Unidad 2. TCNICAS BACTERILGICAS.

2.1 Preparacin de Medios de Cultivo.

Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn por la cual es
difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual
debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un
paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos
ltimos se basan muchos de los principios del aislamiento.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que
crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte
que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos.
La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de
cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. El
conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es fundamental para
seleccionar un medio de cultivo adecuado.
Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente
natural en el que se desarrollan.
Las caractersticas de los microorganismos a tomar en consideracin al momento de preparar
un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:
Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa, segn los cuales se los clasifica
en auttrofos, hetertrofos, quimiotrofos (littrofos u organotrofos) y fottrofos.
Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos.
Temperatura ptima de crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el
microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en psicrfilos, mesfilos y termfilos.
Rango de pH: en general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias oscila entre 6,6 y
7,2.

2.1.1 Caractersticas generales de un buen medio de cultivo.

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes
indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la
consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras.
Como ya se ha sea lado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin adecuada, depende
del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hbitat natural.
La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el
pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los microorganismos.
Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente
oxidables al calor, cuando se requiera estos se esterilizaran por otro mtodo y se agregaran al medio
cuando se encuentre entre 45 a 50 C.
En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para
algunos microorganismos y no para otros.

2.1.2 Constituyentes habituales de los medios de cultivo.

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin de los
medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente
de la preparacin.
Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.
Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El
componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que
se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin
(funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los
42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura
de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado
como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar
movilidad se usa agar blando se le agrega agar del 3 al 5 %.
Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne,
hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma
final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la
confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso
del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas,
mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y carbono.
Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que
carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas
animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y
aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteasas,
peptonas, polipptidos y aminocidos.
Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son
frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre
no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de
un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino
tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para
mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms
comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales
como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin
del pH.
Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo con
objeto de detectar variaciones del pH.
Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los
medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o
anaerobios.
Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo
en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta,
sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan
como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

2.1.3 Preparacin.
En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un medio de cultivo
comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una receta que deber respetarse
estrictamente.

En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente

bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de
cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada,
siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo.
Primero se agrega la mitad del volumen de agua destilada o desionizada a un matraz Erlenmeyer o
baln, luego se incorpora el medio deshidratado, se homogeniza el medio en el agua y se vierte la
volumen faltante de agua tratando de remover el medio que se quedo sobre las paredes del matraz.
Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de
agregar el siguiente. La disolucin de los medios puede requerir hervir por 3 a 5 min.
Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea el adecuado.
En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).
Si la presentacin del medio ser en tubo es necesario transferir el volumen adecuado a cada tubo y
despus realizar el proceso de esterilizacin. Si el medio se dispondr en cajas se esteriliza en el
matraz y se transfiere a las cajas una vez esterilizado cuando se encuentre a 45 C, a esta
temperatura el medio an se mantiene en estado lquido y se formara la menor cantidad de agua de
condensacin en la tapa de la caja, recordemos que el agar se solidifica o gelifica a los 42 C.

2.2 Control de Calidad para los medios de cultivo.

El laboratorio de Bacteriologa debe asegurarse del adecuado funcionamiento de los medios de
cultivo antes de usarlos, tanto si son comerciales como preparados en el laboratorio. A nivel nacional
los laboratorios que comercializan o realicen sus propios medios de cultivo estn obligados a cumplir
lo indicado en la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones
sanitarias de los medios de cultivo, as como lo descrito en el documento CLSI M22-A3 "Quality
Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition.
Los medios de cultivo deben estar sometidos a un proceso de control de calidad interno que asegure
que son estriles, que permiten el crecimiento de microorganismos especficos y/o inhiben el
crecimiento de otros y que proporcionan una adecuada respuesta bioqumica.
Prueba de esterilidad. Se toma una muestra representativa de cada lote de medios de cultivo
preparados y se introduce en la incubadora a 37C durante 24 hrs. Una vez cumplido este tiempo se
retiran de la incubadora y se revisa cada cajo o tubo sometido a esta prueba. Un medio de cultivo
estril no presentara desarrollo de bacterias y esto nos indicara que el lote preparado puede ser
utilizado. El observar desarrollo bacteriano nos indica que el proceso de esterilizacin no fue eficaz y
por lo tanto el lote preparado no se encuentra estril y debe ser rechazado para su uso.
Prueba de promocin de crecimiento. Se toma una muestra representativa de cada lote de medio
de cultivo preparado y estos son inoculados con cepas de referencia (ATCC), se introducen a la
incubadora a la temperatura y el tiempo adecuado para cada cepa de referencia. Una vez que se
cumple el tiempo de incubacin se retiran los medios de la incubadora y se revisan verificando el
crecimiento de las cepas de referencia.
Esta prueba tambin nos permite validar el efecto inhibidor del medio de cultivo al inocular cepas
que de manera normal no crecen en los medios de cultivo ya que estos presentan algn factor que
inhiben su crecimiento. Cuando se observa el crecimiento de una cepa que debe ser inhibida, nos

indica que el factor inhibidor del medio esta fallando por lo cual no es conveniente utilizar este medio
de cultivo.
Esta prueba se realiza principalmente a los medios de cultivo selectivos.
Es posible demostrar las caractersticas bioqumicas del medio de cultivo inoculando cepas de
referencia que manifestaran los cambios caractersticos del medio cultivo los cuales se manifestaran
la mayora de las ocasiones por un cambio o vire de color que se puede observar en las colonias o
en la superficie del medio. Esto debe realizarse principalmente en medios de cultivo diferenciales.

