosto cervecero se procede como en el punto 2.11.2 y la
(Figura 30)Temperatura vs. Tiempo.
5.2.4Propagacin de clulas de levadura a nivel Laboratorio
1.- Cepa de Saccharomyces cerevisiae
2.- Asa de siembra
3.- Mechero a gas
4.-Camara de siembra
5.- Alcohol de 96
6.- Algodn antisptico
7.-Caldo YPG
8.- Matraz Erlenmeyer
9.- Shaker agitador
10.- Biorreactor a nivel piloto
11.- Filtros bacteriolgico de 0.45 micras de porosidad
12.- Mangueras sanitarias de siliconas
13.- Flujmetro
14.- Manmetro
15.- Compresor de aire
16.- pH metro
Procedimiento:
65
La clula de levadura es propagada a partir de un tubo de ensayo llamado cepario

que contiene un medio de cultivo solido llamado Agar YPG (Extracto de levadura5 g
/ L, peptona10 g /L, glucosa20 g /L, Agar 18g/L).
Cepario de clulas de
10 mL de caldo YPG
Incubacin esttica por

24h a 20 C
100 mL de caldo YPG
Incubar en matraz en agitacin

durante tres das a 25 C
2L de caldo YPG
Incubar durante tres das a 25 C

Con agitacin y aireacin constante
20 L de mosto cervecero estril
Incubar durante tres das a 25 C

Con agitacin y aireacin constante
CUADRO 16
Estrter destinado a produccin en

planta cervecera
Procedimiento de propagacin de la levadura en el laboratorio. En un medio semidefinido (YPG: extracto de levadura 5 g / L; peptona 10 g /L; glucosa 20 g /L).
5.2.4Propagacin de levaduras en la planta de Cervecera

66
La propagacin y escalamiento de la Biomasa de clulas de levadura se realiza en la

planta de produccin como se indica a continuacin.
1.- Cultivo estrter vital y viable para su propagacin y escalamiento en planta
2.-Medio de cultivo Mosto de malta obtenido por los procedimientos descritos en
los puntos
3.- Biorreactor a nivel planta
4.- Filtros bacteriolgico de 0.45 micras de porosidad
5.- Mangueras sanitarias de siliconas
6.- Flujmetro
7.- Manmetro
8.- Compresor de aire
9.- Mechero bunsen
10.- Agua de enfriamiento
11.- Termmetro
12.- pHmetro
Procedimiento:
Para llevar a cabo la propagacin y escalamiento de la biomasa de Saccharomyces
cerevisiaese procede como en el punto nmero
5.2.5Dilucin de una suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae
- Suspensin celular de clulas de Saccharomyces cerevisiae
- Batera de tubos de ensayo de 15*100
- Solucin salina fisiolgica S.S.F
- Pipeta de 1mL
- Pipeta de 10mL
- Propipeta
- Gradilla
- Matraz Erlenmeyer de 250mL
Procedimiento:
67
1.- Tomar 100mL aproximado de una muestra homogeneizada de suspensin

celular del estrter de Saccharomyces cerevisiae en un matraz de 250mL
2.- Distribuir en cada tubo de ensayo 9mL de S.S.F
3.- Agitar la muestra
4.- Tomar 1mL de esta suspensin celular
5.- Descargar con la ayuda de la pipeta, 1mL de suspensin celular de la muestra
en el primer tubo de ensayo de la batera de tubos de ensayo con 9mL de S.S.F
para tener la primera suspensin de (1/10) tambin de 10-1
6.- Agitar la suspensin celular por 3 minutos
7.- Tomar con la pipeta 1mL de la dilucin de 10 -1 y llevarlo al segundo tubo y
descargarlo, agitndolo por 3 minutos para obtener la dilucin (1/100) tambin 10-2
8.- Tomar con la pipeta 1mL de la dilucin de 10-2 llevarlo y descargarlo, al tubo
tres agitndolo por 3 minutos para obtener la dilucin (1/1000) tambin 10 -3
9.- Con la ayuda de una pipeta Pasteur (micro pipeta) tomar una muestra de la
ltima dilucin10-3 y llevarlo a la cmara de Neubauer para realizar el conteo de las
clulas de Saccharomyces cerevisiae y realizar los clculos para estimar la
concentracin celular del estrter. Si luego de este procedimiento de dilucin la
muestra de clulas en la cmara de Neubauer se observa muy concentrada y
dificulta el conteo se realiza las diluciones siguientes necesarias para poder realizar
el conteo celular con mayor exactitud.
68
Esquema de la dilucin seriada de una suspensin celular
Figura 29. Metodologa de la Dilucin
69
5.2.6Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae.Materiales y equipos:

- Solucin Azul de Metileno al 1% (w/v)
- Muestra problema de en un cultivo de la levadura Saccharomyces cerevisiae
- Asa de siembra
- Placa porta objetos
- Microscopio ptico
- Gotero para la solucin de Azul de Metileno
Procedimiento:
1.- Realizamos un homogeneizado de la suspensin celular problema
2.- Tomar una asada de la muestra homogeneizada
3.- Depositar la muestra sobre una placa portaobjetos
4.- Adicionar una a dos gotas de la solucin de Azul de metileno sobre la muestra
5.- Esperar un periodo de tiempo de 3 a 5 minutos
6.- llevar la muestra teida la microscopio y observar el prepara a un aumento de
40x
7.- Realizar el conteo de clulas coloreadas y decoloradas.
Aclarante: Lacto fenol de Amann
- cido fnico cristalizado.. 10g
- cido lctico 10mL
- Glicerina.. 20mL
- Agua destilada 10Ml
Preparacin: Disolver el fenol con agua destilada, con ayuda de calor suave, aadir
luego elcido actico y la glicerina.
Colorante: Azul de lactofenol
- Lacto fenol de Amann.. 100mL
- Azul de algodn 0.05mL
Preparacin: Agregar al lactofenol, el azul de de algodn y agitar con una bagueta
70
5.2.7 Recuentode levadurastotales y viables en cmara de Neubauer Improved

- Muestra problema (Suspensin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae)
- Cmara de recuento de Neubauer Improved
- Microscopio ptico
- Micro pipeta
- Laminilla
- Algodn
- Agua desionizada
- Alcohol
- Papel limpia lentes
Procedimiento:
1.- Lavar la cmara de Neubauer y la laminilla con agua destilada y alcohol 96%
2.- Secar bien con papel limpia lentes.
3.- Homogeneizar removiendo bien el cultivo en donde residen las levaduras
4.- Tomar con un micro pipeta una muestra
5.- Poner la punta del micro pipeta en una de las dos ranuras de la cmara y por
capilaridad, las levaduras se distribuirn en la cmara
6.- Poner encima de la cmara la laminilla
7.- Si se crea una cmara de aire repetir la operacin desde el principio.
8.- Fijar la cmara de recuento en la platina del microscopio para realizar la
observacin microscpica
9.- Esperar tres minutos antes de contar para que las levaduras se depositen en la
cmara
71
-Llevar la cmara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el

Objetivo de 4X. Observar lo siguiente:
El volumen de la cmara de Neubauer es de 1mm x 1mm x 0.1mm = 0.1mm 3
Figura 30.Con nmero de Objetivo 4x
72
- Las clulas de levaduras que va a contar son pequeas, ubicarse en la cuadricula

central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar de la siguiente manera:
Figura 31. Con nmero de objetivo 10x

- 25 Cuadros medianos: 0.2 mm x 0.2 mm
- 1 Cuadro grande central 1mmx1mm(formado por 400 cuadros pequeos):
1mm2/400 cuadros con una profundidad de 0.100 mm
En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas
presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el
central, lo que garantiza un conteo aleatorio
73
- Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada una de los
campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar
en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cmara se conoce como AP
(alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera
Figura 32. Con nmero de objetivo 40x

- 1Cuadro de 0.2 mm x 0.2 mm = 16 cuadros pequeos de 0.05 mm x 0.05mm =
0.0025 mm2
- Lneas separadoras: 0.025 mm
Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar
el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas dos veces o
que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas que
delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que
definen cuales clulas son contables o cualesestn fuera del campo de conteo. Las
clulas que no tocan la segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de
ella no se incluyen. Grficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las
clulas que tiene una X son las que no se deben contar.
74
Figura 33. Sentido de conteo de clulas en cmara

- Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensayo. Cuando se trata de cuantificar
muestras muy concentradas (D.O > 1.5) ser necesario preparar diluciones seriadas
de la misma con solucin salina isotnica.
- Lavar cuidadosamente la cmara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro
y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona
central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una zona
cuadriculada a simple vista.
- Homogeneizar perfectamente la muestra en un vrtex, tomar inmediatamente una
muestra con una pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cmara y
el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar que la muestra se distribuya por
capilaridad, evitando el exceso que dificultar la evaluacin precisa de la poblacin
microbiana.
- Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y
localizar con el objetivo seco dbil (4X) la zona cuadriculada que se muestra en la
Fig-1
75
- Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se
encuentra dividido en 5x5 cuadros pequeos de 0.2mm por lado (C2) limitados por
triple lnea separadora que miden 0.025 mm. Estos cuadros pequeos a su vez se
encuentran divididos en 16 cuadros ms pequeos (C3) de 0.05 mm de lado.
- Hacer la cuantificacin de clulas con el objetivo seco fuerte (40X), contando el
nmero de clulas que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao
C2 sirven de gua para el cmputo. Se empieza a contar desde la parte superior de
los cuadros C2 y se contina hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de los
cuadros C2; debern contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el
lado derecho del cuadro. Si las clulas tocan la parte inferior o el lado izquierdo no
se cuentan. Este mtodo reduce las posibilidades de contar la misma clula dos
veces.
- Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas
por mL En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que
a continuacin se explican:
a).- Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande (C1), multiplicar directamente
x104para reportar el nmero de clulas por mL.
b).- Con menos de 200 clulas por cuadro grande (C1), ser necesario contar
algunos de los cuadros de las esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4x4).
De esta manera se cuantificarn ms de 200 clulas. Despus dividir el nmero total
de clulas entre el nmero de cuadros empleados y sacar el valor promedio por
cuadro grande. Despus multiplicar este valor por x 104 para reportar el nmero de
clulas por mL.
c).- En el caso de que se observen ms de 200 clulas por cuadro grande (C1), se
Debern contar las clulas de los cuadros de menor tamao (C2) hasta contar cerca
de 200 clulas. Dividir este valor entre el nmero de cuadros usados para la cuenta
para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25
para obtener el nmero de clulas aproximado en un cuadro grande (C1) y despus
multiplicar x104 para reportar el nmero de clulas por mL.
- El factor de 104 por el cual se debe multiplicar el nmero de clulas por cuadro
grande (C1) es porque este cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm
por lado y la cmara tiene una profundidad de 0.1 mm).
# Clulas/cuadro C1 (25cuadros C2) = # clulas/ 0.1 mm 3 X104 = # clulas/mL
- En el caso de que el # de clulas sea muy grande, la suspensin deber diluirse y
se har la correccin como sigue:
# Clulas/mL en la muestra diluida x (factor de dilucin) = # clulas/ mL en la
suspensin original.
- Relacin para determinar el nmero de clulas /mL:
X levaduras .# cuadros cmara . 1000 mm3 . FD = x millones de lev /mL
76
Y cuadros
Volumen cmara
1 cm3 (o 1 mL)
FD: factor de dilucin es la inversa de la dilucin de la suspensin celular.

Contabilizar levaduras viables (% levaduras viables):
1- Mezclar una gota pequea de colorante con una gota pequea de mosto en
fermentacin en elporta objetos normal.
2- Se tapa con un cubre objetos
3- Se visualiza en un microscopio
4- Las levaduras teidas estn muertas y las no teidas estn vivas. Se visualizan 3
campos en la diagonal del cubre como muestra la fig. 6. Se cuentan todas las
levaduras
5- contenidas en cada campo y se hace una lista de vivas y muertas y a partir de aqu
se calcula el porcentaje de viables.
6- Para el clculo del % de viables se cuentan las vivas respecto el total
Nota 1: El colorante empleado es el azul de metileno hay que tener en cuenta que
se hace ms difcil el contaje porque mancha mucho de azul la solucin por lo que
habr que diluirlo antes de mezclarlo con la muestra a analizar. Por simple recuento.
Los colorantes tien las levaduras vivas y muertas.
Solucin salina fisiolgica: Es una solucin a la compuesta por cloruro de sodio
disuelto en agua en una concentracin del 0,87%, la cual es sometida a condiciones
de esterilidad en auto clave. (T 125C, Presin 15lbf/in2, Tiempo 15 minutos)
5.2.8 Determinacin de Azucares Reductores.
La determinacin de azcares reductores se realiz por el mtodo de Fehling
usando azul de metileno como indicador:
1.- Inicialmente se tomaron 10 mL de mosto fermentado
2.-Se llevaron a un aforo de 100 mL con agua desionizada
3.- La mezcla se coloc en una bureta.
4.- En un matraz Erlenmeyer se colocaron 5 mL de solucin A de Fehling y 5 mL de
solucin B de Fehling
5.- Aadir 2 gotas de azul de metileno y 20 mL de agua desionizada
77
6.- La solucin se llev acalentamiento conagitacin

7.- Iniciada la ebullicin se agreg gota a gota el mosto fermentado hasta que se
alcanz un color rojo ladrillo
8.- Se tom la lectura del volumen utilizado y se sustituy en la ecuacin () para
determinar el contenido de azcares reductores en g/L
()
9.-En la ecuacin (), TE tiene un valor de 0.0484
10.-Se determin de la titulacin del estndar de glucosa G es el gasto del mosto
fermentado y FD el factor de dilucin.
5.2.8.1Titulacin del Estndar de Glucosa
1.- Se prepar una solucin estndar de glucosa, 2 en 1000 y se coloc en una
bureta.
2.- En un matraz Erlenmeyer se colocaron 5 mL de solucin A de Fehling, 5 mL de
solucin B, 2 gotas de azul de metileno y 20 mL de agua desionizada.
(i) Solucin A de Fehling. Se prepar una solucin al 3% de sulfato cprico
cristalizado.
(ii) Solucin B de Fehling. Se prepar una solucin al 15% de sal de Rochelle (tartrato
de sodio y potasio) en solucin acuosa al 5% de NaOH.
3.-La solucin se calent con agitacin y una vez iniciada la ebullicin se agreg
lentamente la solucin estndar de glucosa hasta que se alcanz un color rojo
ladrillo.
4.- El volumen de estndar de glucosa gastado (G) fue de 24.2 mL y se sustituy en
la ecuacin () para determinar el valor de la titulacin del estndar de glucosa (TE).
() (
5.2.9 Modelo de regresin simple

78
Modelo de regresin simple este modelo utiliza una sola variable numrica
independiente
(explicatoria) para predecir la variable numrica dependiente
(respuesta) se busca un Modelo razonable para los datos, supondremos que
es una variable aleatorio cuyo valor depende entre otras cosas del valor cuyo
modelo es:
= + *
Para estimar los valores de y utilizamos la tcnica de mnimoscuadrados.
( )
=
nn
- *
Dnde:
=Concentracin de clulas (g/L)
= Tiempo de incubacin (h)
= Velocidad especfica de crecimiento (h-1)
= Ln del numero de clulas al inicio.
n =Nmero de datos
6. RESULTADOS Y DISCUCIN
79
6.1 Mtodos de esterilizacin

En la industria cervecera las operaciones de limpieza y desinfeccin son prcticas
habituales en los lugares y equipos que se encuentran en contacto ntimo con el
mosto de malta y con la cerveza, pero las operaciones relacionadas a la reactivacin
y propagacin de biomasa de clulas de Saccharomyces cerevisiaeadicional mente a
las operaciones de asepsia mencionados es de importancia relevante contar con una
operacin adicional de esterilizacin para que los instrumentos y medios de cultivo
empleados se encuentren exentos de carga microbiana contaminante (Bacterias,
hongos y levaduras) que infecte, evitando la contaminacin y propagacin ya que al
encontrarse en el medio de cultivo se corre el riesgo de proliferar y desplazar a las
clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae que deseamos propagar.
6.1.1Esterilizacin de instrumentos por calor seco
Este mtodo es empleado cuando se requiere eliminar toda la carga microbiana
acompaante incluido sus esporas que pueden ser eliminados de los instrumentos
de vidrio y de metalbajo condiciones de temperatura y tiempo de160 C por dos
horas o de 180C por una hora, los tiempos largos de esterilizacin por este mtodo
en comparacin con el mtodo de calor hmedo se deben a que la capacidad
calorfica del aire es 0,29 kcal/m C mucho menor con respecto a la capacidad
calorfica del vapor de agua de1000kcal/m C. Para poder tener la seguridad de que
se est operacin cumpli su objetivose realiza un control de calidad se toma un
instrumento o material de vidrio de manera aleatoria y se vierte medio de cultivo
en condiciones de esterilidad y se lleva a la incubadora a 37C por 24 horas.
6.1.2 Esterilizacin de medios de cultivo por calor hmedo
Este mtodo permite eliminar la carga microbiana y esporas contaminantes de
instrumentos y medios de cultivo que no soportan esterilizacin por calor seco el
cual presenta la temperatura ms alta y podra caramelizar la glucosa o tambin
formando la reaccin de Maillard entre los azucares y las protenas indisponiendo
estos nutrientes para el metabolismo de la levadura. Por este mtodo se esteriliza
los medios de cultivo agar YPG y caldo YPG que se emplean para el aislamiento y
propagacin de cultivos de Saccharomyces cerevisiae los cuales deben encontrarse
en condiciones de esterilidad para no propagar carga microbiana contaminante.
Este mtodo combina condiciones de presin temperatura y tiempo de 121C /15
psi (lbf/in2) por 15 minutos respectivamente. Para verificar que los medios de cultivo
se encuentran esterilizados se toma una muestra aleatoria del cultivo y se lleva a la
incubadora a 37C por 24 horas.
6.1.3Esterilizacin por Radiacin Gama y UV.
80
Los medios de cultivo YPG suplementados con vitaminas y tetraciclina,las cuales se

caracterizan por ser en su mayora termolbiles como la Riboflavina, Acido
nicotnico, Biotina, utilizados para la reactivacin de cepas de levadura las cuales
debido a las condiciones de conservacin y periodos de guarda prolongados se
encuentran metablicamente afectadas para poder reactivarse con un medio de
cultivo simple. Para poder esterilizar estos medios sin emplear tratamiento trmico
(Calor seco y calor hmedo) se recomienda la esterilizacin por radiacin UV con
una longitud de onda de 254nmfijandouna distancia de 30 cm entre la lmpara de
radiacin con respecto de la muestra, e irradiando por intervalos de 15 segundos
hasta eliminar la carga microbiana acompaante, esto es posible gracias a que la
radiacin UV daa a los microorganismos a nivel del ADN formado dmeros de
timina evitando as su transcripcin y traduccin de informacin gentica para su
replicacin.
6.2Aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae
El mtodo de aislamiento de clulas deSaccharomyces cerevisiaede un cultivo
celular que presentaba contaminacin bacteriana se emple el mtodo de estriado
por agotamiento sobre agar YPG suplementado con antibitico Tetraciclina, Las
tetraciclinas inhiben la sntesis de protenas y son bacteriostticas para muchas
bacterias gran positivas y gran negativas. Actan a nivel del ribosoma bacteriano,
pero para que las mismas tengan acceso a ste es necesario su difusin pasiva por la
membrana celular exterior a travs de los poros hidrfilos, en el caso de la
doxiciclina y la minociclina, que son ms lipoflicas, pasan directamente por la doble
capa de lpidos, pero en todos los casos se requiere de un segundo proceso
dependiente de energa que transporta activamente todas las tetraciclinas a travs
de la membrana citoplasmtica interna. Una vez en el interior de la clula
bacteriana inhiben la sntesis de protenas y se ligan a la subunidad 30S de los
ribosomas, impiden el acceso del aminoacilRNAt al sitio aceptor del complejo
RNAmribosoma, y esto tiene como consecuencia la no adicin de aminocidos a la
cadena peptdica en crecimiento. Una vez eliminada la carga microbiana
acompaante se procede a identificar las unidades formadoras de colonia de
Saccharomyces cerevisiaepor su caracterstico comportamiento cultural para
posteriormente hacer una resiembra sucesiva en placa hacia otro medio de cultivo
de YPG y ser conservado como un Cepario.
81
Figura34. Cultivo primario de Clulas contaminadas de Saccharomyces cerevisiae
Figura 35. Aislamiento de Saccharomyces cerevisiae en placa Petri sobre Agar

YPGsuplementado con antibitico Tetraciclina
82
6.3Produccin de mosto de malta de cebada

En esta etapa el objetivo principal es obtener un caldo fermentesible un medio de
cultivo complejo (Azucares fermentesibles y no fermentesibles oligosacridos
protenas,
oligopptidos
aminocidos,
vitaminas,
minerales
etc.)Compuestodelhidrolizado enzimtico de la mezcla agua y harina de malta,
posteriormente es lupulizado, esterilizado, enfriado y oxigenado para dar las
condiciones adecuadas para una buena propagacin celular y un correcto
metabolismo fermentativo, produciendo como producto de su catabolismo etanol y
CO2.
Durante la etapa de hidrolisacin del mosto de malta de cebada se corre el riesgo de
propagacin de la carga microbiana acompaante por lo que se debe trabajar con
periodos de maceracin no muy prolongados, el oxigenado del mosto es de
importancia relevante para que las levaduras sinteticen cidos grasos y esteroles
necesarios para la sntesis de su material celular para la propagacin de biomasa y
una ruta metablica fermentativa correcta con menos produccin de alcoholes de
fusel y esteroles que van en detrimento de la calidad de la cerveza.
6.4Reactivacin y propagacin de clulas de levadura a nivel Laboratorio
El objetivo en esta etapa es reactivar a partir de un cepario de clulas de levadura
Saccharomyces cerevisiaey propagarlo a nivel de laboratorio en caldo YPG para
obtener un pre inculo axnico en condiciones ptimas de vitalidad y viabilidad, el
cual ser utilizado para la propagacin y escalamiento a nivel de produccin en
planta. Esta etapa es muy delicada requiere de personal capacitado para minimizar
el riesgo de contaminacin del cultivo y la propagacin de carga microbiana que
originara contaminacin de la fermentacin y el enquistamiento de estos en las
porosidad del equipo ocasionando un grave peligro para las instalaciones y
producciones futuras.
83
Figura 36. Cepario e Inoculo de clones de Clulas de Saccharomyces cerevisiae
Figura 37Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiaeSafale S-40 en medio

de cultivo Mosto Cervecero en frasco Carlsberg.
84
Propagacin N1 de Clulas de Saccharomyces cerevisiaea nivel laboratorio

Cintica de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae Safale S-04 en
medio de cultivo Mosto Cervecero en frasco Carlsberg.
T= 18 C; pH = 5.5; VVM= 1.5; Volumen (L)= 2; Tiempo (Horas)= 24
T
(Hrs)
0
2
4
6
8
10
12
14
22
24
Peso seco
(g/L)
0.275
0.280
0.350
0.580
1.200
1.800
1.96
2.100
2.350
2.450
Ln P. Seco
-1.2910
-1.2730
-1.0498
-0.5447
0.1823
0.5878
0.6729
0.7419
0.8544
0.8961
N
Clulas/mL
Ln N
Cel/mL
3.60x105
3.75x105
8.50x105
2.40x106
6.10x106
8.61x106
1.10x107
1.40x107
1.60x107
1.78x107
12.7939
12.8347
13.6530
14.6910
15.6238
15.9684
16.2134
16.4546
16.5881
16.7059
Cuadro 17
Figura 38
85
Azucares
reductores
totales
(g/L)
9.85
8.60
8.13
6.80
4.60
4.45
2.96
1.10
0.60
0.20
Linealizamos la funcin en los puntos:
(Hrs)
N
Cel/mL
12.8347
25.6694
13.6530
54.612
16
14.6910
88.146
36
15.6238
124.9904
64
( ) = 20
(Ln) = 56.8025 ( ) = 293.4178
( ) = 120
CUADRO 18
=
B0 =
56.8025
4
4293.4178 2056.8025
4120 20 2
20
4
37.6212
80
= 9.200625
= 9.200625+0.470265 *
Calculo del tiempo generacional:
td=
0.693
0.474
Ln 2
td =
= 1.47 h
Figura 39
86
= 0.470265 h-1

T
(Hrs)
0
2
4
6
8
10
12
14
22
24
Peso seco
(g/L)
0.255
0.267
0.365
0.605
1.259
1.690
1.929
2.072
2.30
2.39
Ln P. Seco
-1.3665
-1.3205
-1.0079
-0.5025
0.2303
0.5247
0.6570
0.7285
0.8329
0.8713
N
Clulas/mL
Ln N
Cel/mL
3.38x105
3.55x105
8.30x105
2.55x106
6.35x106
8.15x106
1.15x107
1.35x107
1.60x107
1.71x107
12.7249
12.7799
13.6292
14.7516
15.6640
15.9135
16.2579
16.4182
16.5881
16.6369
Cuadro 19
Figura40
87
Azucares
reductores
totales
(g/L)
9.85
8.61
8.15
6.70
4.58
4.43
2.65
1.41
0.61
0.22
(Hrs)
N
Cel/mL
12.7799
25.5598
13.6292
54.5168
16
14.7516
88.5096
36
15.664
125.312
64
( ) = 20
(Ln) = 56.8247 ( ) = 293.8982
( ) = 120
CUADRO 20
=
B0 =
56.8247
4
4293.8982 2056.8247
4120 20 2
39.0988
80
= 0.488735h-1
= 9.206175
= 9.206175 +0.488735 *
td=
0.693
0.488
Ln 2
td =
= 1.42 h
Figura
41
88

T
(Hrs)
0
2
4
6
8
10
12
14
22
24
Peso seco
(g/L)
0.263
0.276
0.368
0.605
1.174
1.850
2.058
2.290
2.400
2.425
Ln P. Seco
-1.3356
-1.2874
-0.9997
-0.5025
0.1604
0.6152
0.7217
0.8286
0.8755
0.8858
N
Clulas/mL
Ln N
Cel/mL
3.56x105
3.70x105
8.55x105
2.55x106
5.95x106
8.85x106
1.20x107
1.55x107
1.70x107
1.75x107
12.7657
12.8213
13.6589
14.7516
15.5989
15.9959
16.3004
16.5564
16.6487
16.6777
Cuadro 21
Figura 42
89
Azucares
reductores
totales
(g/L)
9.85
9.01
8.13
7.03
4.76
3.65
2.27
0.73
0.40
0.25
(Hrs)
N
Cel/mL
12.8213
25.6426
13.6589
54.6356
16
14.7516
88.5096
36
15.5989
124.7912
64
( ) = 20
(Ln) =56.8307 ( ) = 293.5790
( ) = 120
Cuadro 22
4293.5790 2056.8307
=
B0 =
56.8307
4
4120
20 2
37.7020
80
= 9.207675
= 9.207675 +0.471275 *
td=
0.693
0.471
Ln 2
td =
= 1.471 h
Figura 43
90
= 0.471275 h-1
6.5Dilucin de una suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae

La dilucin de un cultivo de clulas de Saccharomyces cerevisiae es un mtodo
utilizado para poder disminuir la concentracin celular en diez veces en cada
dilucin, que nos permita tener un nmero de clulas que puedan ser
contabilizadas realizando el recuento de estas en cmara de NeubaurImproved.En
caso de no realizar la dilucin de un cultivo concentrado de clulas no se podra
observar individualmenteal microscopio a 40x de aumento, solo se alcanzara a ver
una masa difusa.
6.6Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae

La tincin vital con azul de metileno es uno de los mtodos rpidos para poder
discriminar entre una clula viva de otra muerta las clulas vivas al ser teidas de
color azul por el colorante son reducidas y decoloradas a azul de leucometileno las
clulas muertas permanecen teidas de color azul, es de mucha importancia
conocer la concentracin de clulas vitales y viables con la que se cuenta en un
cultivo, el conocer el peso de biomasa de un inoculo no es suficiente ya que
podemos tener cadveres de clulas que no tienen ninguna actividad metablica y
por el contrario se convertira en un foco de contaminacin para la fermentacin del
mosto de malta de cebada, retrasando la fermentacin o detenindola debido a la
inhibicin por exceso de sustrato y la poca concentracin de clulas viables inoculas.
Cuadro del conteo de clulas viables teidas con el colorante vital Azul de metileno
por el mtodo de Neubaur de una suspensin de levaduras Saccharomyces
cerevisiae la cual fue diluida hasta 10-2
Clulas Vivas
15
20
48
35
35
Total: 150
Clulas Muertas
0
0
2
0
1
Total: 3
Cuadro 23.
Porcentaje de clulas viables:
150
x 100 % = 98% De clulas viables
150 + 3
91
Clulas Vivas
19
18
20
36
33
Total: 126
Clulas Muertas
0
0
1
0
1
Total: 2
Cuadro 24. Porcentaje de clulas viables:98.43%
Clulas Vivas
28
23
41
20
37
Total: 149
Clulas Muertas
1
0
1
0
1
Total: 3
Cuadro 25.Porcentaje de clulas viables:98.02
Clulas Vivas
29
20
48
35
35
Total: 167
Clulas Muertas
1
0
2
0
1
Total: 3
Cuadro 26.Porcentaje de clulas viables:98.23
92
Clulas Vivas
41
33
48
39
41
Total: 202
Clulas Muertas
1
0
1
1
1
Total: 3
Cuadro 27.Porcentaje de clulas viables:98.05%

Clulas Vivas
49
23
48
37
35
Total: 192
Clulas Muertas
1
0
1
0
1
Total: 3
Cuadro 28.Porcentaje de clulas viables:98.46%

El cultivo celular cumple con el requerimiento establecido de tener
unaconcentracin mayor o igual al 98% de clulas viables, por tanto puede ser
utilizado como inoculo del mosto de malta para la fermentacin
Figura 44Micrografa de la Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae a

40X
93
6.7Recuento de levaduras totales y viables en cmara de Neubauer Improved

Este mtodo nos permite contar las clulas que se encuentran contenidas en un
volumen de recamara de 0.1mm3 tomado de una suspensin celular llamada
inculo o estrter que ser inoculado en el mosto de malta de cebada. En esta
etapa de conteo se adiciona el colorante Azul de metileno para cuantificar el
nmero de clulas vitales y viables que se encuentra en la muestra de suspensin
celular. Este mtodo es muy prctico y rpido para discriminar entre un inculo de
otro. Este mtodo es mucho ms rpido para cuantificar clulas viables y vitales en
comparacin con el mtodo de recuento en placa de unidades formadoras de
colonia que requieren de 24-48 horas de incubacin a 25C.
Calculo la concentracin celular en (clulas/mL) por el mtodo de Neubaur de una
suspensin de levaduras Saccharomyces cerevisiae la cual fue diluida hasta 10-2
16 cuadros de 0.05mmx0.05mm c/u
Campo 1 extremo superior izquierdo
Campo 2 extremo superior derecho
Campo 3 central
Campo 4 extremo inferior izquierdo
Campo 5 extremo inferior derecho
Nmero de clulas por campo

14
15
13
14
14
Cuadro 29.
- Calculo del promedio de clulas por cuadrado:
Media 14+15+13+14 +14 = 14 levaduras en 16 cuadros de 0.05mmx0.05mm c/u
5
Reemplazando valores en la relacin (1)
14 levaduras x 400 cuadrados x 1000mm3 X 102= 3.5 x 108 de clulas/mL
16 cuadrados 0.1mm3
1 cm3 (o 1mL)
- Respuesta:
La concentracin celular de la suspensin de Saccharomyces cerevisiae es de
3.5 x 108de clulas/mL en la muestra.
94
Figura 45
6.8Propagacin de levaduras en la planta piloto de Cervecera
Esta operacin requiere de fundamentosnetamente de ingeniera qumica para
poder propagar clulas de levadura en grandes volmenes donde los conocimientos
de transferencia de masa y de calor son preponderantes. En nuestra experiencia se
lleg a propagar clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae a partir de un cultivo
preinculo de 2L con una concentracin celular de 15-18x106 clulas para ser
propagada en un Biorreactor de 100 L .Para alcanzar la misma concentracin celular
que el preinculo, el cual ser utilizado como inculo o estrter para iniciar la
fermentacin de 1000 L de mosto de cerveza.
95
Figura46Birreactor Batch modelo Tanque Agitado de capacidad operativa de 1hL

Ubicado en el Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Biotecnologa de la Facultad
de Ciencias Biolgicas de la UNMSM .Responsable Dr. Abad Flores Paucarima
96
Figura 47Vista de perfil del Birreactor Batch modelo Tanque Agitado de capacidad
operativa de 1hL Ubicado en el Laboratorio de Microbiologa Ambiental y
Biotecnologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la UNMSM.
97
Cintica de crecimientoN4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae Safale S-04

sobre medio de cultivo Mosto Cervecero en Biorreactor de Tanque Agitado.
T= 18C; pH = 5.5; VVM= 1.5; Volumen (L)= 100; Tiempo (Horas)= 24
T
(Hrs)
0
2
4
6
8
10
12
14
22
24
Peso seco
(g/L)
0.250
0.278
0.315
0.465
1.500
1.880
2.030
2.230
2.400
2.550
Ln P. Seco
-1.3863
-1.2801
-1.1552
-0.7657
0.4055
0.6313
0.7080
0.8020
0.8755
0.9361
Cuadro 30
Figura 48
98
N
Clulas/mL
Ln N
Cel/mL
3.65x105
3.70 x105
6.13 x105
1.63 x106
4.25 x106
7.36 x106
1.25 x107
1.50x107
1.70x107
1.80x107
12.8077
12.8213
13.3261
14.3041
15.2624
15.8116
16.3412
16.5236
16.6487
16.7059
Azucares
reductores
totales
(g/L)
9.85
9.23
8.36
7.47
5.70
4.52
3.70
2.03
0.75
0.30

N
Cel/mL
12.8213
25.6426
13.3261
53.3044
16
14.3041
85.8246
36
15.2624
122.0992
64
( ) = 20
(Ln) = 55.7139
( ) =286.8708
( ) = 120
(Hrs)
Cuadro 31
B0 =
55.7139
4
=
-
4286.8708 2055.7139
4120
20 2
= 11.4284
= 11.4284+0.41506*
0.693
td =
0.415
td =Ln 2
= 1.67 h
Figura 49
99
33.20519
80
= 0.41506h-1
Cintica de crecimiento N5 de la levadura Saccharomyces cerevisiae Safale S-04

T
(Hrs)
0
2
4
6
8
10
12
14
22
24
Peso seco
(g/L)
0.255
0.267
0.365
0.605
1.259
1.690
1.929
2.072
2.30
2.39
Ln P. Seco
-1.3665
-1.3205
-1.0079
-0.5025
0.2303
0.5247
0.6570
0.7285
0.8329
0.8713
N
Clulas/mL
Ln N
Cel/mL
3.36x105
3.55x105
8.30x105
2.55x106
6.35x106
8.15x106
1.15x107
1.35x107
1.60x107
1.69x107
12.7249
12.7799
13.6292
14.7516
15.6640
15.9135
16.2579
16.4182
16.5881
16.6428
Cuadro 32
Figura 50
100
Azucares
reductores
totales
(g/L)
9.85
9.23
8.38
7.42
5.64
4.505
3.540
2.03
1.01
0.22
(Hrs)
N
Cel/mL
12.7799
25.5598
13.6292
54.5168
16
14.7516
88.5096
36
15.664
125.312
64
( ) = 20
(Ln) = 56.8247 ( ) = 293.8982
( ) = 120
Cuadro 33
=
B0 =
56.8247
4
4293.8982 2056.8247
4120
20 2
39.0988
80
= 9.206175
= 9.206175 +0.488735 *
0.693
td =
0.488
td =Ln 2
= 1.42 h
Figura 51
101
= 0.488735 h-1
Cintica de crecimiento N6 de la levadura Saccharomyces cerevisiae Safale S-04

T
(Hrs)
0
2
4
6
8
10
12
14
22
24
Cuadro 34
Peso seco
(g/L)
0.260
0.268
0.322
0.615
1.512
1.954
2.174
2.185
2.425
2.550
Ln P. Seco
-1.3471
-1.3168
-1.1332
-0.4861
0.4134
0.6699
0.7766
0.7816
0.8858
0.9361
N
Clulas/mL
Ln N
Cel/mL
3.50x105
3.70x105
8.55x105
2.55x106
5.95x106
8.85x106
1.20x107
1.55x107
1.70x107
1.78x107
12.7657
12.8213
13.6589
14.7516
15.5989
15.9959
16.3004
16.5564
16.6487
16.6947
Figura 52
102
Azucares
reductores
totales
(g/L)
9.85
8.60
8.13
6.80
4.60
4.45
2.96
1.10
0.60
0.20
(Hrs)
N
Cel/mL
12.8213
25.6426
13.6589
54.6356
16
14.7516
88.5096
36
15.5989
124.7912
64
( ) = 20
(Ln) =56.8307 ( ) = 293.5790
( ) = 120
Cuadro 35
=
B0 =
56.8307
4
4293.5790 2056.8307
4120
20 2
37.7020
80
= 9.207675
= 9.207675 +0.471275 *
td=
0.693
0.471
Ln 2
td =
= 1.47 h
Figura 53
103
= 0.471275h-1
7 CONCLUSIONES
1.- Las clulas de levadura durante el periodo de conservacin en cepario sobre
agar YPG su actividad metablica celular as como la capacidad de la levadura
Saccharomyces cerevisiae para sintetizar y expresar su capacidad enzimtica intra y
extracelular de manera eficiente quedan inactivadas. Esta es la razn por la cual al
reactivar las clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae de su etapa de
dormancia toman un tiempo aproximado de 2-3 horasllamado etapa Lag.
2.-El proceso de hidrolisis del mosto de malta de cebada (Malta de Cebada
molturada-Agua) requiere de un complejo enzimtico conformado por enzimas
proteolticas y enzimas Amilolticas que alcanzan su mxima actividad cataltica
bajo un perfil de Temperatura, pH, Tiempo, ptimos. Para alcanzar un alto peso de
mosto de 13-14% de azucares totales con una fermentabilidad (Atenuacin) del 7880% el cual ser metabolizado por las clulas de Saccharomyces cerevisiae
3.- El mtodo recomendable de conservacin de las clulas de Saccharomyces
cerevisiae es preservarlo en un cepario de clulas en un tubo de ensayo con tapa
que contiene un medio solido de agar YPG en plano inclinado sumergido en glicerol
a una temperatura de 4Cel cual debe ser renovado cada tres meses por resiembra
sucesiva en placa para asegurar en todo momento contar con un cepario puro
exento de carga microbiana contaminante.
4.- La metodologa rpida y confiable para identificar y cuantificar el nmero de
clulas vitales y viables es realizar la tincin vital en cmara de Neubauer
Improved.Con una solucin al 1% (w/v) de Azul de Metileno en una suspensin
celular verificando si, la cadena transportadora de electrones se encuentra activa
(Clula viva) decolorada o desactivada (Clula muerta)teida para proceder al
reconteo.
5.- La velocidad especfica promedio a nivel de Laboratorio es de 0.476 h-1 mayor al
promedio de la velocidad especfica a nivel piloto que fue de 0.458 h-1 esta
diferencia se debe a que al trabajar en volmenes pequeos en el laboratorio las
condiciones se acercan msa la idealidad .Con un tiempo generacional de 1.453 h a
nivel laboratorio menor al tiempo generacional a nivel piloto que fue de 1.52 h es
decir que a nivel laboratorio las levaduras se reproducen ms rpido
6.- La operacin de reactivacin, propagacin y escalamiento de clulas de levadura
Saccharomyces cerevisiae. Comprende dos etapas bien diferenciadas la primera es
la reactivacin y propagacin a nivel de laboratorio y la segunda etapa corresponde
a la propagacin y el escalamiento a nivel piloto para alcanzar la concentracin
celular necesario, hasta alcanzar un volumen de inculo o estrter del 10% del
volumen de mosto de malta a inocular con una concentracin celular de 15-18x106
de clulas/mL con una vitalidad y viabilidad mayor al 98% para el escalamiento, de
104
nivel de laboratorio a nivel piloto.