2.2.1 Medios de cultivo comerciales.

Es recomendable que sean proporcionados por el fabricante los certificados de calidad
correspondientes a cada envo o lote fabricado de cada medio de cultivo. El fabricante debe aportar
informacin sobre: el nombre del medio, nmero de lote, cantidad enviada y fecha de caducidad.
Adems, para cada lote de medio debe facilitar un certificado del control de calidad en el que se
especifican las condiciones de conservacin, control de esterilidad, criterios de aceptabilidad, control
del funcionamiento indicando las cepas utilizadas, fecha de emisin y firma del responsable del
laboratorio fabricante.
Antes de introducir un nuevo medio en el laboratorio, debe ser validado con cepas de referencia;
este procedimiento debe repetirse siempre que el fabricante indique que las caractersticas del medio
han cambiado o que se detecte alguna deficiencia en el uso rutinario. Tras la recepcin de los
medios en el laboratorio y antes de usarlos, hay que comprobar las caractersticas fsicas (color,
precipitados, placas rotas, excesivo nmero de burbujas, crecimiento de colonias, etc.) y se debe
documentar cualquier anomala detectada. El control de calidad se completa con el estudio de la
esterilidad y la comprobacin del crecimiento de microorganismos especficos y/o inhibicin de otros,
o bien produccin de reacciones bioqumicas o morfologas tpicas de los microorganismos
ensayados.
Segn los requerimientos de control de calidad los medios comerciales se clasifican en:
- Medios exentos: no requieren que el laboratorio controle su esterilidad o su adecuado
funcionamiento, siempre que el fabricante aporte las especificaciones de calidad
correspondientes.
- Medios no exentos: el usuario debe comprobar su esterilidad y funcionamiento, ya que
puede variar en funcin del lote.
El documento del NCCLS (ahora CLSI) M22-A3 "Quality Control for Commercially Prepared
Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition" proporciona una relacin detallada
de medios exentos y no exentos (ver Tabla 1B del documento citado). Algunos de los medios
recogidos como exentos son:

- Agar sangre (no selectivo)

- Agar Salmonella- Shigella

(SS)

- Agar chocolate

- Caldo Selenito o caldo GN

- Caldo tioglicolato

- Agar CLED

- Caldo BHI o TSB

- Agar Levine o Agar EMB

- Medios de hemocultivo

- Agar MacConkey

- Agar sangre colistina

nalidxico

- Agar para Legionella

CYE/BCY

- Agar manitol-sal

- Agar Brucella

- Agar alcohol fenil etlico

- Agar yema de huevo

- Agar selectivo para

enterococo

- Agar sangre lacada con

kanamicina

- Agar TCBS

- Agar Sabouraud dextrosa

- Agar Hektoen

- Agar cornmeal

- Agar XLD

- Lowenstein-Jensen

- Agar CIN

- Agar Middlebrook

Entre los medios no exentos se encuentran el agar Mueller-Hinton, los medios selectivos para cultivo
de Neisseria spp. y Campylobacter spp., entre otros. El laboratorio debe repetir el control de
esterilidad y funcionamiento en estos medios y en cualquiera de los relacionados anteriormente que
demuestren alguna deficiencia en la recepcin o durante su uso, hasta que el problema quede
resuelto. El laboratorio puede decidir incluir tambin en el control del funcionamiento a los medios de
cultivo exentos, y segn la carga de trabajo, puede realizarlo nicamente en algunos lotes elegidos
aleatoriamente.
Si los medios comercializados proceden de empresas no certificadas por la norma ISO o no cumplen
con las especificaciones de calidad recomendadas, el usuario debe realizar el control de todos los
lotes que se reciben como si se tratase de medios preparados en el laboratorio. Cualquier
deficiencia en el aspecto fsico, esterilidad, no crecimiento de la cepa deseada, o no inhibicin de la
cepa no deseada, ser documentada y notificada a los fabricantes para que emprendan las medidas
correctoras.

2.2.2 Medios de cultivo preparados en el laboratorio.

Algunos medios de cultivo se preparan en el propio laboratorio, bien porque es necesario que sean
recientes para determinados cultivos o porque se debe disponer de ellos inmediatamente y no hay
tiempo de solicitarlos a un fabricante. En este caso, hay que controlar el medio deshidratado, los
aditivos que se van a utilizar, el procedimiento de la elaboracin, el envasado, etiquetado y
almacenamiento y por ltimo, comprobar las caractersticas fsicas, esterilidad y funcionamiento del
medio preparado con cepas de referencia. Todas las fases del proceso han de estar documentadas
en un manual de procedimiento y debe mantenerse un registro detallado de las mismas.
Los medios deshidratados y aditivos que se utilizan para preparar los medios deben estar
etiquetados con las fechas de caducidad, de recepcin y la fecha en la que se abrieron por primera
vez y se deben almacenar en condiciones adecuadas.
El proceso de elaboracin debe quedar registrado, anotando la identidad de los medios, nmero de
lote o fecha de preparacin, condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y la identidad de la
persona que los ha preparado. Es recomendable que cada placa o tubo individual vaya identificado
con el nombre del medio y nmero de lote o fecha de preparacin. Los tubos o placas preparados se
deben almacenar en las condiciones adecuadas establecidas.

Para realizar el control de calidad del medio una vez preparado, se seguir el mismo procedimiento
que para los medios comerciales no exentos.

2.3 Cultivo de Microorganismos.

En muchos aspectos, el pequeo tamao de los microorganismos los hace sujetos ideales para la
experimentacin. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su
estudio. La rpida multiplicacin de estas diminutas criaturas constituye tambin una ventaja
experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo da, Es ms, los
conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo,
generalizados a los sistemas celulares, plantas y animales, incluida la especie humana. Para llevar a
cabo experimentos con microorganismos es usualmente necesario cultivarlos en el laboratorio.
Cultivo. Mtodo de propagacin de bacterias invitro, para lo cual se requiere realizar un medio de
cultivo ptimo que permita el crecimiento bacteriano.
Cepa. Variante fenotpica constituida por bacterias de la misma especie.
Cepario. Coleccin de cepas de referencia (ATCC), utilizadas para llevar acabo las pruebas de
control de calidad en el laboratorio de bacteriologa.