8 ANEXOS
8.1LOS ORGANISMOS SON TRANSFORMADORES DE ENERGA
La clula viva se asemeja a una industria qumica donde miles de reacciones ocurren
dentro de un espacio, en este caso, un espacio microscpico. Por ejemplo, los
azcares son convertidos en aminocidos y viceversa. El glucgeno es ensamblado a
partir de miles de molculas de glucosas; las protenas a partir de aminocidos. Por
otro lado, estos polmeros sern hidrolizados cuando las necesidades de la clulas
as lo requieran.
El metabolismo (del griego metabole, cambio) es la totalidad de los procesos
qumicos de un organismo. El metabolismo es el mapa de rutas de miles de
reacciones qumicas que ocurren en la clula. Las enzimas dirigen dichas rutas
metablicas, acelerando diferencialmente reacciones determinadas.
Como un todo, el metabolismo maneja las fuentes de materia y energa de la clula.
Algunas rutas metablicas liberan energa por ruptura de los enlaces qumicas de
molculas complejas a compuestos ms simples. Estos procesos de degradacin
constituyen el catabolismo celular o vas catablicas. Por otro lado, existen vas
anablicas o reacciones qumicas del anabolismo, las que consumen energa para
construir molculas de mayor tamao y complejas a partir de molculas ms
simples. Las vas metablicos se interceptan de tal forma que la energa liberada de
reacciones catablicas (reacciones exergnicas) puede utilizarse para llevar a cabo
reacciones anablicas (reacciones endergnicas) As, la transferencia de energa del
catabolismo al anabolismo se denomina acoplamiento energtico.
La energa ha sido definida como la capacidad de realizar trabajo, de producir una
modificacin en la materia. Puede adoptar la forma de calor, luz, electricidad
movimiento, etc.
Se reconocen dos clases principales de energa:
1.- Energa potencial
2.- Energa cintica
Energa Potencial.- Es la capacidad de realizar trabajo en virtud de la posicin o el
estado de una partcula. Por ejemplo, una piedra en la cima de una montaa tiene
energa potencial, a medida que rueda por su ladera, la energa potencial se
transforma en cintica. La energa derivada en ltima instancia del sol, se almacena
en las molculas de los alimentos como energa qumica. Esta ltima es un tipo de
energa potencial. Luego dentro del organismo, se producen reacciones qumicas
que transforman la energa potencial en calor, movimiento o alguna otra forma de
energa cintica. Todas las formas de energa son, por lo menos en parte,
interconvertibles. Los sistemas vivientes constantemente transforman energa
potencial en cintica o viceversa. La energa qumica que los organismos utilizan en
las reacciones metablicas, proviene de los enlaces qumicos de los glcidos, lpidos
105
y protenas. Esta energa potencial que guardan los enlaces qumicos, puede ser
aprovechada parcialmente por el organismo cuando se rompen esos enlaces
qumicos. La energa que no puede ser atrapada por el organismo, se disipa como
calor. En condiciones experimentales controladas, puede medirse y compararse la
cantidad de energa que entra y sale de un sistema determinado.La termodinmica
es el estudio de la energa. El anlisis de las transformaciones energticas que
ocurren en la materia viva se llama termodinmica. Los investigadores llaman
sistema para denotar una porcin de materia bajo estudio. El resto del universo
(todo aquello fuera del sistema) es el entorno. Los organismos son sistemas
termodinmicos obligatoriamente abiertos, es decir intercambian materia y energa
con el entorno.La termodinmica tiene dos leyes fundamentales que gobiernan las
transformaciones energticas de la materia y por lo tanto tambin rigen para los
seres vivos.
8.1.1 La Primera ley de la Termodinmica. Tambin conocida como de la
Conservacin de la Energa establece que la energa puede convertirse de una forma
en otra, pero no se la puede crear ni destruir. La energa total de un sistema y su
ambiente, por lo tanto se mantiene constante a pesar de todos los cambios de
forma.En todas las conversiones energticas, cierta energa til se convierte en calor
y se disipa. De todos modos, en una reaccin qumica, la energa de los productos
de la reaccin ms la energa liberada en la misma, es igual a la energa inicial de las
sustancias que reaccionan.
Figura 54. Flujo de energa y materia en un ecosistema.
106
Las mitocondrias de los eucariotas (incluso plantas) utilizan las molculas orgnicas
producto de la fotosntesis como combustible para la respiracin celular, pero
tambin consume el oxgeno liberado en la fotosntesis. La respiracin libera la
energa almacenada en las molculas orgnicas y genera ATP, el cual se utiliza para
el trabajo celular. Los productos de desecho de la respiracin, CO 2 y H2O, son las
molculas que los cloroplastos utilizan como sustrato de la fotosntesis. Por lo tanto,
las molculas esenciales de la vida son recicladas, pero la energa no. La energa
ingresa al ecosistema como energa lumnica y sale como energa calrica.
8.1.2 La Segunda ley de la Termodinmica.Establece que todos los intercambios y
conversiones de energa, si no entra ni sale energa del sistema en estudio, la
energa potencial del estado final siempre ser menor que la energa potencial del
estado inicial. Por ejemplo las piedras ruedan siempre cuesta abajo, nunca lo hacen
haca arriba.
En termodinmica se designa como energa dependiente de un alto grado de
ordenamiento a la energa potencial, mientras que a la energa cintica molecular se
la considera como energa con un grado reducido de ordenamiento. A medida,
entonces, que la energa potencial se transforma en cintica, el desorden aumenta y
utilizamos la expresin entropa, para caracterizar el grado de desorden de un
sistema (las clulas NO estn desordenadas, as que tienen baja entropa). En la
naturaleza, el desorden es un estado ms probable que el orden y la entropa, como
medida del desorden, se convierte en una funcin que tiende a crecer
constantemente.El contenido de energa potencial de los compuestos qumicos est
representado por la fuerza que mantiene unidos a los tomos y molculas y cuando
las sustancias qumicas reaccionan, parte de esta energa se libera como calor y otra
parte puede ser convertida en trabajo. Esta fraccin de energa disponible para el
trabajo se denomina energa libre o entalpa. En otras palabras es el monto mximo
de trabajo que puede obtenerse de un sistema.
La energa libre: un criterio para cambio espontaneo los organismos solamente
pueden vivir a expensas de la energa libre adquirida del entorno.La cantidad de
energa libre de un sistema se simboliza con la letra G. Hay dos componentes para
G: la energa total del sistema (H) y su entropa (S). La energa libre se relaciona con
estos factores de la siguiente manera:
G = H TS
Con la T (temperatura, en grados Kelvin) para temperaturas absolutas. Como se ve,
la temperatura aumenta el trmino de la entropa en la ecuacin. Esto tiene sentido
si se recuerda que la temperatura mide la intensidad del movimiento de las
molculas al azar (calor), lo que provoca desorden. Entonces, esta ecuacin enuncia
queno toda la energa almacenada en un sistema (H) est disponible para el trabajo.
El desorden del sistema, el factor de entropa (S), se resta a la energa total para
calcular la mxima capacidad del sistema para realizar trabajo til.
107
Cmo el concepto de energa libre ayuda a determinar si un proceso determinado

puede ocurrir espontneamente? En la ecuacin de ms arriba, la energa libre (G)
es considerada como una medida de inestabilidad del sistema, o sea su tendencia a
cambiar a un estado ms estable. Por lo tanto, aquellos sistemas que tienden a
cambiar espontneamente a uno ms estable son los que tienen mayor energa,
baja entropa o ambos. La ecuacin de G considera estos dos factores los cuales
estn consolidados en el contenido de G del sistema en estudio. Ahora se puede
establecer un criterio para cambio espontneo: en cualquier proceso espontneo la
energa libre de un sistema decrece.Los cambios de energa libre cuando un sistema
va desde un estado iniciala un estado finales representado por:
G= G estado final - G estado inicial
G = H - T. S
Finalmente, para que un proceso ocurra espontneamente, el sistema debe ceder
energa (decrece H) o perder orden (se incrementa S), o ambos. Cuando los cambios
en H o en S son grandes, G tiene un valor negativo.
Las reacciones metablicas son exergnicas o endergnicasLas reacciones
metablicas pueden ser clasificadas en exergnicas (aquellas que liberan energa) o
endergnicas (aquellas que consumen energa) tomando en cuenta sus cambios de
energa libre.En una reaccin exergnica hay una liberacin neta de energa libre.
Puesto que los reactantes pierden energa libre (G), G es negativa para una
reaccin exergnica. En otras palabras, las reacciones exergnicas ocurren
espontneamente.Las reacciones endergnicas toman G de su entorno. Esto se
debe a que esta clase de reacciones almacenan ms energa libre (G) en las
molculas, por lo tanto G es positivo. Tales reacciones no son espontneas.
De lo anterior, se concluye que si un proceso qumico es exergnico en una
direccin, entonces el proceso inverso debe ser endergnico.
8.1.3 Desequilibrio Metablico: Clave de la vida. Las reacciones qumicas del
metabolismo son reversibles y podran equilibrarse slo en un medio aislado como
un tubo de ensayo. En los sistemas qumicos en equilibrio G es cero y sin energa
libre no hay trabajo, por lo tanto una clula que ha alcanzado su equilibrio est
muerta. Este desequilibrio metablico es una de las caractersticas que define a la
vida y esto se mantiene gracias a que en las vas metablicas los productos no se
acumulan, siendo sustratos de otras reacciones y por lo tanto no alcanzndose
nunca el equilibrio. Por ejemplo, durante la respiracin celular, la glucosa y otros
combustibles energticos son degradados y el dixido de carbono es eliminado al
medio interno y luego expelido al exterior con lo cual la clula no alcanza nunca su
equilibrio y contina trabajando. Este simple ejemplo nos sirve para comprender la
importancia que reviste para los organismos vivos ser sistemas abiertos. La molcula
de ATP es responsable de la mayora de los procesos de acoplamiento energtico en
las clulas. Como se recordar, una estrategia clave de la bioenergtica es el
acoplamiento energtico, es decir el uso de un proceso exergnico para llevar a
cabo uno endergnico.
108
8.1.4 El adenosntrifosfato (ATP).la moneda de la clula, transfiere la energa

liberada por la ruptura de las uniones qumicas en los procesos exergnicos hacia las
reacciones endergnicas, es decir las reacciones que consumen energa.
Figura 55 Molcula de ATP

.El enlace entre el segundo y el tercer fosfato es un enlace rico en energa. Para
establecerlo se necesit de un gran aporte energtico, esto es, de la energa libre
obtenida del entorno por la clula. Por otro lado, su ruptura resulta en la liberacin
de esta energa, la que puede ser empleada para los distintos tipos de trabajos
celulares.
En la mayora de los casos, la fuente inmediata de energa que potencia el trabajo
celular es el ATP. Esta molcula es tambin conocida como un transportador o
intermediario energtico.
Figura 56. El ciclo del ATP.
109
La energa liberada en las reacciones catablicas se usa para fosforilar ADP,

generando ATP. La energa almacenada en el ATP se utiliza en la mayora de los
trabajos celulares. Por lo tanto, el ATP acopla los procesos productores de energa
de la clula a los consumidores de energa.
Muchos de las reacciones de los metabolismos son reacciones de xido-reduccin
Los electrones poseen distintas cantidades de energa potencial segn su distancia
respecto del ncleo del tomo y la atraccin del ncleo por los electrones. Al
aportar energa, el electrn pasa a un nivel energtico ms alto, pero sin la energa
adicional, el electrn permanece en el nivel energtico ms bajo disponible para l.
Las reacciones qumicas son transformaciones energticas en las cuales la energa
almacenada en los enlaces qumicos se transfiere a otros enlaces qumicos recin
formados. En estas transformaciones los electrones pasan de un nivel energtico a
otro. En muchas reacciones los electrones se transfieren de un tomo o molcula a
otro. Estas reacciones muy importantes en los sistemas vivientes, se conocen
como:
A) Reacciones de Oxidacin-Reduccin (Redox).- La prdida de un electrn se
conoce como oxidacin y el tomo o molcula que pierde el electrn se ha
oxidado. La prdida de electrones se llama oxidacin porque el oxgeno que
atrae con fuerza a los electrones, es la mayora de las veces el receptor de
los mismos.
B) Reacciones de Reduccin.- Por el contrario, es la ganancia de electrones. La
oxidacin y la reduccin siempre ocurren simultneamente, porque el
electrn que pierde un tomo es aceptado por otro, que se ha reducido en el
proceso.
En los sistemas vivientes muchas veces los electrones son transferidos con un
protn, es decir, es un tomo de hidrgeno. En tal caso la oxidacin implica una
prdida de tomos de hidrgeno y la reduccin la ganancia de estos. La energa de
las molculas es liberada en el transcurso de las reacciones de oxidacin. Durante el
transcurso de sucesivas y graduales reacciones de oxidacin, la mayor parte de la
energa qumica contenida en los alimentos es liberada de manera secuencial. De
esta manera, se logra la eficaz captacin de la energa liberada en enlaces de alta
energa como los del ATP.
Toda oxidacin de un tomo o de una molcula est asociada a la reduccin de otro
tomo u otra molcula. Durante las reacciones de oxidacin pueden perderse
hidrgenos (H). Estos se pueden disociar en un protn (H+) y en un electrn (e-). En
un sentido general, toda remocin de e- de cualquier tomo o molcula constituye
una reaccin de oxidacin. Este e- pudo haber sido removido de un H. Luego el H+
110
puede permanecer en la molcula a la que conformaba o puede pasar al medio.Por

otro lado, la reduccin de un tomo o molcula puede implicar la ganancia de
hidrgeno o e-.Existen molculas intermediarias en las reacciones de xidoreduccin: la nicotinamida adenina dinucletido (NAD+), la nicotinamida adenina
dinucletido fosfato (NADP+) y la flavina adenina dinucletido (FAD).
Las siglas de las coenzimas anteriormente expuestas representan las molculas
oxidadas. Las formas reducidas se representan: NADH + H+; NADPH + H+; FADH2,
respectivamente.
Por ejemplo, el compuesto XH2 es oxidado, NAD+ es reducido:
XH2 + NAD+ + X+ + NADH + H+
Figura 57. Oxido-reduccin de la coenzima NAD+

8.1.5 La clula puede realizar tres clases principales de trabajo. Donde se requiere
energa:
Trabajo Mecnico: como el batido de cilios y flagelos, la contraccin de las

clulas musculares, el fluir del citoplasma dentro de la clula o el movimiento de los
cromosomas durante la divisin celular.
Trabajo de Transporte: el bombeo de sustancias e iones a travs de la

membrana en contra de la direccin del movimiento espontneo.
Trabajo Qumico: El impulso de reacciones endergnicas, que no ocurriran
espontneamente, como la sntesis de los polmeros a partir de sus monmeros.
111
Figura 58. Tipos de trabajo celular que utilizan ATP
8.2LAS ENZIMAS
.
Figura 59. Perfil de energa de una reaccin exergnica. La curva punteada indica el
curso de la reaccin sin enzima. La curva continua el curso de la reaccin en
presencia de la enzima Segn su naturaleza los catalizadores pueden ser qumicos o
biolgicos
112
Cuadro 36.
Diferencias entre catalizadores biolgicos y qumicos

Biolgicos
Qumicos
Son especficos para una determinada
Aceleran cualquier reaccin
reaccin qumica o para un grupo de
inespecficamente.
reacciones qumicas para un sustrato o
grupo de sustratos.
Son protenas mayoritariamente ( hay
Son sustancias simples finamente
ARN (Ribozimas) con funcin enzimtica. divididas.
Son saturables
No son saturables.
Son altamente eficaces (son eficaces en Son medianamente eficaces.
bajas concentraciones).
Puede ser regulada su actividad cataltica. No pueden ser regulados.
Son termolbiles y su actividad puede
No son termolbiles ni se alteran con
variar tambin de acuerdo al pH del
cambios de pH.
medio.
Una enzima puede estar formada por una sola cadena de polipptido, consistir en
subunidades mltiples o requerir de componentes no proteicos. En general las
reacciones catalizadas por enzimas se llevan a cabo a presin, temperatura y pH
moderado.
8.2.1 Clasificacin de las Enzimas. Desde el punto de vista estructural podemos
clasificar a las enzimas en simples y conjugadas (de la misma forma que hemos
clasificado a las protenas). Clasificacin de las enzimas segn su estructura:
1.-Enzimas simples: son aquellas que constan solo de una estructura proteica.
Pueden estar formadas por una o varias cadenas polipeptdicas.
2.- Enzimas conjugadas: tambin llamadas holoenzimas poseen en su estructura una
parte no proteica denominada cofactor y una parte proteica que se denomina
113
apoenzima. Para que estas enzimas acten como catalizadores es necesario que la
apoenzima se una al cofactor. El trmino cofactor puede aplicarse tanto a un In
como a una molcula orgnica de naturaleza variable (grupo prosttico y
coenzimas). Las coenzimas funcionan como portadores de grupos qumicos
pequeos como ser acetilo, metilo o bien protones y electrones. Las coenzimas se
unen no covalentemente a la apoenzima permitiendo que la holoenzima as
formada lleve a cabo reacciones que la apoenzima sola no puede efectuar. Por
ejemplo, ninguna de las cadenas laterales de los aminocidos es capaz de
transportar electrones pero cuando se agrega por ejemplo la coenzima FAD+,la
protena adquiere esta funcin. Las molculas orgnicas que estn fuertemente
unidas a la apoenzima se denominan grupos prostticos.
Muchas coenzimas derivan de vitaminas solubles en agua como ser las del grupo B
Cuadro 37.
Vitaminas hidrosolubles , sus coenzimas derivadas y sus funciones
Vitamina
Coenzima derivada Abreviatura Funcin
Pirofosfato de
TPP
Descarboxilacin y
Tiamina (B1)
tiamina
transferencia de grupos
acilo.
Flavinamononuclet FMN
Portadores de hidrgeno y
ido
Riboflavina (B2)
electrones en oxidoFlavina y adenina FAD
reducciones
dinucletido
Nicotinamida y
NAD+
adenina
Portadores de hidrgeno y
dinucletido
cido Nicotnico
electrones en oxidoNicotinamida y
NADP+
reducciones
adenina
dinucletido fosfato
Piridoxina,
Transaminacin y
piridoxal y
decarboxilacin
piridoxamina (B6)
cido Pantotnico Coenzima A
CoASH
Transferencia de acilos
Enlazada
Biotina
covalentemente a
Carboxilacin
carboxilasas
cido Flico
Tetrahidrofolato
TH4
Transferencia de un
carbono
Coenzima de
Reordenamientos,
Cobalamina (B12)
cobalamina
transferencia de metilos
114
Otra forma de clasificarlas es de acuerdo con las reacciones que catalizan, como se
indica el cuadro 4, a continuacin.
Cuadro 38.Clasificacin de las Enzimas (segn International Union of

Biochemestry)
Clase
Tipo de reaccin catalizada
Sntesis de componentes a travs de la ruptura oxidativa o
reductora de un enlace de alta energa.
1Oxidorreductasas p. ej. alcohol deshidrogenasa
alcohol + NAD+ colina + glutamato
Transferencia de un grupo funcional de una molcula a
otra.
2 - Transferasas p. ej. aspartatoaminotransferasa
L-aspartato + 2-oxoglutarato 2- oxalacetato + 1-Lglutamato
Ruptura de enlaces por hidrlisis
3 - Hidrolasas
p. ej. Acetilcolina + H2O 2 oxalacetato + L- glutamato
Ruptura de enlaces por eliminacin
p. ej. Piruvato descarboxilasa
4 - Liasas
2 oxocido aldehdo + CO2
Modificacin de la forma o del ordenamiento espacial de
las molculas.
5 - Isomerasas
p. ej. Fosfogliceratomutasa
2-fosfoglicerato 3- fosfoglicerato
Unin de molculas usando la energa que se deriva de la
hidrlisis de los enlaces de alta energa
p. ej. Acetil- CoAligasa
6 - Ligasas
ATP + acetato+ CoA AMP + acetato + CoA + pirofosfato +
acetil-CoA
8.2.2 Sitio Activo. Es el sitio en el cual el o los sustratos se unen a la enzima. En
general estos sitios se encuentran en el interior de la estructura proteica, formando
hendiduras o bolsas, de manera que el sustrato pueda experimentar un mximo de
interacciones con la enzima. De toda la estructura de la enzima, que en realidad son
molculas enormes, solo una parte muy pequea interacta con el sustrato en
general solo participar cinco o seis aminocidos. La especificidad de una enzima
hacia su sustrato es una de las caractersticas ms notables, normalmente se
propone el modelo de llave y cerradura para explicar la forma complementaria en
que interactan la enzima y el sustrato, sin embargo esto nos hace pensar en una
estructura rgida. Actualmente se sabe que las enzimas son molculas flexibles, por
lo tanto el modelo ms correcto sera el llamado ajuste o encaje inducido, en donde
115
el sitio activo se modifica para hacerse complementario al sustrato. Una manera de

graficar este modelo sera la forma en que un guante se ajusta a la mano, es decir el
guante tiene una forma particular, que al momento de interactuar con la mano se
modifica, hacindose complementaria con la misma.
8.2.3 Mecanismo de Accin. Como hemos visto las propiedades qumicas de una
enzima dependen casi enteramente de las cadenas laterales. La actividad cataltica
de una enzima resulta de la unin de la molcula de sustrato al sitio activo de la
enzima por medio de interacciones generalmente dbiles. Al parecer, las ms
significativas son las interacciones puente hidrgeno. Tambin debemos recordar
que esta unin es sumamente especfica.
Figura 60.
Una vez que la enzima reconoce al sustrato y se ajusta a l, se forma un complejo
que recibe el nombre de complejo enzima-sustrato. La ruptura y la formacin de los
enlaces se llevan a cabo por las interacciones entre las cadenas laterales de la
enzima y los enlaces dentro del sustrato. Una vez que se han formado los productos
obtenemos un complejo que recibe el nombre de complejo enzimaproducto,
finalmente los productos se separarn de la enzima recuperndose esta para
reaccionar con otra molcula de sustrato, es decir que en el transcurso de la
reaccin la enzima no se modifica.
8.2.4 La gluclisis.La gluclisis, lisis o escisin de la glucosa, tiene lugar en una serie
de nueve reacciones, cada una catalizada por una enzima especfica, hasta formar
dos molculas de cido pirvico, con la produccin concomitante de ATP. La
116
ganancia neta es de dos molculas de ATP, y dos de NADH por cada molcula de
glucosa. Las reacciones de la gluclisis se realizan en el citoplasma, como ya
adelantramos y pueden darse en condiciones anaerobias; es decir en ausencia de
oxgeno. Los primeros cuatro pasos de la gluclisis sirven para fosforilar (incorporar
fosfatos) a la glucosa y convertirla en dos molculas del compuesto de tres carbonos
gliceraldehdo fosfato (PGAL). En estas reacciones se invierten dos molculas de ATP
a fin de activar la molcula de glucosa y prepararla para su ruptura.
Resumen de la gluclisis
1. Figura 61. Resumen de las dos etapas de la gluclisis. En la primera etapa se

utilizan 2 ATP y la segunda produce 4 ATP y 2 NADH. Otros azcares, adems
de la glucosa, como la manosa, galactosa y las pentosas, as como el
glucgeno y el almidn, pueden ingresar en la gluclisis una vez convertidos
en glucosa 6-fosfato.
117
Cuadro 39
Ecuacin de la Gluclisis:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+
2 piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O
8.2.5 Respiracin aerbica. En presencia de oxgeno, la etapa siguiente de la

degradacin de la glucosa es la respiracin, es decir la oxidacin escalonada del
cido pirvico a dixido de carbono y agua. La respiracin aerbica se cumple en
dos etapas: el ciclo de Krebs y el transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa
(estos dos ltimos procesos transcurren acopladamente).En las clulas eucariotas
estas reacciones tienen lugar dentro de las mitocondrias; en las procariotas se llevan
a cabo en estructuras respiratorias de la membrana plasmtica.
8.2.6 Ciclo de Krebs. El cido pirvico sale del citoplasma, donde se produce
mediante gluclisis y atraviesa las membranas externa e interna de las mitocondrias.
Antes de ingresar al Ciclo de Krebs, el cido pirvico, de 3 carbonos, se oxida. Los
tomos de carbono y oxgeno del grupo carboxilo se eliminan como dixido de
carbono (descarboxilacin oxidativa) y queda un grupo acetilo, de dos carbonos. En
esta reaccin exergnica, el hidrgeno del carboxilo reduce a una molcula de NAD+
a NADH.
Ahora la molcula original de glucosa se ha oxidado a dos molculas de CO 2, y dos

grupos acetilos y, adems se formaron 4 molculas de NADH (2 en la gluclisis y 2
en la oxidacin del cido pirvico).Cada grupo acetilo es aceptado por un
compuesto llamado coenzima A dando un compuesto llamado acetilcoenzima A
(acetil CoA). Esta reaccin es el eslabn entre la gluclisis y el ciclo de Krebs.
El ciclo de Krebs tambin conocido como ciclo del cido ctrico es la va comn final
de oxidacin del cido pirvico, cidos grasos y las cadenas de carbono de los
aminocidos. La primera reaccin del ciclo ocurre cuando la coenzima A transfiere
su grupo acetilo (de 2 carbonos) al compuesto de 4 carbonos (cido oxalactico)
para producir un compuesto de 6 carbonos (cido ctrico).
118
El cido ctrico inicia una serie de pasos durante los cuales la molcula original se
reordena y contina oxidndose, en consecuencia se reducen otras molculas de
NAD+ a NADH y de FAD+ a FADH2. Adems ocurren dos carboxilaciones y como
resultado de esta serie de reacciones vuelve a obtenerse una molcula inicial de 4
carbonos el cido oxalactico. El proceso completo puede describirse como un ciclo
de oxalactico a oxalactico, donde dos tomos de carbono se adicionan como
acetilo y dos tomos de carbono (pero no los mismos) se pierden como CO 2.
Figura 62. Esquema simplificado del Ciclo de Krebs
119
Dado que por cada molcula de glucosa inicial se haban obtenido dos de cido
pirvico y, por lo tanto dos de acetil CoA, deben cumplirse dos vueltas del ciclo de
Krebs por cada molcula de glucosa. En consecuencia los productos obtenidos de
este proceso son el doble del esquema que se detalla a continuacin.
Cuadro 40.
Proceso
Balance parcial de la respiracin

Sustrato
Productos
2 cido pirvico
Gluclisis
Glucosa
2 ATP
2 NADH
2 Acetil CoA
Entrada al ciclo de Krebs 2 cido pirvico
2 CO2
2 NADH
4 CO2
2 GTP (equivalentes a 2
Ciclo de Krebs
2 Acetil CoA
ATP)
6 NADH
2 FADH2
6 CO2
2 ATP
Glucosa
2 GTP
10 NADH
2 FADH2
Observando el balance parcial del ciclo de Krebs, se comprueba que en este proceso
no se obtiene energa directamente bajo la forma de ATP (slo se obtiene 1 GTP que
es equivalente a 1 ATP). En cambio se obtienen cantidades de coenzimas reducidas
(NADH y FADH2), y es a travs de la oxidacin posterior que se obtendr la energa
paraSintetizar ATP. Cada coenzima NADH equivale a 3 ATP y cada coenzima FADH2
equivale a 2 ATP.
8.2.7Transporte de electrones o Cadena respiratoria. En esta etapa se oxidan las
coenzimas reducidas, el NADH se convierte en NAD+ y el FADH2 en FAD+. Al
producirse esta reaccin, los tomos de hidrgeno (o electrones equivalentes), son
conducidos a travs de la cadena respiratoria por un grupo de transportadores de
electrones, llamados citocromos. Los citocromos experimentan sucesivas
oxidaciones y reducciones (reacciones en las cuales los electrones son transferidos
de un dador de electrones a un aceptor).En consecuencia, en esta etapa final de la
respiracin, estos electrones de alto nivel energtico descienden paso a paso hasta
el bajo nivel energtico del oxgeno (ltimo aceptor de la cadena), formndose de
esta manera agua. Cabe aclarar que los tres primeros aceptores reciben el H+ y el
120
electrn conjuntamente. En cambio, a partir del cuarto aceptor, slo se transportan

electrones, y los H+ quedan en solucin.
8.2.8 Fosforilacin Oxidativa. El flujo de electrones est ntimamente acoplado al
proceso de fosforilacin, y no ocurre a menos que tambin pueda verificarse este
ltimo. Esto, en un sentido, impide el desperdicio ya que los electrones no fluyen a
menos que exista la posibilidad de formacin de fosfatos ricos en energa. Si el flujo
de electrones no estuviera acoplado a la fosforilacin, no habra formacin de ATP y
la energa de los electrones se degradara en forma de calor.
Puesto que la fosforilacin del ADP para formar ATP se encuentra acoplada a la
oxidacin de los componentes de la cadena de transporte de electrones, este
proceso recibe el nombre de fosforilacin oxidativa. En tres transiciones de la
cadena de transporte de electrones se producen cadas importantes en la cantidad
de energa potencial que retienen los electrones, de modo que se libera una
cantidad relativamente grande de energa libre en cada uno de estos tres pasos,
formndose ATP.
Figura 63. Diagrama de la cadena respiratoria y de la fosforilacin oxidativa

asociada
121
8.2.9 Hiptesis Quimiosmtica.

Durante mucho tiempo se intent explicar la naturaleza del enlace entre la cadena
respiratoria y el sistema de fosforilacin. En 1961, Mitchell propuso la hiptesis
Quimiosmtica, que es la que actualmente se acepta en general. Esta hiptesis ha
sido apoyada por las evidencias experimentales encontradas en distintos
laboratorios, lo que le vali a Mitchell el premio Nobel en 1978.La misma propone
que el transporte de electrones y la sntesis de ATP estn acopladas por un gradiente
protnico a travs de la membrana mitocondrial. Segn este modelo, el transporte
de electrones paso a paso, desde el NADH o el FADH2 hasta el oxgeno a travs de
los transportadores de electrones, da por resultado el bombeo de protones a travs
de la membrana mitocondrial interna hacia el espacio entre las membranas
mitocondriales interna y externa. Este proceso genera un potencial de membrana a
travs de la membrana mitocondrial interna, ya que el medio que ocupa el espacio
intermembranoso se carga positivamente. La diferencia en concentracin de
protones entre la matriz y el espacio intermembranoso representa energa
potencial, resultado en parte de la diferencia de pH y en parte de la diferencia en la
carga elctrica de los lados de la membrana. Cuando los protones pueden fluir de
regreso a la matriz, descendiendo por el gradiente protnico, se libera energa
utilizable en la sntesis de ATP a partir de ADP y Pi.Los protones regresan a la matriz
a travs de conductos especiales situados en la membrana interna. Estos conductos
estn dados por un gran complejo enzimtico, llamado ATP sintetasa. Este complejo
consta de dos protenas: F0 y F1.Las partculas F0 estn incluidas en la membrana
mitocondrial interna y la atraviesan desde afuera hacia adentro. Se presume que
poseen un conducto o poro interior que permite el paso de los protones. Las
partculas F1 (que ya habamos mencionado, al describir la estructura mitocondrial)
son protenas globulares grandes consistentes en nueve subunidades polipeptdicas
unidas a las partculas F0 en el lado de la membrana que linda con la matriz. Se
comprob que propulsa la sntesis de ATP a partir de ADP y P i. Conforme los
protones descienden a lo largo del gradiente de energa, dicha energa utiliza para
sintetizar ATP. De esta manera, el gradiente protnico que existe a travs de la
membrana mitocondrial interna acopla la fosforilacin con la oxidacin.
122
Figura 64. Esquema comparativo de la quimiosmosis en la mitocondria y el

cloroplasto.
Observe el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio
intermembrana (sombreado). El ATP se forma del lado de la membrana que mira a
la matriz, por la difusin de los H+ a travs del complejo ATPsintetasa. En el
cloroplasto, a travs de la membrana tilacoidal se bombean protones desde el
estroma al compartimiento tilacoidal (sombreado). Como los H+ atraviesan la
membrana a travs de la ATPsintetasa, la fosforilacin del ADP tiene lugar del lado
de la membrana que mira al estroma.
Cuadro 41.
RESUMEN DE LA GLUCLISIS Y DE LA RESPIRACIN
En el citoplasma:
2 ATP
2 ATP
Gluclisis
En las mitocondrias:
2 NADH
6 ATP
6 ATP*
De la gluclisis:
1 NADH
3 ATP (x 2)
6 ATP
De la respiracin
1 ATP
24 ATP
cido pirvico
acetil
3 NADH
9 ATP (x 2)
CoA:
1 FADH2
2 ATP
Ciclo de Krebs:
Rendimiento total de ATP
36 a 38 ATP
* en algunas clulas el costo energtico de transportar los electrones desde el NADH
formado en la gluclisis a travs de la membrana mitocondrial interna deprime el
rendimiento neto de estos 2 NADH a slo 4 ATP
123
La glucosa se degrada a cido pirvico, en el citoplasma con un rendimiento de 2

molculas de ATP y la reduccin (flechas entrecortadas) de dos molculas de NAD + a
NADH. El cido pirvico se oxida a acetil CoA y se reduce una molcula de NAD +,
esta reaccin y la siguiente ocurren 2 veces por cada molcula de glucosa (pasaje de
e- con lnea entera). En el ciclo de Krebs, el grupo acetilo se oxida y los aceptores de
electrones NAD+ y FAD se reducen. El NADH y FADH2 transfieren sus electrones a la
serie de transportadores de la cadena de transporte de electrones. Al circular los
electrones hacia niveles energticos menores se liberan cantidades relativamente
grandes de energa libre. Esta liberacin transporta protones a travs de la
membrana mitocondrial interna estableciendo el gradiente de protones que
propulsa la sntesis de ATP a partir del ADP.
Figura 65. Resumen de la Gluclisis y de la Respiracin.
124
8.3 OTRAS VAS CATABLICAS

La mayora de los organismos no se alimentan directamente de glucosa, obtienen su
energa a partir de las grasas o protenas. La respuesta est en que el ciclo de Krebs
el cual es un gran nudo del metabolismo energtico. Otras sustancias alimenticias
son degradadas y convertidas en molculas capaces de ingresar al ciclo.
Las grasas se desdoblan en sus componentes glicerol y cidos grasos. Estos ltimos
son fraccionados en fragmentos de dos carbonos e introducidos en el ciclo de Krebs
como Acetil - CoA. Las protenas se degradan a aminocidos, estos son desaminados
(se les eliminan los grupos amino) y el esqueleto de carbonos se convierte en un
grupo acetilo, ingresando al ciclo de Krebs. Los grupos amino si no se utilizan, se
excretan como urea u otros desechos nitrogenados
Figura 66. Vas principales del catabolismo y anabolismo en la clula
125
8.4FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL METABOLISMO CELULAR