2.3.1 Curva de crecimiento microbiana.

El crecimiento se define como el aumento armnico de todos los constituyentes bacterianos, este
crecimiento lleva a un incremento del tamao y peso de las bacterias, generando la divisin
bacteriana y con esto un aumento en el numero de bacterias, estos se denomina crecimiento
poblacional que no se debe confundir con el crecimiento individual que implica solamente aumento
del tamao, del volumen y diferenciacin de un solo individuo. En general cuando se hace referencia
al crecimiento bacteriano, ste se considera como el crecimiento poblacional.
El crecimiento bacteriano es el resultado de la actividad concertada de ms de 2000 reacciones
enzimticas entre las que destacan los siguientes tipos.

Reacciones de transformacin y captacin de energa.

Reacciones de biosntesis de molculas pequeas.
Reacciones de biosntesis de macromolculas.

El tiempo necesario para que se formen dos bacterias a partir de una se llama tiempo de
generacin y el tiempo que se requiere para que una poblacin bacteriana se duplique se denomina
tiempo medio de generacin, el cual, en la mayora de los documentos escritos se considera slo
como el tiempo de generacin.
El crecimiento microbiano siempre depende de la naturaleza del microorganismo y de las
condiciones del medio, que son la composicin qumica del mismo, la tensin de oxgeno, de bixido
de carbono, viscosidad, actividad de agua, presin osmtica, presencia de sustancias nocivas,
temperatura, pH, entre otras. Los tiempos de generacin son caractersticos para cada
microorganismo y dependen de la condicin del medio en el que se encuentren.

Si se construye una grfica del crecimiento en funcin del tiempo, se obtendr lo que se conoce
como curva de crecimiento bacteriano.

Como se ve en la figura, la curva de crecimiento bacteriano consta de cuatro fases principales;

1) Fase de adaptacin o latencia, tambin llamada fase Lag por ser sta su designacin en
ingls, durante esta fase los bacterias se adaptan a las condiciones del medio de cultivo, se
disponen a expresar su capacidad de utilizar los componentes del medio en las condiciones
del cultivo. Las bacterias utilizan los nutrientes del medio de cultivo, los transforman e
incorporan para obtener la energa necesaria para su reproduccin. En esta fase no se
observa un incremento en el nmero de bacterias, pero si se observa un incremento en el
tamao y en la actividad metablica de cada bacteria, observndose un incremento en la
produccin de macromolculas (RNA, DNA y Protenas), lo cual se conoce como crecimiento
desbalanceado. La duracin de esta fase depende del tipo de microorganismo, de la edad y la
composicin del medio de cultivo del que proviene el inculo.
2) Fase exponencial. Esta fase tambin es llamada de crecimiento exponencial o logartmico,
se caracteriza por que las bacterias despliegan todo su potencial metablico, todos los
componentes bacterianos se sintetizan en equilibrio, a esto se denomina crecimiento
balanceado. Durante esta fase las bacterias transforman los nutrientes a la mxima velocidad
y la obtencin de energa es ptima. La poblacin se duplica cada tiempo de generacin
provocando un incremente en exponencial en el nmero de bacterias, aqu es donde se
producen los llamados metabolitos primarios, por ejemplo los aminocidos y cidos orgnicos.
3) Fase estacionaria. Es en esta fase donde la concentracin uno o ms componentes del
medio de cultivo, se ha reducido hasta producir una disminucin en la velocidad de las
reacciones metablicas. Esto tambin puede deberse a la acumulacin de sustancias txicas

para las propias bacterias o los cambios en el pH del medio de cultivo. En esta fase el nmero
de bacterias se mantiene constante, ya no hay incremento en el nmero de bacterias pero se
puede observar un incremento en el tamao de cada bacteria. En esta fase las bacterias
liberan al medio de cultivo los llamados metabolitos secundarios como los antibiticos y los
pigmentos.
4) Fase de muerte. En esta fase la poblacin disminuye en una alta proporcin cada cierto
tiempo por lo que tambin es llamada fase de muerte exponencial. Esta fase refleja un
deterioro metablico de las bacterias lo cual causa que los individuos ms susceptibles
mueran, esto ocasiona una disminucin en el nmero de bacterias del cultivo.

2.3.1 Obtencin de un cultivo puro o axnico

Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los
cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo,
agua, o en el cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y
diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio.
La obtencin de un cultivo axnico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos
los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y
cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes.

2.4 Mtodos de Esterilizacin.

Para obtener un cultivo axnico y el aislamiento de bacterias a partir de una muestra biolgica se
requieren tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la
naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes utilizados. Estos microorganismos no
deseados o contaminantes deben ser eliminados para que se pueda obtener un cultivo axnico y en
el proceso de muestra para evitar que estos microorganismos interfieran en la obtencin de los
resultados, recordemos que un microorganismos patgeno deber competir por los nutrimentos con
la microbiota asociada o normal presente en la muestra, as como con los microorganismos
contaminantes si estos no son eliminados, lo cul puede reducir la probabilidad de aislar al patgeno.
La eliminacin de todos los microorganismos se denomina esterilizacin. En el laboratorio de
bacteriologa todo el material utilizado para el proceso de muestras debe ser esterilizado. Esto
incluye el medio, las sustancias lquidas o slidas que se aadan como nutrientes al cultivo, los
matraces, tubos de ensayo, las placas, los utensilios necesarios para transferir los cultivos de un
recipiente a otro (pipetas, jeringas), etc. Una vez esterilizado se debe cuidar que el material se
conserve estril para lo cual se debe preparar el material para ser utilizado, as a los tubos, matraces
y otros recipientes se les coloca un tapn de algodn que evitara el acceso de microorganismos del
ambiente al interior. Tambin es necesario proteger este tapn con papel para evitar que se
humedezca con agua de condensacin. Algunos materiales son envueltos con papel para conservar
su condicin de esterilidad.