Es de mucha importancia conocer los factores Fisicoqumicos que influyen en la
actividad metablica de los microorganismos, conocimiento relevante para poder
disear planes o barreras de proteccin alimentaria:
8.4.1 Temperatura. -Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento
adecuada. Si estudiamos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la
temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de
la queno hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal
de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo, hasta que se alcanza la
temperaturaptima a la que la velocidad es mxima. Por encima de esta
temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce
la muerte celular. El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura
se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas
con la temperatura.
Sedenomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la
velocidadde reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las
reaccionesbioqumicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10 C la
temperatura a laque tienen lugar.La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas
se debe a la reduccin de la velocidad de crecimiento por la reduccin de la
velocidad de reaccin y al cambio de estadode los lpidos de la membrana celular
que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendoel funcionamiento de la membrana
celular.La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de las
protenas y a lasalteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas
temperaturas.Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el
metabolismo celular seRalentiza y las clulas paran de crecer; aunque no tienen por
qu morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la ptima, se produce
la muerte celular rpidamente y las clulas no pueden recuperar su capacidad de
divisin. Esto permite esterilizar por calor y no por fro. Hay varios tipos de
microorganismos en funcin de sus temperaturas de crecimiento mnima, mxima y
ptima.
Tipo de
Microorganismo
Psicrfilo
Temperatura
Temperatura
Temperatura
Mnima
ptima
Mxima
-5 +5
12 15
15 20
Psicrtrofo
-5 +5
25 30
30 35
Mesfilo
5 - 15
30 45
35 47
Termfilo
40 - 45
55 75
60 90
CUADRO 42. Clasificacin de los Microorganismos en funcin de su temperaura.
Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a
temperaturasbajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos.
Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se
126
encuentrancontaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de

refrigeracin aprox.
(4 - 8C) y de producirInfecciones en los consumidores del alimento.
Los microorganismos capaces de producir toxoinfecciones son los mesfilos y
algunos
Psicrtrofos ya que sus temperaturas ptimas de crecimiento son de (30 - 35 C)
coinciden con las corporales. Sin embargo, tanto mesfilos como psicrfilos,
psicrtrofos y termfilos puedenproducir toxinas causantes de intoxicaciones
alimentarias.
8.4.2 Actividad de agua (aw). Se denomina actividad de agua a la relacin entre la

presinde vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua
del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la
humedad relativa (HR).El valor de la actividad de agua nos da una idea de la
cantidad de agua disponiblemetablicamente.
Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas deagua estn
libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en
unadisolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las
molculas
de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este ltimo
caso, laactividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la
cantidad desolutos en el medio, disminuye su actividad de agua.
Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua
demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele
llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene latente en
condiciones deresistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las
esporas, la fase deresistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada. La
gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua
muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para
diferentestipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes:
- Bacterias aw>0.90,
- Levaduras aw>0.85,
- Hongos filamentosos aw>0.80.
Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos
con una actividad de agua mucho menor(mucho ms secos) de la que permite el
crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razn se puede producir deterioro
de alimentos de baja actividad de agua (porejemplo, el queso o almbares) por
mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.En funcin de su tolerancia a
ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas
127
condiciones se clasifican en halotolerantes, halfilos y xerfilossegn toleren o

requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.La reduccin de la
actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada
en la industria alimentaria. La utilizacin de almbares, salmueras ysalazones reduce
la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.
8.4.3 Potencial de Hidrogeniones (pH).El pH de un mosto acta como selector, es

un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cadatipo de
microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del
cualmueren rpidamente.El pH intracelular es ligeramente superior al del medio
que rodea las clulas ya que,en muchos casos, la obtencin de energa metablica
depende de la existencia de unadiferencia en la concentracin de protones a ambos
lados de la membrana citoplasmtica.El pH interno en la mayora de los
microorganismos est en el rango de 6.0 a 7.0.Los rangos de pH tolerables por
diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay microorganismos
acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran pH=10.0
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de
crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH
del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva
frente aotros microorganismos competidores. As, por ejemplo, las bacterias lcticas
que producen grandes cantidades de cido lctico como consecuencia de su
metabolismo primarioreducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los
soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta
4.5). De esta forma, las bacteriascompetidoras mueren y las lcticas se convierten
en la poblacin dominante.La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno
de los cuales es la liberacinde cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico,
lctico) por ciertas bacterias. Eneste sentido, hay que tener en cuenta que la accin
bactericida de estos cidos orgnicosde cadena corta es ms potente que la debida
nicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los cidos orgnicos de
cadena corta son txicos para algunas bacterias pors mismos.
El efecto letal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la
conservacin de alimentos acidificndolos. De esta forma, la adicin de cido
actico en formade vinagre permite la conservacin de alimentos perecederos y la
produccin de cidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar lavida
de los alimentos.
Tipo de microorganismo
Acidfilas
Neutrfilas
Basfilas o Alcalfilas
Potencial de H del medio

1.0 5.0
5.5 8.5
9.0 10.0
CUADRO 43. Clasificacin de los Microorganismos en funcin de su pH
128
8.4.4 Potencial Redox:nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar
electrones, esto es sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores
que intervienen en el potencial Redox, aunque no el nico, es la concentracin de
oxgeno[O2].Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer,
mientras queotros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos
de microorganismos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones
oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o
ausencia de oxgeno para quese produzca el crecimiento.En general, cuando un
microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice quedesarrolla un
metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos
que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo
fermentativo.Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es
anaerobiocuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias
entricas, ocomo Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las
bacterias lctIcas) o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos
como los Clostridios).
Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxgeno (anaerobios)
que,sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor
final deElectrones que acta como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias
que "respiran"nitratos (NO3-), sulfatos (SO4-) u otros compuestos orgnicos oxidados
(respiracinanaerobia).Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de
oxgeno, no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben
desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lcticas que son anaerobias
aerotolerantes, por ejemplo).Por otra parte, hay microorganismos que pueden
desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es en presencia de oxgeno
desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El
rendimiento de los procesos fermentativos es menor que elde los respirativos. Las
bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuandocrecenfermentando que
cuando lo hacen respirando.En el curso de ciertas reacciones metablicas Redox se
forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas superxido) que
pueden daar las protenas, membranas y cidos nucleicos produciendo la muerte
de las clulas. Las clulas se defiendende estos compuestos reactivos mediante las
enzimas siguientes: Superxidodismutasa(SOD) y catalasa. Los anaerobios estrictos
carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma
que no pueden sobrevivir en presencia deoxgeno. La deteccin de estas enzimas
tiene valor taxonmico.
-Aerobias estrictas: Dependen de O2 para su crecimiento.
-Anaerobias estrictas: se desarrollan en ausencia total de O2, utilizan aceptores
finales distintos del oxgeno: CO2, H2 y N2 o poseen metabolismo estrictamente
fermentativo.
129
-Anaerobias Facultativas: pueden desarrollarse en presencia o ausencia de O2

aunque predominan en medios anaerbicos.
-Microaerfilas: slo se pueden desarrollar en presencia de bajas tensiones de O2
(menor del 12% en lugar del 20% que es la atmosfrica) y altas tensiones de CO2
8.5MEDIOS DE CULTIVO.
La mayora de los medios de cultivo estn diseados para aislar microorganismos
clasificados comoquimiorganotrfico (Obtiene su energa de sustratos orgnicos
siendo importante proporcionar las condiciones nutricionales y ambientales de su
habitad natural. Los medios de cultivo contienen agua, una fuente de carbono y
energa, una fuente de nitrgeno elementos traza y factores de crecimiento.
Adems de esto los medios deben tener el pH adecuado para el crecimiento del
microorganismo .Los medios ms comunes contiene agua ,sales, azcares ,agar,
peptona, hidrolizado de casena, extracto de carne ,extracto de levadura, extracto
de malta, entre otros.
8.5.1 En funcin de su consistencia:
1).- Medios Lquidos: Tambin denominado caldos, se usan en tubos de ensayos y
en frascos .En los medios lquidos algunas bacterias crecen uniformemente
produciendo turbidez homognea, otras que son aerobias crecen formando una
pelcula de superficie Los medios lquidos son tiles para hacer crecer en biomasa
una determinado microorganismo. Los medios lquidos no son adecuados para aislar
microorganismos, puesto que no se puede detectar la presencia de ms de un tipo
de microorganismo.
2).- Medios Slidos: Cualquier medio liquido puede hacerse slido adicionando
ciertos solidificaste como el Agar, que es el ms comnmente usado .El Agar es un
polisacrido no ramificado obtenido de algunas especies de algas marinas
Rhodophytatales como las del gneroGelidium, Gracilaria, Entre otras .El Agar est
compuesto de una mezcla heterognea de dos polisacridos de cadena larga (70%
de agarosa y 30% de agaropeptina) que son polmeros de galactosa y cido
galacturnico. Se licua a 95C y se solidifica a 42C no tiene propiedades nutritivas y
la mayora de microorganismos no lo hidrolizan, tampoco tiene sustancias que
retarden el crecimiento de, se le usan a concentraciones de 1-3% siendo lo ms
comn en 1,5% para solidificar un medio. Los medios slidos son tiles para aislar
microorganismos debido a que inmovilizan clulas permitiendo que crezcan en
colonias que son masa visible de clulas aisladas llamadas Unidad Formadora de
Colonia (UFC)las colonias pueden ser de varias formas y tamaos dependiendo del
tipo deMicroorganismo, las condiciones de cultivo, los tipos de nutrientes, etc. las
colonias permiten visualizar la pureza del cultivo.
130
3).- Medio Semi slido: Son medios con una concentracin de Agar reducida a 0,20,5% este tipo de medios son blandos y son tiles para estudiar la motilidad
bacteriana y para mantener cepas de microorganismos por varios meses, es decir
para hacer un Cepario.
4).- Medio Bifsicos: Son medios que comprenden una fase slida y una fase lquida
en el mismo frasco de cultivo .Este tipo de medios son adecuados para
microorganismos que requieren bastante humedad.
8.5.2 En funcin de sus componentes nutricionales

1).- Medios qumicamente definidos o sintticos: Se preparan adicionando
cantidades precisas de sustancias qumicas inorgnicas u orgnicas altamente
purificadas disueltas en agua destilada .Por tanto, se conoce su composicin
qumica exacta.
2).- Medios qumicamente indefinidos o complejos: Se preparan con digeridos de
productos de animales y vegetales tales como la casena, carne de soya, malta, o
de levaduras. No se conoce la composicin exacta de estos productos. Los digeridos
estn comercializados como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz,
harina de soja, etc.que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero
que son qumicamente indefinidas y de composicin variable.
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el
Diseopara tratar a continuacin la formulacin y optimizacin de los mismos
8.5.3 Diseo de un medio de fermentacin.El diseo tiene como finalidad, la
eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin
de productos correspondientes al proceso a desarrollar.
Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso,
la disponibilidad real de los componentes, consideracionessobre las materias
primas. Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a todos
losprocesos y operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentacin y al
conocimiento de los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de
productos (Metabolitos)La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de
fermentacin esuna etapa fundamental para asegurar la productividad de los
mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores eternos de
naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos metablicos,
satisfaciendo los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos,
adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento
131
celular. No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de

los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las
siguientes categoras de componentes:
A) Macronutrientes: Agregados en cantidades de gramos por litro que estn
representados porlas fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
B) Micronutrientes o elementos trazas: Representados por las sales de Fe, Mn, Mo,
Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro.
C) Factores de crecimiento: Constituidos generalmente por componentes orgnicos
suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por
las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica
especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc.
8.5.4 Requerimientos Nutricionales. Los requerimientos nutricionales estn
determinados por el tipo de metabolismo celular, los heterotrficosnecesitan
compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencialest
determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. En el proceso
de respiracin aerbica el O2 es el agente oxidante, aceptor de electrones e
hidrogeno en elmetabolismo energtico celular. Durante el proceso de fermentacin
el aceptor de los electrones de la cadena transportadora es el Acetaldehdo,
reducindolo a etanol .El NO3o SO4 son utilizados como aceptores de electrones por
algunas bacterias. Las bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que
utilizan H2para reducir el CO2a CH4 para obtener energa. Otros protistas
obtienensu energa, en condiciones anaerobias por reaccin de xido-reduccin
realizadassobre compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono cumplen tambin el
rol deser fuente de energa.Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que
le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes
celulares. Dependiendo de la fuentede carbono que utilizan, los microorganismos se
pueden clasificar en auttrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que
fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgnico. La frmula elemental de
un microorganismo es, aproximadamente,
C4 H7 O2 N
Lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa
alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%),
azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K,
Mg, Mn, Co,Mb, Cu y Zn. La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar
los elementos antes citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe
estar en forma de carbono orgnico para los hetertrofos y como CO2 para los
auttrofos, el N en forma de NH4 deNO3- o de NO2- o en forma de aminocidos a
los que se pueda tomar su grupo amino; elP debe estar en forma de PO4- PO3, el S
procede de aminocidos sulfurados o de SO4 SO2, etc.Adems, en ciertos casos, es
132
necesario aadir a los medios de cultivo algunos aminocidos o vitaminas que

determinados tipos de
microorganismos no pueden sintetizar.En el caso de la
levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la frmula elementalms concreta es:
C3.72 H6.11 O1.95 N0.61 S0.017 P0.035 K0.056
Esta composicin puede variar ligeramente en funcin de las condiciones de cultivo
o de la fase de crecimiento. El conocimiento de la frmula elemental del
microorganismo quese cultiva facilita la formulacin del medio de cultivo ms
adecuado para el mismo.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su
composicinqumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque
estn compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de
levadura, extracto de carne, etc.).Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser
lquidos o slidos si se aade algnagente solidificante que no sea consumible por
los microorganismos(NormalmenteAgar). En funcin de los microorganismos que
pueden crecer en ellos, los medios puedenser generales, selectivos cuando
favorecen el crecimiento de ciertos microorganismosmientras suprimen el de otros
selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caractersticas, ymedios de
enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a
partir de una mezcla una poblacin mixta de gran tamao
8.6 MICROBIOLOGA Y CONTROL MICROBIOLGICO EN LA INDUSTRIA CERVECERA

Entre los microorganismos presentes en el aire, agua y materias primas, algunos se
adaptanperfectamente a las condiciones existentes en las cerveceras. Su
crecimiento en la cebada y la malta, antes y durante la fermentacin, libera
metabolitos que afectan la estabilidad y cualidades organolpticas del producto
final, algunos incluso, se desarrollan en ste. No todos los microorganismos pueden
establecerse y convertirse en contaminantes, para ello es preciso vencer toda una
serie de obstculos como:
1) El mosto se hierve aproximadamente 2,5 horas
2) El proceso de fermentacin se realiza a baja temperatura
3) Los valores de pH en el mosto y la cerveza son bajos
4) El lpulo posee componentes con accin antisptica, fundamentalmente sobre
las bateras del tipo Gram positivas
5) Durante la fermentacin prevalecen condiciones de anaerobiosis
6) Hay presencia de etanol tanto en la masa en fermentacin como en la cerveza
7) La cerveza por lo general se pasteuriza
Diversas especies de los gneros Bacillus y Clostridium, por ser endosporgenos,
soportan tiempos de ebullicin entre 2-2,5 horas, sin embargo, como en su mayora
133
son Gram positivos, resultan sensibles a los antispticos del lpulo. Pese a las
barreras que impone el proceso de produccin cervecero, diversos gneros
bacterianos, algunos mohos y levaduras salvajes, son capaces de vencerlas y
establecerse como contaminantes, afectando la calidad del producto final y/o
constituyendo un riesgo a la salud del consumidor. A continuacin se expondrn
algunos gneros y especies bacterianas, frecuentes contaminantes en estos
procesos, y se detallarn sus principales cualidades morfolgicas, tintoriales y
fisiolgicas:
Gnero Lactobacillus: Bastones largos Gram positivos, microaerfilos, asporogenos,
catalasanegativa. Crecen entre 11 y 45C. Son tolerantes a los antispticos del
lpulo. Por oxidacin del etanol producen cido lctico y cido frmico. Provocan
agriado y turbidez sedosa de la cerveza.
Gnero Achromobacter: Bastones Gram positivos, anaerobios facultativos,
asporogenos, catalasapositivos. Toleran los pH cidos y los antispticos del lpulo.
Se destruyen a temperaturas de 60C en 5 minutos. Adems de turbidez provocan
olor y sabor repugnantes.
Gnero Pediococcus: Cocos Gram positivos, anaerobios, asporogenos, catalasa
negativos. Sontolerantes a los cidos pero su pH ptimo oscila entre 5 y 6. Producen
cido lctico y diacetilo. Ocasionan agriado, turbidez y viscosidad. A las
contaminaciones por este gnero se les denomina mal de la sarcina.
Gnero Acetobacter: Bastones Gram negativos, aerobios, asporogenos, catalasa
positivos (excepto A. peroxidans). Crecen entre 5-40C. Son tolerantes a los
antispticos del lpulo. La mayora de lasespecies provocan el agriado de la cerveza
excepto A.capsulatum y A. viscosum que ocasionanviscosidad y A. turbidans,
responsable de agriado y turbidez. Las especies responsables del agriadoOxidan el
etanol a cido actico y finalmente a dixido de carbono y agua.
Gnero Gluconobacter: Bastones Gram negativos, aerobios, asporogenos, catalasa
positivos. Laespecie G. oxidans produce cido actico a partir de etanol. Algunas
cepas son capaces de crecer en la cerveza embotellada gracias al escaso contenido
de aire del cuello de las mismas y su crecimiento da la apariencia de sogas o
cuerdas.
Gnero Zimomonas: Bastones Gram negativos, anaerobios, asporogenos, catalasa
negativos.Tolerantes al alcohol (lo producen). Provocan turbidez y sabores de fondo.
Familia Enterobacteriaceae: Todos sus gneros y especies se presentan como
bastones cortosGram negativos, anaerobios facultativos, asporogenos, catalasa
positivos. Son sensibles a pH iguales o menores a 4,2 y al etanol. Por lo general se
presentan como contaminantes del mosto y en las primeras etapas de la
fermentacin. Las especies ms reportadas son: Hafniaalvei, Citrobacterfreundii,
134
Klebsiellasp., Enterobactersp. yObsobacteriumproteus. Este ltimo es el ms

reportado. Provocan infeccin de la levadura y desarrollan olores y sabores
desagradables.
Levaduras salvajes:Se considera levaduras salvajes aquellas que no son utilizadas
deliberadamente no estn bajo control De esta forma se incluyen tanto las
perjudiciales como las inocuas sin efectosdetectables. Constituyen la parte ms
complicada del control microbiolgico, ya que se dificulta sudiferenciacin de las
levaduras seleccionadas para el proceso como son: Saccharomyces cerevisiae y S.
carlsbergensis. Para la diferenciacin se han sugerido numerosas formulaciones de
medio de cultivo. Dentro del gnero de Saccharomyces, la diferenciacin de estirpes
es prcticamente imposible mediante tcnicas de cultivo y solo los
mtodosInmunolgicos resultan precisos. En ocasiones el test de esporulacin
resulta muy til ya que las estirpes cerveceras no son capaces de esporular a
diferencia del resto de Saccharomyces.
Algunas levaduras que han sido identificadas como contaminantes cerveceros en
diferentespublicaciones incluyen los gneros: Brettanomyces, Hnasenula, Candida,
Kloeckera, Pichia ySaccharomyces. De ellos Pichia, Hansenula y la mayora de las
cepas de Candida son aerbicas lo que limita su capacidad contaminante a cervezas
almacenadas en presencia de aire. En estas condiciones crecen rpido, formando
pelculas superficiales y originando sabores de fondo. Las especies de
Brettanomyces, aunque aerbicas, producen grandes cantidades de cido que
afectan el sabor de las cervezas. Dentro de las levaduras salvajes, las ms
importantes son algunas especies de Saccharomyces como S. uvarum (tambin
conocida como S. carlsbergensis; por supuesto, en fbricas que utilicen S.
cerevisiae), S. diastaticus y S. pastorianus. Las mismas son responsables de exceso
de gas y turbidez; S. diastaticus tambin provoca atenuacin. Las levaduras salvajes
son capaces de crecerdurante la fermentacin y en la cerveza acabada,
representando un problema especial en la alteracin de la cerveza acondicionada
para barril.
Mohos: Los mohos no constituyen contaminantes directos de la cerveza, s de la
cebada, cereales aditivos y la malta. Los metabolitos que se producen durante su
crecimiento, ms adelante pueden ser fuentes de sabores desagradables de fondo y
provocar la rpida evolucin de dixido de carbono al disminuir la presin (gushing).
La flora normal de lacebada incluye gneros como Fusarium, Helminthosporium y
Alternaria. Durante el almacenaje, cuando la humedad es superior a 13,2%,
germinan las esporas y se desarrollan Aspergillus y Penicillium; todos, por lo ya
explicado, constituyen hongos imperfectos fciles de identificar
8.7 PRINCIPALES PUNTOS DE CONTAMINACIN MICROBIOLGICA