2.4.1 Conceptos bsicos.

Para poder desempear correctamente las tareas en un laboratorio de microbiologa, es
indispensable contar con conocimientos tericos acerca de los diferentes mtodos de control del

crecimiento microbiano (mtodos de esterilizacin, desinfeccin, apepsia, etc.). Tambin con un buen
manejo prctico de los aparatos destinados a tal fin, del flameado de tubos y la esterilizacin de asas
a la flama del mechero.
Esterilizacin. Es el proceso de destruccin o eliminacin completa de toda forma de vida existente
en el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del calor, radiaciones, filtracin, etc.
Por lo tanto, la esterilizacin es un trmino absoluto e incluye la destruccin de las esporas y formas
vegetativas, los virus, etc.
Desinfeccin. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos
ms comunes pero no las esporas. Generalmente los desinfectantes son productos qumicos
excesivamente txicos para ser usados directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes
llegan a esterilizar.
Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos
patgenos ms comunes, pero no necesariamente esporas, presentes sobre el cuerpo, la piel, las
mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente empleado se denomina antisptico.
Asepsia. Se refiere a la condicin de ausencia de microorganismos de un objeto o rea. Por
ejemplo, las tcnicas aspticas son las que evitan la contaminacin propia de otros o de los
materiales durante el trabajo.
Microbiostasis. Es una condicin por la que el crecimiento o la multiplicacin de los
microorganismos estn inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos. Si el agente
microbiosttico es eliminado, el crecimiento microbiano puede resurgir. De igual definicin pero de
aplicacin a la correspondiente categora de microorganismos son los fungistticos y los
bacteriostticos.
Microbiocida. Es el agente que destruye las formas viables de los microorganismos. De igual
significado pero con mbito ms restringido son los trminos fungicida y bactericida.
Sepsis. Es un trmino que proviene de un vocablo griego que significa putrefaccin. El concepto
se utiliza como sinnimo de septicemia, que es la afeccin generalizada que se produce por la
presencia de microorganismos patgenos o de sus toxinas en la sangre.
Estril. Condicin que significa libre de toda seal de vida.
Pasteurizacin. Proceso de exponer un objeto a agua caliente a 77C, durante 30 minutos. Su
propsito: destruir todos los microorganismos patgenos, excepto esporas bacterianas.
Liofilizacin. Es una tcnica de deshidratacin por frio, un proceso comn en la industria alimentaria
conocido como deshidrocongelacin (secado por congelacin suena ms sencillo) el cual tiene la
virtud de mantener al mximo las propiedades organolpticas de los alimentos, permitiendo la
eliminacin de bacterias al eliminar el agua de los alimentos.

2.4.2 Mtodos de esterilizacin.

El proceso de esterilizacin se puede llevar acabo por mtodos qumicos y fsicos, la seleccin de
uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar.

2.4.2.1 Mtodos Fsicos

2.4.2.1.1. El Calor.
Fundamento de la esterilizacin por calor. El calor acta desnaturalizando (coagulando) las
protenas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta accin se ve disminuida por la presencia
de lpidos formando parte de su estructura qumica, que acta protegiendo las uniones peptdicas de
las protenas.
El calor es uno de los agentes fsicos ms usados. Su accin depende de la temperatura alcanzada
y del tiempo de aplicacin. De la consideracin de stos dos aspectos surgen las siguientes
expresiones:
Punto trmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensin bacteriana en 10
minutos (tiempo constante y temperatura variable).
Tiempo trmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensin bacteriana a
una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante).
Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o
esporuladas (de resistencia). Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas
muy altas ya que la mayora se destruye a los 50 y 70C, especialmente las patgenas. Las
bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100C.
Adems de la temperatura y el tiempo de exposicin es importante tener en cuenta la humedad, el
pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace ms efectivo el poder de penetracin
del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de
ebullicin.
FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE
El calor puede ser aplicado para la esterilizacin de tres maneras diferentes:
Calor Seco. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos:
a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se
logra por oxidacin violenta. Este mtodo se utiliza para asas, agujas, flameado de bocas de tubos u
otros recipientes y destruccin de material contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se
alcanzan temperaturas superiores a los 2.500C, por lo que una breve exposicin es suficiente. Sin
embargo, cuando las asas de siembra estn muy cargadas con microorganismos, la aplicacin
directa de la llama provoca la dispersin irregular del contenido de aqullas, con el consiguiente
peligro de la contaminacin. Un sistema alternativo a los mecheros son los incineradores elctricos
bacterianos, en los que el riesgo de contaminacin no existe, ya que la dispersin es recogida en el
tubo del aparato.
b) Incineracin en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los que no
importa su destruccin, como apsitos, cadveres de animales infectados o material plstico
contaminado (RPBI). Se utiliza la combustin directa o el horno crematorio.
c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco, en las que el aire
caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo as el calor a los objetos