8.7.1 En las Materias primas
135
A) El Agua.-El agua utilizada en las cerveceras debe ser microbiolgicamente pura.

Este
criterio se sustenta en dos resultados: determinacin de coliformes; conteo total de
microorganismos. El primero acredita que el agua est exenta de contaminacin
fecal; el segundo que la carga microbiana est dentro de los parmetros (inferior a
10 u.f.c/mL). Es comn la presencia de Pseudomonassp., Acinetobactersp.
yAlcaligenessp. ycoliformes de vida libre (saprfitos) como Klebsiella, Enterobacter y
Hafnia. Estos saprfitos se diferencias de los procedentes de la flora intestinal
mediante siembra en caldo Mac Conkey e incubacin a 44C; solo los entricos
crecen y producen gas. Estas bacterias constituyen una fuente de contaminacin en
las cerveceras y pueden desarrollarse rpidamente en el mosto (muy raras veces en
la cerveza ya que el pH es muy bajo y el contenido de etanol atentan contra su
multiplicacin) y producir derivados fenlicos y sulfurados que afectan el sabor final
de la cerveza.
B) Cebada y malta.-Como ya se ha expresado, los mohos constituyen flora normal
de los cereales. Tras el almacenaje, si no hay el debido control de la humedad
(inferior al 13%) van a ser contaminados por diversas especies de Aspergillus y
Penicillium. Los granos pierden su color caracterstico. Estos mohos producen
diversas toxinas
(Micotoxinas) que, en otras condiciones constituyen un riesgo a la salud sin
embargo, los estudios realizados demuestran que las mismas, al parecer, son
degradadas durante el proceso de produccin y no constituyen un riesgo a la salud
aunque si pueden afectar la calidad del producto final.
C) Lpulo.- El lpulo posee componentes que ejercen accin bacteriosttica sobre
bacterias Grampositivas. Sin embargo, cuando se almacena en lugares hmedos se
promueve el crecimiento de hongos y estos afectan su accin antibacteriana
ulterior.
D) En el Mosto.-El mosto constituye un medio ideal para la mayora de las bacterias
Gram negativas y algunasGram positivas tolerantes a los antispticos del lpulo por
ello, nunca debe almacenarse a temperaturas por debajo de 55 C por breve que
sea el tiempo antes de aadirle el inoculo de cultivo. Bacterias como
Lactobacillusdelbrueckii, y otras formadoras de endosporas, como son termfilas,
pueden contaminar el mosto, multiplicarse rpidamente a temperaturas entre 5065C y provocar acidez. Otras bacterias, como las mencionadas dentro de la familia
Enterobacteriaceae, al desarrollarse en el mosto producen derivados sulfurados y
fenlicos que afectan el sabor final de la cerveza.
8.7.2 Durante la Fermentacin. Con la inoculacin, si no se utiliza un cultivo puro,
se incorporan al mosto toda una gama delevaduras salvajes y bacterias. Entre estas
ltimas merece especial atencin Obesumbacteriumproteus. Se introduce al mbito
136
cervecero a travs del agua y, con gran rapidez se adapta a lascondiciones de la

fbrica aspecto que le permite presentarse junto a las levaduras que se utilizan
porsegunda o tercera vez. Crece en los primeros estadios de la fermentacin hasta
que los descensos depH y la elevacin en la concentracin de etanol le resultan
adversos ya a las 24-36 horas de realizado el inculo. Al incrementarse su
concentracin retarda el proceso de fermentacin al elevar el pH de la cerveza.
Afecta adems su sabor al producir compuestos sulfurados.
Otra especie, Enterococcusagglomerans, tiene un comportamiento similar. Las
Enterobacterias y otras Gram negativas, se inhiben rpidamente durante la
fermentacin. A no ser que ya existiera un crecimiento abundante antes de la
inoculacin, su efecto es pequeo en la cerveza. En los procesos en los que se
recupera la levadura de la superficie O. proteus constituye un problema al unirse a
stas, no sucede igual con las otras Gram negativas.
Acetobacter y Gluconobacter, aunque pueden aislarse en esta etapa, su crecimiento
se ve afectado por las condiciones de anaerobiosis. Lactobacillus y Pediococcus,
tambin aisladas durante esta etapa, han de competir con la levadura, sta, en
mayor concentracin. El diacetilo que producen(0,1 g/L) es reducido por las
levaduras a butano-2-3-diol que, para que afecte el sabor debe apareceren
concentraciones de 500 mg/L.La levadura cervecera, para que cumpla su rol, ha de
estar pura. Este estado ideal no siempre sepierde por contaminacin con levaduras
salvajes, la propia levadura cervecera puede perder suscualidades debido a la
aparicin de mutantes. Esto constituye un problema pues las mismas puedenestar
mejor adaptadas (crecer mejor) pero perder sus cualidades fermentativas. Estas
mutacionespueden aparecer de forma espontnea o ser inducidas. La aparicin de
cepas salvajes puede tener
su origen en las materias primas, el aire, la propia planta cervecera. Como el
sustrato es el mismo,compiten con la levadura cervecera y superarla. Algunas son
muy pequeas y dificultan la filtracin, otras pueden secretar exoenzimas que
afectan la atenuacin, o producen steres y compuestos fenlicos que alteran el
sabor.
8.7.3 Durante la Fermentacin.Previo al embotellamiento, o cuando ya ste se ha
efectuado pero existieron errores de filtracin opasteurizacin, puede producirse
contaminacin. El nmero de bacterias que pueden constituir problema a este nivel
es reducido debido a: el bajo pH; la presencia de etanol; la ausencia de
carbohidratos fermentables y las condiciones de anaerobiosis. Sin embargo, las
bacterias cido lcticas como L. Brevis y P. damnosus pueden lograrlo. Su mayor
afectacin es al sabor ya que la produccin de diacetilo, al no haber levaduras en
suspensin, no puede ser reducida y confiere un sabor a mantequilla. Las bacterias
acticas, debido a la anaerobiosis, no causan por lo general problemas en esta
etapa, sin embargo, G. oxidans, con el escaso aire presente en el cuello de las
botellas, crece, produce cido actico y altera el aspecto del producto (crecimiento
137
con apariencia de cuerdas). Otros contaminantes a este nivel pueden ser las
levaduras salvajes que forman pelculas superficiales, provocan turbidez y producen
steres que afectan el sabor.
8.7.4 En el Equipo de Dispensado.Aunque lo referido abarca los principales puntos
de contaminacin, el producto terminado estexpuesto a otros agentes ya fuera de
la fbrica. Por supuesto, no pretendemos analizar el caso de lospopulares
Surtidores ya que cada uno sera fuente suficiente para un extenso Cepario, sin
embargo, en los pases donde se expende la cerveza en barriles o en toneles, se ha
podido constatar la presencia de levaduras salvajes, no coincidentes con las
detectadas en la fbrica de origen, bacterias acticas y otras. Aunque su nivel, por lo
general, no es lo suficientemente alto para afectar el producto, este dao tampoco
tiene lugar debido al rpido consumo que se hace de estas cervezas, cualquier
retardo conllevara a las afectaciones ya descritas. Esta contaminaciones hablan en
detrimento de la limpieza de los contenedores utilizados, en los que, poco a poco,
se van estableciendo estos contaminantes.
8.8BUENAS PRCTICAS DE MANUFACTURA (BPM)

En 1969 entraron en vigencia para la industria de alimentos, pautas que se refieren
a: Alimentos humanos: Buenas prcticas vigentes (Higinicas) en la Manufactura,
procesamiento, empaque o almacenamiento las pautas se refieren a todos los tipos
de procesamientos de alimentos, de manera que las recomendaciones son
aplicables a la industria cervecera. Si se contempla adecuadamente todas las
condiciones y campos dentro de un Programa de Aseguramiento de la Seguridad de
la Cerveza, deben satisfacerse entonces los requerimientos de las Buenas Practicad
de Manufactura. Se sugiere estas pautas como base de un programa de medidas
sanitarias. La mayora de los riesgos serios de muchos alimentos es la posible
contaminacin con bacterias causantes de las toxiinfecciones alimentarias,
comoClostridia o Listeria. La cerveza es por s misma bastante segura en lo que se
refiere a la microbiologa de alimentos .En parte es debido a la etapa de coccin,
que elimina bsicamente cualquier contaminante microbiano que proceda de las
materias primas y tambin debido al afecto antibacteriano del alcohol, el bajo pH, el
dixido de carbono y los cidos del lpulo. Esto significa que las toxo infecciones
alimentarias no sean posible a travs de la cerveza, sencillamente quiere decir que
es poco probable que sea peligrosa.
Con el fin de de eliminar o minimizar las diferentes categoras de peligros descritos
anteriormente es necesario aplicar distintas estrategias .Los contaminantes
procedentes de la cadena de transporte y de distribucin en teora podran ser
erradicados, en contraste con los componentes txicos de un componente integral
de algn alimento el cual sera biolgicamente imposible eliminar. Tambin hay que
ser consciente nada en esta vida pude ser garantizado como seguro al 100%. Una
138
gran cantidad de sustancias, entre las que incluyen, requerimientos bsicos de

oxgeno, alimento y agua que son necesarios para la vida a una determinada
concentracin, puede ser extremadamente peligrosa a otra. El viejo dicho de La
dosis hace el veneno continua vigente.
8.8.1 Limpieza e Higiene. La filosofa apropiada es primero limpiar y luego
desinfectar. Los tanques son limpiados con bolas de regado permanente en el lugar
o rociado con aspersores Butterworth. Normalmente los tanques son limpiados en
frio con soluciones custicas, para evitar el recalentamiento de la bodega. Despus
que se haya concluido la limpieza y el enjuague de los tanques, se procede a su
desinfeccin y drenaje .Resulta posible completar estas operaciones con un sistema
de limpieza en el lugar controlado mediante programacin. Las tuberas deben
limpiarse en caliente, porque esto no afecta apreciablemente la temperatura de las
bodegas, la limpieza apropiada requiere de un flujo turbulento a travs de la lnea,
las lneas deben mantenerse llenas con un control de contra presin .Nuevamente,
sigue la desinfeccin. Los agentes de desinfeccin deben ser eficaces a bajas
concentraciones y compatibles con el sabor de la cerveza, se usan hipocloritos de
200ppm. Pero pueden afectar mucho el sabor de las cervezas. Los yodoforos en
concentraciones de 25 ppm. Son ms compatibles con la cerveza. Las soluciones
desinfectantes deben enjuagarse o desaguarse de todas las lneas y tanques en
todos los casos previamente a la introduccin de la cerveza. El agua caliente por
encima de 80C tambin es efectiva. El calor penetra en los aditamentos cerveceros
ms eficazmente que las sustancias qumicas. El control del proceso de Higiene y
desinfeccin debe exigir un mnimo de comprobacin de la actividad. La cerveza
tiene que fabricarse bien la primera vez, ya que normalmente resulta imposible
tomar medidas correctivas. El proceso debe ser predecible.
Todas las materias primas principales usadas en la fabricacin de cerveza son
fuentes potenciales de contaminacin con microorganismos indeseables, ninguno
de los cuales (salvo que exista un sbito brote de enfermedad por el agua) tiene
probabilidades de ser patgeno para el hombre. Adems, los coadyuvantes
cerveceros como los finalizadores, iniciadores, medios filtrantes y contenedores de
envasado (barriles, botellas, etc.). Tanto el mosto como la cerveza son susceptibles a
los microorganismos alteradores, especialmente el primero por aportar muchos
nutrientes y un ambiente oxigenado, en teora, muchos microorganismos pueden
crecer en el mosto particularmente cuando su temperatura desciende durante el
proceso. La buena prctica cervecera debe garantizar que en teora esto no suceda,
haciendo pasar directamente el mosto de la cuba de maceracin a la cuba de
coccin. La propia cerveza con su pH intrnsecamente bajo, no proporciona un
ambiente propicio, para la supervivencia de la inmensa diversidad de bacterias.
8.8.2 Control sanitario de personal e instalaciones. La calidad de los productos

alimenticios depende, por un lado, de la salud e higiene del personal y por otro lado,
139
de la limpieza y desinfeccin de las instalaciones de la fbrica. Si no se toman en

cuenta estos dos aspectos del control sanitario, la calidad del producto disminuir.
Salud e higiene del personal.- El personal de la fbrica debe pasar peridicamente

por una serie de exmenes mdicos, para determinar su grado de salud, estos
exmenes incluyen examen de orina, de sangre de excremento para tener
conocimiento de la existencia de parsitos y otras enfermedades en el organismo
del trabajador .El examen torcico es tambin fundamental en los anlisis mdicos.
Las personas con enfermedades contagiosas no deben trabajar en este tipo de
empresas. El personal de la fbrica debe adems cumplir con las normas sanitarias,
ya que cualquier imprudencia puede poner en peligro la salud del consumidor. En la
prctica se ha demostrado que las contaminaciones tienen origen en las personas
desaseadas o enfermas. Los trabajadores de la fbrica deben cambiar de bata
diariamente, deben cubrirse la cabeza y usar guantes esterilizados. En las salas de
procesamiento, el personal no debe consumir alimentos.
Limpieza y desinfeccin de instalaciones.- La limpieza de las instalaciones consiste

en eliminar residuos y otras impurezas. La desinfeccin consiste en destruccin de
grmenes patgenos y de otros microorganismos que pueden daar la calidad del
producto. La limpieza y desinfeccin son dos operaciones consecutivas .La
desinfeccin momentos antes de utilizar el equipo. La clase y la naturaleza de la
suciedad influyen en la seleccin del mtodo de limpieza y desinfeccin. Existen
impurezas sueltas y masas enquistadas sobre las superficies, la suciedad se adhiere
ms fuertemente a las superficies rugosas que a las lisas. Por lo tanto, el equipo
debe ser de material liso como el acero austentico y su configuracin debe facilitar
la limpieza. As mismo, el material debe resistir la accin de los detergentes.
Detergentes y desinfectantes.- Los detergentes deben reunir las siguientes
condiciones:
- Suavizar el agua y prevenir la sedimentacin en el equipo, de sales no solubles.
- Mejorar el poder humectante para facilitar la limpieza.
- Emulsificar la grasa en pequeos glbulos
- Dispersar las impurezas slidas para eliminarlas fcilmente.
- No ser txicos, ni irritar la piel.
Existen dos clase de detergentes, los alcalinos y los cidos .Los detergentes alcalinos
se componen principalmente de sosa custica, carbonato de sdico, fosfato
trisdico, polifosfatos y meta silicatos sdicos. Los detergentes cidos contienen
cido ntrico, cido fosfrico, cido ctrico, cido tartrico. Estos detergentes
eliminan las sales minerales depositadas como el oxalato de calcio .Por tanto, se
deben aadir sustancias que inhiban el efecto corrosivo. A los detergentes se
aaden agentes especiales para incrementar la capacidad de ablandar el agua y el
140
poder humectante. La solucin de detergentes no debe ser muy concentrada.

La desinfeccin.- Se realiza mediante medios fsicos y qumicos .Los primeros
aplican el vapor como esterilizante, el vapor ser efectivo si la duracin del chorro se
prolonga por lo menos 10 minutos. La aplicacin del calor se realiza en la auto clave
.Este aparato sirve para materiales pequeos como tuberas desmontables. La
inmersin en agua hirviendo durante los diez minutos, es un buen medio de
desinfeccin. El flameado se usa para desinfectar superficies, sin embargo este
mtodo es poco usado a causa de las limitaciones. Los desinfectantes qumicos son
muy utilizados por su fcil aplicacin. Los desinfectantes disueltos en agua fra
actan bien una temperatura elevada aumenta su eficacia el pH tambin influyen en
su efectividad. El Cloro es el desinfectante qumico ms utilizado, teniendo presente
que en altas concentraciones provoca la corrosin, especialmente la del aluminio y
el cobre, este no afecta el acero inoxidable si se aplica segn las indicaciones del
fabricante, las soluciones del Hipoclorito no deben mezclarse con cido, porque
pueden desprender gases txicos.
El cloro se puede utilizar de las siguientes formas y concentraciones de cloro activo
El cloro se puede utilizar de las siguientes formas y concentraciones de cloro activo.
Estos compuestos tienen una fuerte accin bactericida:
- Circulacin de la solucin por el circuito de tubera: La bombas, tuberas y
cambiadores de placas se esterilizan con una solucin de 200 mg por litro. Se deja
circular por unos 5 minutos.
- Inmersin: El material se puede sumergir durante 5 minutos en una solucin de
200mg.por litro
- Cepillado: Los recipientes, las cubas y los agitadores se cepillan con una solucin
de 400mg por litro
- Rociado: Los tanques y recipientes grandes se pueden rociar son una solucin de
300mg por litro, procurando que las superficies queden en contacto con la solucin
durante 5 minutos por lo menos.
- Atomizado: En tanques cerrados se atomiza una solucin de 500 mg por litro,
formando una niebla que se deposita en la superficie del equipo. Si no se puede
emplear cloro, se utiliza soluciones de cloraminas. Estas sustancias son
combinaciones de cloro y amoniaco. Tienen alto poder bactericida, pero su accin
es ms lenta que la del cloro, estos compuestos huelen menos a cloro. Los
compuestos de amonio cuaternario son otro tipo de desinfectantes que no atacan
los metalesno tiene olor, y son ms estables. Tiene un poder humectante mayor que
las soluciones de cloro, sin embargo, su actividad no es completa, ya que
difcilmente destruyen bacterias butricas se emplean en concentraciones de 200 a
350 mg por litro. Existen tambin desinfectantes elaborados sobre la base de los
yodoforos. Estos son compuestos en el que el yodo est combinado con agentes
humectantes .Las propiedades de los yodoforos son similares a las del cloro, con la
ventaja que no corroen a los metales Las temperaturas de estas soluciones no debe
ser mayor de 50 C para evitar manchas en el equipo.Tambin pueden utilizarse
141
soluciones calientes de sosa custica como desinfectantes. La siguiente tabla

muestra la relacin entre las concentraciones de la solucin y el tiempo de contacto
necesario para obtener una desinfeccin adecuada de las superficies.
Concentracin (w/w)
Temperatura C
3,5 a 5,0 %
2,7 a 3,7%
2,7 a 3,7%
1,4 a 2,0%
1,2 a 1,4%
1,0 a 1,2%
50
50
60
60
70
70
Tiempo de contacto
(minutos)
5
10
5
10
5
10
Cuadro 44.
El efecto bactericida aumenta si posteriormente se trata el equipo con solucin
cida.
- Operaciones de limpieza y desinfeccin
Las operaciones de limpieza de equipo y locales se efectan inmediatamente
despus del empleo de stos .la desinfeccin se realiza despus de la limpieza y y
antes de su empleo.
Las operaciones de limpieza y desinfeccin se realizan siguiendo los siguientes
pasos:
-Remojo.-Para eliminar las impurezas
- Limpieza.- Es el tallado y la eliminacin de la suciedad
- Desinfeccin.- El equipo se pone en contacto con un desinfectante para destruir
microbios
- Drenaje y secado.- Se aplica cuando el equipo no se va utilizar inmediatamente.
El remojo se hace con agua de 20 a 40 C El enjuague final se efecta para eliminar
residuos de detergentes y desinfectantes.
Es importante tomar en cuenta que los aparatos deben quedar completamente
secos despus de las operaciones ya que los grmenes se adhieren con mayor
facilidad a las superficies hmedas.Antes de utilizar el equipo debe efectuarse una
desinfeccin.
Cmo los concentrados qumicos son extremadamente custicos se deben emplear
guantes, delantal, botas de goma, y gafas protectoras. Para tratar posibles
quemaduras, se deben tener preparado soluciones neutralizantes de cido actico
diluido al 2% y una solucin de carbonato monosdico. Para efectuar la limpieza,
generalmente es necesario detener las mquinas y desmontar el equipo. Sin
embargo las instalaciones y los sistemas de tuberas se pueden limpiar en circuito
sin desmontarlas. Este tipo de limpieza, parcialmente automtico se basa en la
circulacin de solucin detergente y desinfectante.Para emplear este tipo de
142
limpieza, se necesita una instalacin con las siguientes caractersticas.