que se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidacin de sus estructuras
previa deshidratacin, pudindose llegar a una ligera carbonizacin.
Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180C. El tiempo se
mide desde el momento en que se alcanz la temperatura indicada y est condicionado por la
cantidad de material y su distribucin dentro de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de
penetracin, por esta razn es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros mtodos.
Aplicacin: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio.
Descripcin de la estufa: La estufa de esterilizacin a seco es una caja metlica de paredes triples.
La pared interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre circulacin del
aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser
lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una resistencia elctrica aunque tambin existen
estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la temperatura deseada. En la cara
superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir otro
para la colocacin de un termmetro en caso de no traerlo incorporado. En el interior posee rejillas
metlicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas el material a esterilizar.
Uso: Esterilizacin de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que interese
mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente empaquetado con papel de
estraza o contenido dentro de cajas metlicas, de modo tal que una vez retirado de la estufa,
permanezca estril hasta el momento de ser usado.
Calor Hmedo. El vapor de agua es uno de los mtodos ms eficaces para destruir
microorganismos, es mucho ms eficaz que el calor seco (aire). Hay varias formas de emplear el
calor hmedo.
a) Vapor a presin: Es uno de los mtodos ms utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar
material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos qumicos utilizados
en el laboratorio de microbiologa.
Este mtodo tiene gran poder de penetracin, razn por la cual la esterilizacin se puede llevar a
cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa (calor seco) y est
especialmente recomendado para la eliminacin de formas esporuladas.
Descripcin de la autoclave: El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con
una tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por pestillos o
cerrojos quedando hermticamente cerrado. Adems, posee en la parte superior una llave de vapor
(o espita), un manmetro y una vlvula de seguridad. En el interior de la autoclave se coloca un
volumen de agua que se hace hervir, ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran
en la parte inferior del aparato, o mediante calentadores elctricos de inmersin. Se cierra luego la
tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el aire del interior haya sido desplazado
por el vapor. Debe dejarse que el vapor salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla. Es muy
importante que la eliminacin del aire ya que, de lo contrario, la presin marcada por el manmetro
indicar la temperatura a la que se encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la
esperada para el vapor saturado a esa presin. Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita),
comienza a elevarse la presin en el interior del autoclave; usualmente se fija la vlvula de seguridad
para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 121C.
La presin se mantiene durante unos 20 minutos, no deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta
que el manmetro indique 0 (cero). Si la presin se libera violentamente los lquidos en el interior
del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo an reventar los elementos de vidrio.

Una vez que el manmetro indique que no hay sobrepresin en el interior del aparato, se abre
primero la llave de vapor y luego de algunos minutos se puede levantar la tapa de la autoclave. No
se debe retirar el contenido inmediatamente.
Tiempo requerido: usualmente, para esterilizar medios de cultivo son necesarias temperaturas de
121C durante 15 a 20 minutos.
Limitaciones: en funcin de la termolabilidad de ciertos materiales y componentes de medios de
cultivo. Adems es inadecuado para sustancias que son insolubles en agua, como las grasas, en las
que la penetracin del vapor es muy limitada.
b) Tyndalizacin: Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por Tyndall, que
permite esterilizar, a bajas temperaturas, aquellas sustancias que se alteran a altas temperaturas
como algunos azcares. Se puede realizar a bao Mara o autoclave abierta.
La temperatura utilizada es generalmente de 60-80 C; a esta temperatura se eliminan las formas
vegetativas pero no las esporuladas. Por esta razn es que despus de un perodo de calentamiento
de 30 minutos, se deja el material a 30-37C hasta el da siguiente, y se lo somete nuevamente al
tratamiento inicial. Esta operacin se repite despus de 24 horas (esterilizacin fraccionada).
La discontinuidad de calor- reposo permite a las bacterias desarrollar nuevas clulas vegetativas a
partir de sus esporas, hasta que por ltimo, en el tercer calentamiento, ya no quedarn formas
esporuladas.
c) Pasteurizacin: Debe su nombre a Pasteur quien fue el primero en utilizar este mtodo que
actualmente presenta una serie de modificaciones. Tiene muy poca aplicacin en bacteriologa y es
usada especialmente en leche, ya que destruye la totalidad de los grmenes patgenos y la mayora
de la microbiota asociada, respetando la estructura fsica y composicin qumica de la misma (otros
ejemplos son la nata, bebidas alcohlicas, mosto, etc.).
Consiste en someter el lquido a un calentamiento rpido seguido de un enfriamiento posterior. La
temperatura aplicada es de 63C, durante 30 minutos con lo que se consigue la destruccin de las
formas vegetativas, excepto las termfilas. Existe una pasteurizacin denominada alta o instantnea,
en las que mantienen delgadas pelculas de leche vaporizada sobre tubos o placas a 71C, con lo
que se requiere una exposicin de slo quince segundos.

2.4.2.1.2 Filtracin.
Las bacterias pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es lenta y cara (debe
usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos termolbiles, que no
se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden esterilizar por
filtracin, si previamente se disuelven en un lquido. Tcnicamente, la filtracin no esteriliza porque
los virus pueden pasar a travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los
estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.
Filtros de membrana. Estas membranas estn compuestas de nitrocelulosa, con un poro de
dimetro constante. La nitrocelulosa es un derivado qumico de la celulosa, El dimetro de poro es
aproximadamente de 0,45 a 4.0 m; este tamao es lo suficientemente pequeo como para eliminar
todos los microorganismos, con excepcin de los virus y algunas bacterias muy pequeas. Un lquido
se filtra hacindolo pasar a travs de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para
hacer pasar el lquido por el filtro se utiliza una bomba de vaco; los microorganismos quedan en la
superficie de la membrana. La filtracin es el mtodo de eleccin para esterilizar soluciones de
vitaminas, antibiticos v otros compuestos termolbiles, que son aadidos a los medios.

Filtros HEPA: Son filtros de vidrio empleados para esterilizar el aire que penetra en habitaciones
especiales como quirfanos, etc. Tambin se emplean en cmaras de flujo laminar aparatos con
forma cbica (urna). Tienen una superficie donde se hacen las operaciones microbiolgicas. El aire
que penetra en la cmara pasa por los filtros HEPA, de manera que la superficie queda estril.

2.4.2.1.3 Radiaciones.
Se denominan tambin esterilizacin fra. Se usa con material sensible al calor, ya que no produce
calentamiento del material.
Radiaciones no ionizantes: Luz UV, muta el DNA (dmeros de timina), tiene bajo poder de
penetracin, se usa en superficies o ambientes como quirfanos o plantas de envasados.
Radiaciones ionizantes: Son los rayos X y los rayos gamma, tienen mucha energa y poder de
penetracin. Inducen la ionizacin de molculas celulares tanto de organismos eucariotas como
procariotas, provocando la muerte celular. Forman radicales hidroxilo y perxidos que oxidan
cualquier material daando al ADN.
Los rayos X no se suelen utilizar porque son caros, pero s los rayos gamma, y se obtienen
fcilmente a partir del cobalto ( 60Co). Se emplean en procesos de enlatado y esterilizacin de
material quirrgico (bistur, gasas...) Esto requiere altas medidas de seguridad deben practicarse en
zonas especiales y las personas que los realicen deben ir protegidas.

2.4.2.2 Mtodos Qumicos.

Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. En comparacin con los
procedimientos fsicos, estos mtodos tienen una importancia secundaria. Los antispticos son
considerados venenos protoplasmticos que, al actuar sobre los grmenes, los destruyen. Algunos
de ellos ejercen su accin nociva sobre todas las clulas, por lo cual se les considera venenos
generales, por el contrario otros actan sobre algunas especies bacterianas, mostrndose como
venenos especficos. Estos mtodos son ptimos para la asepsia de las manos del operador, de
locales, de mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir grmenes que puedan
contaminar el lugar de trabajo. Estos se pueden utilizar ya sea en forma de gas o lquidos.
Dentro de los compuestos qumicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y
antispticos.
La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan.

Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma

concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que
no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El aumento de pH por
encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentracin
del agente sobre la clula. El pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente
qumico, pues a menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad.

ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES DE USO COMN EN HOSPITALES Y/O CENTROS

ASISTENCIALES
Recordar:
1. Al utilizar cualquiera de stos productos se debe tener en cuenta que la piel del paciente
puede ser sensible a ellos.
2. Es conveniente que el antisptico de eleccin sea el mismo en todas las reas geogrficas
del hospital. Su uso debe estar previamente determinado, excepto reas especiales donde el
espectro del antisptico que se elige debe ser amplio para eliminar el mayor nmero posible
de grmenes, tambin se tendr en cuenta que no dae las manos del personal.
3. Los antispticos deben, una vez que llegan a los distintos servicios, fraccionarse en frascos
pequeos, opacos y con tapa. El antisptico que se coloca en estos frascos debe recambiarse
diariamente, previo lavado y escurrido del frasco antes de proceder a su rellenado.
4. El alcohol al 70% puede colocarse en frascos comunes de vidrio blanco, pero stos
debern tener tapa hermtica.
5. Es importante mantener tapados los antispticos ya que, por ejemplo, en el alcohol yodado,
puede alterarse la concentracin de cualquiera de sus componentes por evaporacin.
6. La Iodopovodona jabonosa puede reemplazarse por gluconato de clorhexidina (Hibiscrub
M.R.) segn la evaluacin que, en determinadas situaciones, realice la institucin.
IODO-POVIDONA: (Pervinox M.R.) (Fada M.R.).
Es un iodforo que resulta de la combinacin de iodo con un agente solubilizador (PVP o povidona)
que mantiene la eficacia germicida del iodo y resulta en un antisptico relativamente libre de
toxicidad e irritacin.
Est disponible en forma de solucin jabonosa y como solucin tpica. Esta forma de iodo no irrita ni
mancha y ha sido ampliamente aceptada en los ltimos aos para una gran variedad de aplicaciones
preventivas, de limpieza (solucin jabonosa para lavado de manos y bao previo prequirrgico) y
teraputicas, incluyendo su uso en curacin de heridas.
La ms comnmente empleada es la solucin al 10%. Hay otros compuestos que estn sometidos a
investigacin. Se cree que es microbicida, no meramente bactericida, lo que significa que adems de
las bacterias Gram (+) y Gram (-), eliminan virus, hongos, protozoos y levaduras. Se recomienda
usarla sin diluir.
GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 4% (Hibiscrub M.R., Butyl M.R.).
Es un agente bactericida tpico eficaz contra grmenes Gram (+) y Gram (-), pero de mayor eficacia
sobre los primeros. Es tambin efectivo contra hongos y virus, pero su accin es muy baja sobre el
Mycobacterium tuberculosis.

Presentacin: Clorhexidina jabonosa y Clorhexidina alcohlica (no est en el mercado comn). Se