- La construccin debe ser tal que el producto no se mezcle con las soluciones de
limpieza.
- Todas las partes conductoras del equipo deben estar en contacto con las
soluciones
-El material del equipo debe ser resistente a la corrosin.
Este sistema de limpieza y desinfeccin, se pueden emplear en instalaciones que
permitan la conexin de una instalacin de limpieza a un circuito cerrado,
incluyendo, por ejemplo los tanques, filtros prensas, lavadora de botellas,
enchapadora etc.
Las vlvulas de desviacin de cierre y de regulacin, as como las llaves de paso y de
tres vas, deben ser desmontadas despus de la limpieza, para quitarles la suciedad
que haya quedado cuando las partes estn secas se montan nuevamente.
A continuacin se detalla la instalacin para la limpieza en circuito cerrado.
1.- Entrada de agua
2.- Depsito
3.- Depsito para detergentes concentrados
4.-Depsito para soluciones detergente
5.- Depsito
6.- Deposito para la solucin de desinfectantes
7.-Bomba para la solucin desinfectante
8.- Entrada de la cerveza .Esta debe estar desconectada durante las operaciones de
limpieza
9.- Cambiador de calor de placas
10.-Lineas de tuberas
11.- Desage.
Antes de empezar las operaciones, se cierra las entrada de la cerveza se llena el
depsito con agua a 40C y se bombea a travs de los aparatos esta agua no se
evacua hacia el sistema general de desage porque contiene residuos de cerveza
,luego el depsito de la solucin de detergente se llena con agua a 85 C y se
dosifica el concentrado de un detergente alcalino hasta tener la solucin adecuada
la solucin preparada se deja circular durante 30 minutos se enjuaga el sistema de
nuevo con agua templada. Luego se prepara una solucin cida a 85C y se deja
circular por 15 minutos despus se deja pasar agua templada para enjuagar.La
eficacia de la limpieza y desinfeccin se evala por medio de normas
microbiolgicas. La norma ms conocida se basa en el control de nmero total de
grmenes por unidad de superficie del equipo que est en contacto con el producto
en elaboracin.
8.9ASEGURAMIENTO DE LA SEGURIDAD DE LA CERVEZA.
Un programa adecuado de medidas sanitarias dentro de una planta de alimentos
143
debe desarrollarse a base de una orientacin preventiva, si es que ha de alcanzar el

xito que se desea. Debemos sealar, no obstante, que ningn proceso nico ni
conjunto especfico alguno de pautas pueden ser aplicados a todas las plantas
malteras y cerveceras. Ms bien, el programa de medidas sanitarias de una
compaa debe adaptarse al tipo de operacin en que participa la compaa, los
tipos de contaminantes que pueden hallarse en las materias primas y productos
terminados y la capacidad del el programa debe aplicarse entonces, de acuerdo a un
enfoque organizado, para controlar todas las posibles vas de contaminacin, desde
materias primas hasta productos terminados.
Hay una serie de hechos que deben tomarse en consideracin dentro de un
programa de Aseguramiento de la Seguridad de la Cerveza:
- Los componentes naturales de las materias primas que sean txicos en s mismos.
- Los contaminantes ambientales asociados a las materias primas.
-Los pasos que se tomarn para asegurar que se detecten dicha contaminacin.
- Los insectos dainos u otras formas de contaminacin que pueden invadir las
operaciones mismas del procesamiento
- Los mtodos que se aplicaran para eliminar dichos insectos dainos en la
operacin particularmente en las zonas ms crticas.
- El tipo de limpieza que se emplear para ayudar a resguardar contra la invasin de
insectos dainos u otras sabandijas.
personal que es responsable de que se alcance el nivel deseado de higiene.
Lgicamente el primer paso hacia el establecimiento de un programa de medidas
sanitarias implica una familiarizacin con los problemas potenciales. Una vez
adquirido dicho conocimiento:
- La frecuencia con que debe de limpiarse cada rea para asegurar su proteccin
contra insectos dainos.
- La frecuencia con que debe aplicar pesticidas como parte del programa de
medidas sanitarias
- Los pesticidas mejor adaptados para cada tipo de control y la frecuencia de su
utilizacin.
- La manera en que se utilizan, para evitar permanezcan residuos ilegales de
pesticidas
- Las infecciones microbianas
- Los contaminantes que derivan de los trasportes, la distribucin, el
almacenamiento o el envasado.
-Los contaminantes procedentes del procesado.
- Los asociados a los aditivos, adyuvantes de fabricacin y otros materiales utilizados
durante el procesado que pueden entrar en contacto con los alimentos.
- La contaminacin de un alimento con un material peligroso.
- Componentes como los alrgenos que aunque resultan inofensivos para la mayora
de la poblacin, puede significar un riesgo importante para una pequea minora.
- La frecuencia con la que se inspecciona todas las instalaciones de la planta para
detectar condiciones que no conduzcan a buena higiene.
144
Un buen programa de Aseguramiento de la Seguridad de la Cerveza recomienda tres

metas bsicas.
1) Garantizar que el consumidor quede satisfecho con la calidad higinica de los
productos terminados.
2) Asegurar que todos los sectores del proceso manufacturero cumplan con las
leyes aplicables de los organismos competentes.
3) Obtener la mxima eficacia a base de los esfuerzos y dinero invertido en el
programa.
Par lograr estas metas deben de preverse un control de los esfuerzos que se realizan
dentro del programa de medidas sanitarias, control que puede lograrse mediante un
sistema de inspeccin y de informes.
El primer paso para resolver es la frecuencia con que se debe inspeccionar cada
departamento de la planta.
En general el rea debe considerarse como crtica si se tiene cualquier contacto
directo con el flujo de materias primas o producto. Ejemplo reas crticas en donde
los productos son procesados o transferidos, rea de almacn de productos
terminados, envase y de carga, lugares donde se almacenan los envases, estas reas
crticas deben inspeccionarse con una frecuencia de por lo menos 30 das por que
coincide con el ciclo de desarrollo de muchos insectos dainos ms comunes
Que pueden infestar productos de granos y cereales.
Ciertas reas de la planta pueden considerarse como menos crticas por que no
tiene contacto directo con las operaciones del proceso, esto no significa que el rea
carezca de importancia y puedan ignorarse. Ejemplo oficinas, laboratorios, talleres
de mantenimiento, patios las cuales pueden ser supervisadas cada 60 das. En
cualquier programa de de medidas sanitarias especialmente dentro de la industria
maltera, la prevencin es la clave de la buena higiene .La prevencin incluye la
eliminacin de polvos y granos ,la instalacin de equipos aerodinmicos bien
diseados que eviten que dichos nocivos puedan albergarse en el mismo, el
almacenamiento apropiado diseado tanto para el producto como para el equipo
mecnico y, finalmente, prevencin mediante una limitacin de acceso al local.
8.10 ANLISIS DE PELIGROS MEDIANTE EL CONTROL DE PUNTOS CRTICOS

(APCPC)
145
La estrategia utilizada por la mayora de fabricantes de cerveza para maximizar la

seguridad alimentaria y para minimizar los riesgos para los consumidores es la
misma que la empleada en gran parte del sector de la industria alimentaria y es
conocida como (APCPC).Proviene originariamente del sistema diseado para
asegurar que el alimento utilizado para los astronautas americanos fuese
absolutamente seguro desde el punto de vista microbiolgico. Hoy en da su uso
est ampliamente extendido en la industria alimentaria para asegurar la tanto la
seguridad microbiolgica como la qumica y con frecuencia se extiende para su uso
para cubrir parmetros relacionados con la calidad. Un sistema de APCPC puede ser
descrito del siguiente modo:
- Debe considerarse todo el proceso, desde las materias primas hasta el producto
final .Aqu nos resulta til un simple diagrama de flujo
- Debe realizarse un listado de todos los peligros potenciales asociados a todas las
materias primas utilizadas y a todas las etapas de produccin .Debe de tenerse en
cuenta la probabilidad de que cada uno de estos peligros se manifieste con el fin de
identificar los
riesgos reales del producto
- Adems, deben identificarse aquellas etapas del proceso en los cuales se puede
controlar de un modo efectivo los distintos peligros (Puntos Crticos de Control) y
debe ponerse en marcha un sistema de control adecuado que asegure que los
efectos no deseables sean eliminados o controlados hasta niveles aceptables.
- Si se exceden estos lmites ser necesario tomar acciones correctoras. Estas deben
ser especificadas. Tambin debe existir alguna manera de comprobar que se han
llevado a cabo estas acciones correctoras y que se han alcanzado los resultados
deseados.
Deben de mantenerse registros de modo que sea posible tomar un lote de cerveza y
confirmar que las materias primas cumplan con las especificaciones de calidad
definidas y que el proceso estuvo funcionando dentro de los lmites establecidos.
Ejemplo. La coccin del mosto. Antes de la fermentacin el mosto cervecero es
cocido junto al lpulo. Este proceso es importante por varias razones:
1.- Convierte los cidos del lpulo en su forma isomerizada (amargos)
2.- Coagula con las protenas deseables.
3.- Se produce la volatilizacin de compuestos del flavor no deseables.
4.- Esteriliza el mosto.
Por ello es crucial que se alcancen temperaturas prximas a 100Cdurante un
determinado tiempo .La temperatura exacta de coccin no es siempre 100 C sino
que vara en funcin de la presin atmosfrica. En consecuencia debe de medirse y
registrarse la temperatura de ebullicin y si esta se encuentra fuera de los lmites
especificados (quizs 2C) debe de prolongarse el tiempo de ebullicin o bien
cerrar la caldera de coccin para lograr un aumento de presin interna, logrando as
aumentar el punto de de ebullicin del mosto.
146
Figura 67. Diagrama de flujo de la planta de produccin de Cerveza
8.10.1 Materias primas.Las principales materias primas para la elaboracin de

cerveza son la cebada malteada, el lpulo(o productos obtenidos a partir del lpulo
como pellets o extractos), levaduras y agua. Otros cereales, malteados o sin maltear,
en forma de harinas o Grits, o como grano entero, o tambin pude utilizarse para
impartir caractersticas especiales a algunas cervezas.
Cereales y Malta.Los riesgos ms importantes en estas materias primas son los contaminantes
qumicos, las infecciones por hongos y las infecciones por insectos. Hay establecido
lmites legales para una serie de contaminantes como residuos pesticidas y metales
pesados como el Pb en las producciones vegetales. El fabricante de cerveza debe
insistir que la malta que le suministren est elaborada a partir de cereales que
cumplan con la legislacin.
Las condiciones de almacenamiento tambin son importantes:
Especialmente de la malta que es muy vulnerable ya que puede absorber malos
olores con facilidad. Tambin deben fijarse lmites mximos para las nitrosaminas
Voltiles.
La deteccin de estos contaminantes cancergenos en la cerveza y el whisky (as
como otros alimentos como las carnes curadas) durante el comienzo de los aos 70
caus una gran preocupacin y alteracin en las industrias cervecera y del malteo
,hasta que se identific la fuente de contaminacin. Tras arduas investigaciones se
hall que la NDMA (N-nitrosodimetilamina) poda formarse durante el secado y
tostado de la malta mediante la reaccin entre los xidos de nitrgeno (NO X)
presentes en los gases del horno y las aminas del grano .En las plantas modernas se
evita la formacin de nitrosaminas mediante el uso de hornos de combustin
147
indirecta en los cuales los gases no entran en contacto con la capa de grano. Hoy las
cantidades de NDMA son muy bajas, pero se sigue controlando de modo rutinario
tanto por las maltas como a las cervezas para asegurar que el contenido en
nitrosaminas se encuentre dentro de los lmites especificados.
Los hongos pueden infectar al grano tanto en el campo como durante el
almacenamiento .En cada uno de los casos se ven involucradas especies diferentes
adaptadas al contenido de humedad disponible que oscila desde un 40-50% en el
grano en maduracin, hasta por debajo del 18% en el grano maduro. En la medida
de lo posible deben de evitarse estas infecciones fngicas, no solo por el dao que
le ocasiona a la viabilidad del grano y la calidad de la cerveza, sino tambin porque
puede llevar asociada la formacin de metabolitos secundarios txicos, conocido
como Micotoxinas las ms txicas de estas sustancias, las aflatoxinas estn
principalmente circunscritas a los productos cultivados en climas tropicales ya que
los hongos que lo producen requieren de condiciones de temperatura y humedad
ms elevados de las que habitualmente se encuentran. La unin Europea ha
introducido una serie de de controles legales con el propsito de protegerse frente a
las posibles contaminaciones de productos importados, especialmente man y maz
estas normas imponen un lmite de 4 microgramos /kg de aflatoxinas totales en
cereales y un lmite de 2microgramos/kg para las ms txicas, la aflatoxinas B1
La especie de hongos micotoxignicos ms comunes que se encuentran en los
campos
pertenecen a Fusaria.Estos se encuentran en los cereales como maz, trigo, cebada
normalmente los niveles de infeccin son bajos, los hongos del genero Fusarium
pueden producir varias micotoxinas .Qumicamente se conocen como
tricotecenoseincluyen compuestos como el Desoxinivalenol, Nivalenol y la toxina T2 son sustancias menos txicas que la aflatoxinas .Aunque se estaban estudiando
niveles de accin de entre 500 y 750 microgramos /kg de cereales y sus derivados.
La concentracin de toxinas del gnero Fusarium en la cebada cervecera est muy
por debajo de los niveles de actuacin propuestos para granos de alimentacin
animal.
Otros hongos como la especie Penicilliumy Aspergillus pueden crecer con los
contenidos de humedad ms bajos del grano maduro (entre un 16-20% de
humedad) en las condiciones favorables de temperatura y humedad, estas especies
pueden producir otra micotoxina, la ocrotoxina A. Se cree que la ocrotoxina A es
cancergena y actualmente se estn implantando lmites legales en la Unin Europea
(de 3-5 microgramos/kg) La cebada para malteado es habitualmente desecada
hasta un contenido de humedad inferior al 14% (a menudo por debajo del 12% de
humedad para almacenamiento durante periodos largos de tiempo) con el objeto
de conservar su viabilidad ya que eta es, por supuesto, esencial para la germinacin.
La misma malta es desecada hasta un contenido de humedad no superior al 6% el
cual como se almacenan en condiciones apropiadas de ambiente seco, resulta
148
demasiado seco como Para permitir el crecimiento de los mohos.

Las infecciones por insectos son siempre un problema potencial en cualquier lugar
donde se almacenen granos a lo largo del tiempo .Es esencial prestar atencin a la
limpieza e higiene en el almacn de los granos .El secado y el enfriado tambin son
importantes, ya que muchos insectos no pueden reproducirse por debajo de
determinadas condiciones de temperatura y humedad. Los cereales sin maltear que
pueden haber estado almacenado por muchos aos desde su recoleccin ,pueden
tratarse con insecticidas adecuados, este tratamiento no est permitido para la
malta .Aunque se encuentra parcialmente protegido del ataque de los insectos por
su bajo contenido de humedad es necesario que la malta se elabore y comercialice a
lo largo del mismo ao para evitar que se almacene durante largos periodos de
tiempo por consiguiente cualquier plan de APCPC prestar especial atencin en
comprobar las condiciones de almacenamiento para todas las materias primas.
Un grupo de contaminantes ambientales que causa crecientemente problemas es el
de los PCBs (bifenilospoliclorados) y las dioxinas que estn relacionadas
estructuralmente. Estos contaminantes orgnicos derivan casi en su totalidad de
fuentes de origen humano. Una fuente particularmente importante en la
incineracin de de materiales de desecho, que si no se llevan a temperaturas
suficientemente elevadas puede generar tantas dioxinas como PCBs, los cuales son
compuestos qumicos extremadamente txicos que pueden contaminar los pastos y
las cosechas de las reas prximas .Los dioxinas como PCBs son contaminantes de
naturaleza orgnica solubles el lpidos por lo tanto tienden a concentrarse en
alimentos como la leche, los aceites y las carnes. La cerveza se encuentra protegida
a este respecto ya que la cebada tiene un contenido de lpidos relativamente bajo
(Alrededor de un 3% del grano est compuesto de lpidos)
El Lpulo y productos derivados.Como para los cereales, los principales riesgos provienen de los residuos de
pesticidas y de metales pesados, tambin se han establecido lmites para los
nitratos, que tienden a acumularse en zonas de las plantas que tienen hojas y en los
conos del lpulo.
Por ejemplo el procesado para producir extractos de lpulo en los cuales los cidos
del lpulo se encuentran concentrados, generalmente reduce las concentraciones
de estos contaminantes de un modo importante.
El Agua.Ms del 95% de la cerveza es agua. Por ello no resulta sorprendente que la calidad
del agua sea de vital importancia para la calidad del producto final. El agua utilizada
para la produccin de la cerveza, proceda tanto de los pozos propios de la cervecera
149
como de las redes pblicas, debe ser agua de calidad para consumo humano en lo
relativo a cualquier contaminante qumico o microbiolgico .Esto significa que debe
cumplir cualquiera de las legislaciones vigentes.
Los metales pesados, como el plomo y cadmio, son una de las principales
Preocupaciones en lo relativo al agua empleada para la fabricacin de alimentos .Sin
embargo, nos encontramos con que, de nuevo, la cerveza est protegida, ya que los
metales se unen al bagazo, a los turbios y a las levaduras, siendo retirados de la
cadena de produccin, por ello, la cerveza normalmente contiene concentraciones
ms bajas de estos contaminantes que el agua utilizada en su elaboracin.
En muchas fbricas de cerveza en particular en aquellas ubicadas cerca de reas
urbanas vulnerables, se han instalado plantas de tratamiento de aguas que incluyen
columnas de intercambio inico y de smosis inversa. En estos lugares deben de
incluirse un plan de APCPC .De este modo deben de existir procedimientos claros
para el mantenimiento y limpieza de los filtros y controles reguladores para asegurar
que estn funcionando dentro de los parmetros especificados.
LaLevadura.La mayora de las fbricas de cerveza utilizan barias veces su levadura, en
consecuencia el principal objetivo sobre seguridad es evitar la contaminacin
microbiolgica, tanto por bacterias como por levaduras salvajes. Por ello, un buen
plan de APCPC tendra que especifica
r el modo de manipular y almacenar las levaduras que son recogidas al final de la
fermentacin. En las grandes fbricas de cerveza es posible que se establezca un
nmero fijo de generaciones antes de introducir un cultivo fresco. Sin embargo, en
muchas fbricas pequeas la levadura ha sido reutilizada de una fermentacin a otra
durante muchas generaciones. Con frecuencia estas fbricas confan en una mezcla
de cepas de levadura emparentada las cuales han evolucionado a lo largo de
dcadas para adecuarse a las condiciones del proceso a la calidad del producto
requerido, adems de la complicacin que supone el tratar de usar un cultivo puro.
Suponiendo que la levadura se maneja y almacena de modo adecuado de modo que
sea viable por completo, fcilmente superar a cualquier microorganismo alterante
que trate de competir y puede utilizarse casi infinitum sin que aparezcan efectos
deletreos en la calidad de la cerveza afortunadamente y como ya se ha
mencionado, la combinacin de los cidos amargos del lpulo, el bajo pH , las
concentraciones de dixido de carbono y las condiciones anaerbicas asociadas con
la fermentacin de la cerveza implican que pocas bacterias patgenas, si es que hay
alguna sean capaces de crecer. La principal preocupacin la constituyen las bacterias
alterantes.
Estas bacterias que se han adaptado a las condiciones de la cerveza y que, aunque
no son peligrosas para el hombre pueden dar lugar a turbidez o flavores
desagradables a la cerveza. Alguna de las bacterias alterantes como
Obesumbacteriaproteus pueden, constituir, adems, un riesgo sanitario de modo
150
indirecto ya que son capaces de reducir los nitratos a nitritos los cuales a su vez
pueden transformarse en nitrosaminas , en el intestino humano tiene lugar
reacciones muy parecidas. Al contrario que el NDMA, estas nitrosaminas no son
voltiles y forman un grupo de compuestos que todava no han sido caracterizados
por completo. En consecuencia se les denomina ATNC o compuestos N- nitrosos
totales (del ingls apparent Total N-nitroso Compounds) para evitar la formacin de
cualquier compuesto ATNC algunas fbricas han introducido un lavado regula de
levadura con algn cido diluido de calidad alimentaria con el fin de matar a
cualquier otra bacteria .Tambin es cada vez ms frecuente el limitar el nmero de
generaciones que se utilizan las levaduras .Un buen plan de APCPP para una fbrica
pequea de cerveza ,incluira exmenes regulares de la levaduras mediante
microscopia ptica para detectar levaduras salvajes y bacterias contaminantes .
Tambin serian de utilidad los datos del anlisis y de las cartas de producto
terminado para controlar la presencia de bacterias alterantes ya que los malos
olores producidos por estos microorganismos pueden ser detectados normalmente
a concentraciones extremadamente bajas, por catadores extremados.
8.10.2 Durante el proceso.El plan de APCPC tambin deben considerarse aquellos
peligros asociados al proceso en s mismo En estos se incluirn
- La planta de fabricacin de cerveza, debe tener un diseo higinico. Sin puntos
muertos en el sistema de tuberas que no pueden ser limpiados de un modo
adecuado.
- Los materiales de construccin. Deben ser resistentes a la corrosin y a la
suciedad, capaces de ser limpiados por completo mediante el uso de agentes de
limpieza permitidos parta el uso sobre materiales en contacto con los alimentos y no
deben ser fuente de materiales que puedan ser peligrosos o que puedan conferir
olores
desagradables a la cerveza.
- Agentes de limpieza y esterilizacin: stos deben estar permitidos para su uso en
materiales en contacto con los alimentos y no deben dejar residuos peligrosos u
olores, o afectar de algn otro modo a la cerveza (por ejemplo alterando la
capacidad de formacin de espumas)
- Frecuencia y eficacia de los ciclos de limpieza y aclarado
- Empleo de aditivos y coadyuvantes de fabricacin; estos deben estar aprobados
para el uso previsto, fabricados segn las especificaciones adecuadas y aadidos en
las dosis correctas.
- Parmetros crticos como tiempos, temperaturas y grado de mezcla.
El sistema de APCPC debe asegurarse que estn en marcha los controles adecuados
para mantener el proceso funcionando en la direccin y modo en el que se pretende
hacerlo. Tambin debe de asegurarse que cualquiera de las desviaciones que
puedan aparecer, sean detectadas y corregidas. De nuevo, deben tomarse los
registros adecuados de modo que posteriormente se puedan seguir la trazabilidad
de las condiciones de procesado de cualquiera de los lotes.
151
8.11 SEGURIDAD MICROBIOLGICA