recomienda para: Bao del paciente (preferentemente no en cama ya que mancha las sbanas) y
para el lavado de manos. La ventaja de ste antisptico es una importante accin residual sobre la
piel (entre 3 y 6 horas).
No se lo debe usar para desinfeccin de elementos o superficies, puesto que se inactiva en
presencia de materia orgnica y materiales como corcho, algodn o goma.
HEXACLOROFENO (FISOHEX M.R.).
Es un agente bacteriosttico ms eficaz contra los grmenes Gram (+) que contra los Gram (-),
especialmente los estafilococos. Las materias orgnicas interfieren en su accin. Aunque una sola
aplicacin apenas modifica la flora cutnea, tiene efectos, acumulativos. Por lo tanto, puede usarse
en duchas preoperatorias durante dos a cuatro das.
Cuando se ingiere o absorbe a travs de una grieta en la piel o membranas mucosas (o incluso a
travs de piel intacta de algunos nios), el hexaclorofeno provoca una neurotoxicidad potencialmente
cuando existen erupciones cutneas, quemaduras o heridas abiertas. Se lo considera como a otros
fenlicos, como desinfectante de nivel intermedio o bajo. Puede usarse en materiales no crticos y
limpieza del ambiente hospitalario.
PERXIDO DE HIDROGENO (Agua oxigenada).
Ha sido empleado durante aos para promover la limpieza de las heridas. Tiene un dbil efecto
germicida y fcilmente se degrada a oxgeno molecular y agua. Es muy importante su estabilidad, (610%), lo que es muy difcil de garantizar en nuestros mercados en relacin al tiempo de
almacenamiento. Su accin es mecnica, las burbujas de oxgeno desprenden tejido muerto y las
bolsas de bacterias ayudan a eliminarlas de la herida. Tiene inconvenientes, puede crear ampollas
llenas de aire en los nuevos epitelios, separndolos del tejido subyacente. Por consiguiente, el
perxido de hidrgeno no debe utilizarse cuando la herida est adecuadamente cicatrizada y se est
formando epitelio nuevo. Tras su aplicacin, debe eliminarse de la herida con solucin fisiolgica.
Tampoco debe emplearse en ciertas heridas profundas ni en la cavidad peritoneal, pues podra
provocar un mbolo gaseoso en los capilares y vasos linfticos.
Se ha demostrado que es bactericida, virucida y fungicida. La inmersin de material limpio en una
solucin estabilizada al 6% proporcionara una desinfeccin de alto nivel en treinta minutos. Su
estabilidad no est garantizada en nuestro medio, por lo que no se la recomienda. Corroe metales
como el cobre, aluminio y zinc. Debe mantenerse al abrigo de la luz.
ALCOHOL.
El alcohol etlico al 96% (etanol) es el que ms comnmente se encuentra en el ambiente
hospitalario. Se recomienda para: Antisepsia de la piel en pacientes alrgicos al Iodo (debe dejarse
actuar entre uno y dos minutos), desinfeccin de termmetros y desinfeccin de endoscopios
fibropticos.
Es eficaz contra la mayora de las bacterias patgenas, pero de accin imprevisible contra los
hongos y virus. Algo ms potente es el alcohol isoproplico al 70% (Isopropanol). Ambos resecan la
piel, lesionan el epitelio nuevo y provocan ardor cuando se aplican sobre heridas abiertas. El
isopropanol tambin provoca vasodilatacin bajo la superficie cutnea, de modo que las punciones
con aguja sangran ms que cuando se utiliza etanol.

El uso de isopropanol al 70% en las manos es un excelente mtodo que reemplazara en situaciones
de emergencia el lavado con soluciones jabonosas, dada su alta eficacia. No tiene accin residual,
pero varios estudios demostraron que es capaz de reducir en un 99,7% la concentracin microbiana
de la piel de las manos.
Actualmente el uso del isopropanol al 70% se recomienda para la sanitizacin de mesas de trabajo y
equipo automatizado de laboratorio y para inactivar en caso de derrame accidental de RPBI.
ALCOHOL IODADO
Es una combinacin de iodo con alcohol al 70%. Se debe utilizar en concentraciones al 2%. Acta
sobre bacterias Gram (+), Gram (-), Mycobacterium tuberculosis y hongos.
Se lo utiliza como antisptico de eleccin para la preparacin de la zona operatoria de la piel.
Debe mantenerse en recipientes opacos y tapados para evitar que por evaporacin se alteren las
concentraciones iniciales con que el producto llega proveniente de la farmacia del hospital.
AMONIOS CUATERNARIOS (Cl. de Benzalconio: Tersotyl M.R.) (DG6 M.R.)
Estos compuestos tuvieron amplio uso desde su inicio como germicida, son buenos agentes de
limpieza, pero actualmente no se recomiendan como antispticos de piel y tejidos, ya que diversos
estudios han documentado que en ellos sobreviven y desarrollan bacterias Gram (-), que han podido
relacionarse con brotes de infecciones hospitalarias. Materiales como el algodn y las gasas
disminuyen su actividad, porque absorben los ingredientes activos.
No se los debe utilizar para la desinfeccin de elementos crticos o semicrticos. Solamente para el
tratamiento de materiales no crticos. No eliminan esporas ni determinados virus, como por ejemplo
el de la Hepatitis B. Debe usarse con cuidado, ya que se ha visto que algunas soluciones permiten el
crecimiento de Pseudomonas sp.
HIPOCLORITO DE SODIO.
El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es
activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de
temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso (HClO) y al Cl 2 que se
forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy
reducida debido a que por su carga no puede penetrar fcilmente en la clula a travs de la
membrana citoplasmtica. En cambio, el cido hipocloroso es neutro y penetra fcilmente en la
clula, mientras que el Cl2 ingresa como gas.
El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo), a pH
alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A
causa de sto, es que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH
ligeramente cido), con el objeto de obtener cido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones
con una concentracin del 0.1-0.5% de Cloro activo.
FORMALDEHDO

Inactiva microorganismos a travs de la alcalinizacin de las protenas. Se presenta en

concentraciones del 40%. La solucin acuosa es bactericida, fungicida, esporicida y viricida.
Segn su dilucin actuar como esterilizante, luego de un tiempo prolongado o como desinfectante
de alto nivel. Se lo utiliza para la inactivacin de bacterias en los sistemas de distribucin de agua
tratada de los servicios de Hemodilisis.
Los vapores de formaldehdo tienen efectos txicos e irritantes, por lo que es necesaria la utilizacin
de elementos protectores durante su manipulacin. (Mscaras respiratorias, protectores oculares,
guantes resistentes y delantales impermeables). El ambiente de trabajo debe contar con un
adecuado sistema de recambio de aire. Concentraciones ambientales de 2 p.p.m. han ocasionado
efectos txicos.
Las pastillas de formalina no deben utilizarse en cajas de instrumental, guantes, etc. Su accin
germicida solo se produce en la vaporizacin por calor. Actualmente se desaconseja su uso en
quirfanos o habitaciones de pacientes, por ser no solo un procedimiento riesgoso (efecto
carcinognico) sino tambin ineficaz.
Por las razones expuestas, su uso queda limitado a los servicios de Hemodilisis.
OXIDO DE ETILENO.
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Sirve para
esterilizar material termosensibles como el plstico, equipos electrnicos, bombas
cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems
cancergeno.

2.4.3 Controles de esterilizacin.

Existen dispositivos de distinta naturaleza que sirven como indicadores de la calidad de la
esterilizacin realizada. Los ms simples son productos qumicos que cambian de color a 121C. Se
comercializan dentro de sobres, o en la superficie de cintas.
Se utilizan tambin monitores biolgicos como controles de esterilizacin. Consisten en
determinados microorganismos con una tolerancia conocida al mtodo que se est empleando.
Las esporas de Bacillus stearotermophilus, por ejemplo, tienen una tolerancia conocida al calor
hmedo. Se colocan ampollas con suspensin bacteriana o tiras impregnadas con esporas en
lugares estratgicos en el interior del autoclave. Como regla general, los portadores de esporas
deben colocarse en el centro del paquete de mayor carga, o en aquellos lugares dentro de la carga
con posibilidades de no alcanzar la temperatura de esterilizacin.
Cuando se abren los paquetes o recipientes luego de ser esterilizados, la ampolla con su contenido o
la tira aspticamente colocada en un caldo de cultivo, se incuban durante 24 a
48 horas. Si la esterilizacin fue eficiente no deber haber desarrollo en estos cultivos.

Asimismo existen otros monitores biolgicos para esterilizacin con calor seco, irradiacin con rayos
gamma, xido de etileno etc., eligiendo las especies bacterianas a utilizar segn su susceptibilidad
conocida para cada procedimiento.
Algunas autoclaves modernas estn equipadas con termmetros que producen un registro continuo
y permanente de las temperaturas en el interior del aparato.

2.5 Mtodos de aislamiento y recuento bacteriano.

El segundo paso para aislar un microorganismo patgeno de una muestra biolgica es inocular o
introducir en un medio solido o lquido, esterilizado previamente, la muestra analizada con el fin de
promover el crecimiento de las bacterias facilitando su identificacin. De esta manera, aislamos un
solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est
constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es
un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.
2.5.1. Mtodos de aislamiento.
Para el aislamiento de bacterias se cuenta con varios mtodos los ms utilizados son: el mtodo de
la estra cruzada y el mtodo de las diluciones.
El mtodo de aislamiento por estra cruzada en placa. Es el mtodo ms fcil y el ms usado
para obtener colonias individuales. Para ello, con un asa de siembra se toma una cantidad
representativa de la muestra (Inoculo) y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un
medio slido preparado en una placas o cajas Petr (a las placas Petri tambin se les denomina
simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van
depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se
toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma
tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra
separar clulas individuales.

El mtodo de las diluciones. Este mtodo consiste en realizar una serie de diluciones decimales de
las cuales se toman alcuotas que se siembran en medios de cultivo slido en placas o cajas Petr,
ya sea mediante la tcnica de vertido en placa o por dispersin con la esptula de Drigalsky .
El mtodo de las diluciones nos permite determinar las UFC/mL, presentes en la muestra por analizada.

2.5.2 Mtodo de siembra.

Vertido en placa. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y se vierten en la placa o caja Petr. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras
crecern en la superficie.
Espatulado. Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar,
extendindolas con ayuda de una esptula de Drigalsky de cristal estril. La suspensin se absorbe
en el agar, dejando las colonias microbianas sobre la superficie.

Picadura: El medio de cultivo que se emplea semislido en tubo y la siembra se realiza con asa
recta, la que se introduce con el inculo rpidamente en el seno del medio y se retira de la
misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio.

Picadura y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se
introduce el asa recta en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un
trazo o estra en el pico de flauta.

2.6 Morfologa colonial.

Las colonias aisladas presentan caractersticas morfolgicas diferentes debido a que cada grupo
filogentico de bacterias tienen caractersticas peculiares que se ven influidas por las condiciones del
medio. Una colonia se desarrolla en un medio slido y procede de una sola bacteria o espora y
conforma una agrupacin de organismos de la misma especie. Por definicin un buen aislamiento en
placa es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permite distinguir y describir la
morfologa colonial que incluye:
Tamao. Se describe en milmetros y puede variar desde colonias extremadamente pequeas o
puntiformes hasta aquellas que llegan a medir 10 mm o ms.
Color. Las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propios o absorcin de algunas
sustancias del medio.
Forma. Pueden ser puntiformes, circulares o irregulares. Las colonias puntiformes son tan pequeas
que no pueden distinguir el resto de sus caractersticas.
Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos, proyecciones como
dientes de sierra o enrollados.
Elevacin. Las colonia puede ser plana o elevada, est ltima a su vez puede ser convexa,
pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada.
Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular.
Aspecto. Puede ser hmedo o seco.
Luz reflejada. Puede ser brillante o mate.

Luz transmitida. Puede ser transparente, translcida u opaca.

Produccin de pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua que puede difundir
al medio.
Consistencia. Dura o suave, esta ltima puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta caracterstica se
determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto de ser la ultima en describirse.
Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles alrededor de
la colonia, como la hemolisis en la gelosa sangre, acidificacin que se manifiesta con un indicador de
pH incorporado al medio de cultivo.
Con al experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa colonial vienen a
constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales grupos de bacterias y tambin
permite corroborar en muchos casos la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible
contaminacin La certeza de tener un cultivo puro as como el reconocimiento de un cultivo mixto o
impuro permite la caracterizacin e identificacin correcta de un microorganismo patgeno.

Bibliografa
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Microbiologia medica;PRATS, GUILLEM; Mcgraw hill/ intera (medicina) 2004
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