Como se ha mencionado anteriormente, la incapacidad que las bacterias patgenas
tienen para multiplicarse en la cerveza implica el que la industria cervecera no sea
de alto riesgo en trminos de seguridad microbiolgica. Sin embargo, puede verse
comprometida la calidad del producto debido a las infecciones por bacterias
alterantes. Aunque la etapa de coccin despus del braceado o empastado esteriliza
en forma efectiva el mosto cervecero antes de la fermentacin, no es deseable la
actividad bacteriana previa a la etapa de coccin a cusa de la presencia de algunos
de sus productos, como nitritos o las toxinas ,que son potencialmente dainos .Por
ejemplo cualquier nitrito puede reaccionar con las aminas presentes en el mosto
cervecero, como ya se ha descrito en el caso de las bacterias alterantes al principio
de la fermentacin, para dar lugar a las nitrosaminas no voltiles, y ATNCs por
consiguiente, el plan de APCPC debe tener en cuenta la higiene de las instalaciones
de empastado y asegurar que se alcanzan las temperaturas establecidas para los
procesos de empastado y de coccin durante el periodo de tiempo determinado.
Aquellos mostos que deben almacenarse por un periodo de tiempo antes de la
coccin no que vallan a ser conducidos a la caldera de empastado, deben
almacenarse a una temperatura alta para prevenir la actividad bacteriana.
Los estndares de limpieza son incluso mayores para todas aquellas fases del
proceso posteriores a la etapa de coccin. La cerveza que se destine a envasado en
botellas, latas o barriles tiene la salva guarda aadida de la pasteurizacin, pero
tambin existen cervezas que se comercializan sin pasteurizar en toneles. El plan
APCPC tambin es necesario tener en cuenta cualquiera de los productos o procesos
que sean particularmente vulnerables como los productos bajos en alcohol y las
botellas rellenables. Obviamente la operacin de pasteurizacin es crtica y es
necesario que estn puestos en marcha los controles necesarios para comprobar
que siempre se alcanzan las temperaturas correctas de trabajo y que el tiempo de
mantenimiento es suficiente. El plan APCPC especificara la frecuencia y el tipo de
ensayos microbiolgicos que se realizarn y all donde sea posible deben utilizarse
test rpidos.
8.11.1 Envasado.En las fbricas modernas de cerveza esta es una operacin muy
rpida, no es raro un volumen de 2000 botellas por minuto, y como
consecuentemente vulnerable, El plan APCPC debe abarcar:
- La calidad de los materiales de envasado: deben ser adecuados para su uso en
alimentos y no deben liberar sustancias qumicas dainas o que den olores al
producto.
- El almacenamiento de los envases vacos, son con el fin de evitar que se recojan
suciedad u olores.
- Limpieza adecuada de los envase reutilizables.
152
- La posibilidad de que los objetos extraos (por ej. Un insecto) se introduzcan en el

envase en el momento del llenado.
- La posibilidad de que haya cristales en el envase: estos pueden tener su origen en
las botellas defectuosas o en las cabezas de las llenadoras y las mirillas
- Sabotajes
- La limpieza de los filtros.
- La posibilidad de contaminacin, por ejemplo, lubricantes (de las cintas
transportadoras, etc.) refrigerante o agente de limpieza.
- El funcionamiento eficiente de los pasteurizadores.
- El llenado estril
Hoy en da, los equipos de envasado normalmente tienen incorporado un gran
nmero de de sistemas de control y de seguridad, para por ejemplo, comprobar la
presencia de objetos extraos en el envase, El sistema de APCPC debe asegurar que
hay pruebas suficientes de que estos sistemas trabajan correctamente y que pueden
detectar todo tipo de inclusiones. Por ejemplo es una prctica habitual la de utilizar
una serie de envases test con inclusiones a diferentes alturas de las botellas y de
las latas para comprobar que el sistema de deteccin est funcionando.
8.11.2 Manejo de aguas residuales. Las aguas residuales varan segn el tipo de
producto de producto y los mtodos de trabajo. Estas aguas contienen un elevado
contenido de material orgnico, que ocasiona daos en el sistema de drenaje y en
las aguas superficiales. Por eso, las aguas residuales deben tratarse antes de ser
evacuadas. Las aguas residuales pueden dividirse en las siguientes clases:
1) Agua para los servicios pblicos.- Deben estar libres de grmenes patgenos,
antes de ser evacuados a travs del sistema general de drenajes.
2) Agua utilizada en enfriamiento.- El agua para enfriamiento se reutiliza con el
mismo fin. Tambin se puede utilizar para la limpieza y para alimentar calderas.
3) Agua con residuos de productos.-El grado de contaminacin del agua con
residuos orgnicos de productos, se expresa mediante el Demanda Bioqumico de
Oxgeno o DBO. Se determina la cantidad de oxigeno que consumen las bacterias
para descomponer la materia orgnica durante cinco das .As la DBO se expresa en
mg de oxigeno consumido para la descomposicin de la materia orgnica en un litro
de agua.
Las aguas residuales se depuran con mtodos fsicos, biolgicos, o con la
combinacin de ambos. A travs de la depuracin fsica se eliminan primero las
partculas slidas luego se adicionan coagulantes para favorecer la floculacin. Los
slidos floculados se dejan sedimentar. Cuando el agua est clara, se filtra. La
depuracin biolgica consiste en favorecer la actividad microbiana que convierte las
sustancias orgnicas en anhdrido carbnico y agua. Esto se logra por la inyeccin de
aire al agua .Cuando el material carbnico se ha degradado, el barro y los
conglomerados de microorganismos se dejan sedimentar el agua clarificada se
153
evacua por el sistema general de drenajes. Las aguas residuales se emplean el riego.
El contenido orgnico sirve de abono a los cultivos.
8.11.3 Manejo de desechos. Los desechos slidos se emplean en la preparacin de
piensos, fertilizantes y pectina. Por lo que respecta a la basura, sta se maneja en la
siguiente forma.
- Deben mantenerse temporalmente en depsitos cerrados
- Debe de recogerse de inmediato aquella que proviene de las reas de elaboracin,
y transportarse en recipientes cerrados
- Debe recogerse regularmente y eliminarse
- No debe acumularse, ni aun en los depsitos.
Un mal manejo de los desechos puede crear focos de infeccin en el proceso de
elaboracin del producto.
8.11.4 Sabotajes. Hay una serie de medidas que pueden adoptarse con el fin de
reducir las posibilidades de la introduccin de una sustancia daina que puede
alterar al alimento. La mayor parte de estas medidas son comunes a todos los
alimentos en general .Entre estas se incluyen la seguridad en los lugares de
fabricacin y almacenamiento, recipientes cerrados y/o sellados y el uso de un
envasado a prueba de apertura. La naturaleza de la mayora de los envases
utilizados en la cerveza, es decir, las latas, botellas, barriles hace que cualquier
manipulacin al producto terminado vaya a ser evidente.
Sin embargo, es imposible el prevenir totalmente el acceso a las cadenas de
produccin durante la fabricacin. En este punto, la principal salvaguarda debe de
ser la completa trazabilidad del producto, mediante el marcado de lote, los cdigos
de envasado y la documentacin adjunta, de modo que los lotes sospechosos
puedan ser identificados rpidamente y retirados sin importar en qu lugar de la
cadena de distribucin se encuentren, afortunadamente, este tipo de incidentes son
raros, aunque all donde ocurren, tienden a traer una gran publicidad.
8.12 ALERGENOS
Un alrgeno es una sustancia que puede inducir una reaccin de hipersensibilidad
(alrgica) en personas susceptibles, que han estado en contacto previamente con el
alrgeno. Esta reaccin de hipersensibilidad involucra el reconocimiento del
alrgeno como sustancia "extraa" y ajena al organismo en el primer contacto. En
exposiciones posteriores, el sistema inmunitario reacciona a la exposicin de forma
excesiva, con la liberacin de sustancias que altera la homeostasis del organismo, lo
que da lugar a los sntomas propios de la alergia. Generalmente esta
hipersensibilidad est predispuesta genticamente en algunos individuos o
familias.Con relacin a la cerveza, deben de considerarse dos potenciales alrgenos
uno es l:
154
1) Gluten.- Es el nombre que reciben el complejo de las protenas gliadinas y los

carbohidratos presentes en el trigo .En los cereales estrechamente emparentados
con la cebada, la avena y el arroz
se encuentran protenas similares
estructuralmente. En la
Cebada a esta protena se denomina hordena, nombre que proviene de la
denominacin latina de la cebada Hordeum. Estas protenas pueden causar
lairritacin de las clulas de la mucosa gstrica de ciertas personas causando la
enfermedad celiaca, los que sufren del sndrome celiaco deben de evitar el consumo
de cualquier alimento que tenga derivados del trigo y de otros cereales
responsables. Obviamente la cebada y la malta son dainos para los celiacos .Existe
debate sobre si la cerveza es o no peligrosa, ya que una parte importante de las
protenas de la cebada se queda en el bagazo. Adems, gran parte de protena
extrada del mosto cervecero es retirada despus en forma de turbios o bien
separada por filtracin antes del envasado, de modo que no permanece en la
cerveza. El anlisis qumico del gluten de la cerveza y de otros alimentos procesados
est sujeto a una serie de limitaciones y la presencia de protenas celiaco positivas
en la cerveza no ha sido probada de forma consistente, aunque se encuentran
ciertos pptidos derivados de la cebada .Sin embargo se aconseja a los enfermos
celiacos que tomen la cerveza con cuidado, ya que la sensibilidades pueden variar
enormemente en los individuos.
2) Dixido de azufre.- La otra reaccin alrgica (que podra ser descrita de un modo
ms apropiado como intolerancia alimentaria) que puede asociarse a la cerveza es la
relacionada al dixido de azufre. Este es el aditivo autorizado que se utiliza como
conservante en un amplio grupo de alimentos durante muchos aos y que, en las
concentraciones utilizadas, no supone ningn riesgo para la salud de la mayora de
las personas .Sin embargo, un pequeo nmero de individuos son hipersensibles al
sulfito y estas personas pueden sufrir graves reacciones asmticas, que pueden
resultar
fatales, incluso a exposiciones bajas. El dixido de azufre puede aadirse,
normalmente en forma de metabisulfito sdico o potsico, como antioxidante y
conservante a un amplio grupo de alimentos entre los que incluyen bebidas
alcohlicas. En la cerveza la principal funcin es proteger frente a la formacin de
flavores a rancio u oxidados. Las concentraciones de sulfito se encuentran reguladas
por la legislacin de la Unin Europea con un lmite para las cervezas envasadas de
20 mili gramos /kg se permite hasta 50 mili gramos /kg en algunas cervezas maduras
en toneles) que son relativamente bajas, si se comparan con algunos otros
alimentos.
9. BIBLIOGRAFA
AmparoQuerol, Graham Fleet 2006YEASTS IN FOOD AND BEVERAGES Springer New
York pp. 215-284
155
Asociacin de Maestros Cerveceros de las Amricas 1977 EL CERVECERO EN LA

PRCTICA Inc. Madison, Wisconsin pp.18-314
C. W. Bamforth 2006 BREWING NEW TECHNOLOGIES Woodhead Publishing Limited
Cambridge England pp.167-180
Chris Boulton and David Quain2001 BREWING YEAST AND FERMENTATIONBlackwell
Science Ltd pp. Oxford 29-508
Dennis E. Briggs 2004 BREWING SCIENCE AND PRACTICEWoodhead Publishing
Limited. Cambridge England pp. 1-325
Fergus G. Priest & Graham G. Stewart 2006HANDBOOK OF BREWINGTaylor & Francis
GroupBoca Raton, Florida pp.91-487
Henry C. Vogel 1997 FERMENTATION AND BIOCHEMICAL ENGINEERING HANDBOOK
Heinkelsistemas de filtrado, Inc.Bridgeport, Nueva Jersey pp.1-161
IanS.Hornsey 1999 ELABORACIN DE CERVEZA MICROBIOLOGIA,BIOQUMICA Y
TECNOLOGA Acribia Zaragoza pp.99-137
J.S.Hough 1990 BIOTECNOLOGA DE LA CERVEZA Y LA MALTA Acribia Zaragoza
pp.9-156
Katherine Smart2003 BREWING YEAST FERMENTATION PERFORMANCE Blackwell
Science pp. Massachusetts 61-118
LubertStryer 2004 BIOQUMICA Editorial Revert S.A. Barcelona pp.189-221
Michael T. Madigan 2004 BROCK BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS Pearson
Prentice Hall Illinois pp.65- 131
P.S Hughes y E.D Baxer, 2004 CERVEZA CALIDAD, HIGIENE Y CARACTERISTICAS
NUTRICIONALES, Editorial Acribia S.A, Zaragosa. pp. 105-165
Wolfgang Kunze 2006 TECNOLOGA PARA CERVECEROS Y MALTEROS VLB Berln
pp.255-543
156

Altamirano CC PDF

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Altamirano CC PDF

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUMICA, INGENIERA QUMICA INGENIERA

Optimizacin de un Mtodo para la Produccin

El presente trabajo se realiz en las instalaciones del laboratorio de Microbiologa

A mis padres Dora y Aquilino

A mis hijos Jos y lvaro, que la presente estimule

A mis hermanos Jadsn, Marco, Lino por su constante apoyo

Al Dr. Abad Flores Paucarima, Maestro y amigo

Dr. ABAD FLORES PAUCARIMA, Catedrtico de la UNMSM responsable del

Dr. JORGE CHVEZ PREZ, Catedrtico y Director del Instituto de Investigacin en

Mg. GILBERTO SALAS COLOTTA, Catedrtico y Director de Escuela de Ing. QUMICA

Mg. LEONCIO REYNA MARIAS, Catedrtico y Director de Escuela de Ing. QUMICA

Ing. QUMICO JORGE LUS CRDENAS RUZ, Catedrtico de la Facultad de Qumica

por lo general es empleando un factor de alrededor de 1:10 para cada trasegado, y

2.1 LA CLULA DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae

2.2.1 La pared celular

2.2.2 Espacio Periplasmtico

2.2.3 Membrana Citoplasmtica

2.2.4 El Ncleo Celular

2.2.5 Estructura de las Mitocondrias

2.3 OTRAS ESTRUCTURAS CITOPLASMTICAS

2.3.1 Las Vacuolas

2.3.3 El Retculo endoplasmtico

2.3.4 El aparto de Golgi

2.4 EL MICROSCOPIO PTICO

2.5 LAS ENZIMAS

2.5.1Factores que modifican la velocidad de las Reacciones Enzimticas

2.6 METABOLISMO CELULAR OXIDATIVO

2.7 VAS ANAERBICAS

2.7.1 Fermentacin alcohlica.

2.7.2 La fermentacin lctica

2.8 LA CIENCIA DE LA MACERACIN DEL MOSTO DE MALTA

2.8.1 Preparacin de la malta

2.8.2 Produccin del mosto de malta.

2.8.4 Procesamiento final

2.9 CONCEPTO DE DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

2.10 MTODOS DE ESTERILIZACIN

2.10.1 Esterilizacin por calor seco

2.10.2 Esterilizacin por calor hmedo

2.10.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV

2.10.4 Esterilizacin por Filtracin.

2.11 CONCEPTO DE CULTIVO PURO

2.11.1 Mtodo de aislamiento de Levaduras Saccharomyces cerevisiae

2.11.2 Caractersticas culturales de la colonia de Saccharomyces cerevisiae

2.12 METODO DE CONSERVACIN DE CEPA

2.12.1.1 Conservacin por congelacin

2.12.1.2 Conservacin por liofilizacin

2.12.2 Mtodo de conservacin a corto plazo

2.13 CULTIVO Y PROPAGACIN CELULAR

2.13.1 Propagacin de levadura en el laboratorio

2.13.2 Propagacin de levadura en la planta de cervecera

2.13.3 Efecto Pasteur

2.13.4 Efecto Crabtree

2.14 CONCEPTO DE CULTIVO CELULAR VIABLE Y VITAL

2.14.1 Evaluacin de la viabilidad de un cultivo de clulas de levadura

2.14.2 Evaluacin de la vitalidad de un cultivo de clulas de levadura

2.15 MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIN DE

2.15.1 Recuento directo

2.15.2 Medida de la masa de clulas

2.15.3 Recuento de viables

2.15.4 Medida del nmero de partculas

2.15.5 Medida de parmetros bioqumicos

2.15.6 Medida de actividad metablica de las bacterias