Prácticas Microbiología MEHU-UPAO

3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS:
Identificar los requerimientos nutritivos que tienen los microorganismos.
Definir que son los medios de cultivo, y los diferentes tipos que existen.
Aprender a preparar, esterilizar y almacenar los distintos tipos de medios de cultivo.

INTRODUCCIÓN:
Las tendencias actuales en microbiología clínica apuntan al desarrollo de métodos rápidos de
diagnóstico para determinar la presencia de agentes infecciosos; sin embargo, el aislamiento y la
identificación de patógenos viables son técnicas irremplazables para el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas.

De forma común, los microorganismos se encuentran en el medio ambiente y en el organismo

cuando causan enfermedades formando algunas veces poblaciones mixtas, de este modo, tenemos
que para poder estudiar a un microorganismo o identificarlo en el laboratorio poder separarlo de otros
o del organismo, y mantenerlo viable, a esto se llama un cultivo puro o axénico, es decir, una
población de microorganismos de la misma especie.

Para recrear las condiciones en las que el microorganismo sea capaz de sobrevivir y multiplicarse,
se usan los medios de cultivo. Un medio de cultivo es una solución equilibrada de todos los nutrientes
y factores de crecimiento necesarios para el desarrollo y la multiplicación de los microorganismos en
el laboratorio. El objetivo es aislar a las diversas especies, proceder a identificarlas o llevar a cabo
estudios complementarios.

Los gérmenes poseen una gran diversidad metabólica; existen aquellos que pueden crecer en
cualquier medio de cultivo; otros necesitan medios especiales y, por último, algunos no crecen en
los medios hasta ahora desarrollados, en síntesis, no existe un medio universal para la diversidad
de microorganismos.

Las siguientes son condiciones básicas que debe reunir un medio de cultivo:

➢ Contener nutrientes adecuados.

➢ Poseer humedad suficiente.
➢ Tener un pH ajustado.
➢ Estar estéril inicialmente.

En el comercio especializado, existe una gran variedad de medios disponibles para el cultivo de
microorganismos en el laboratorio; traen ya sus componentes previamente mezclados,
deshidratados o liofilizados y sólo necesitan la adición de agua para su preparación, es más en su
etiqueta se explica la forma de preparación de estos, así como cada uno de sus componentes.

Constituyentes habituales de los medios de cultivo

Agua, componente básico y universal para la vida, se utiliza para disolver los demás componentes.
Generalmente se emplea agua destilada o desionizada.

Extractos, pulverizados de órganos o de tejidos animales y vegetales (p.e. cerebro, carne, semillas,
etc.) brindan glúcidos, compuestos nitrogenados, vitaminas hidrosolubles, compuestos azufrados y
sales.
Peptonas, obtenidas como producto de la digestión de sustancias proteicas y sirve como fuente de
C, N y energía.

Glúcidos (Carbohidratos), por medio de su degradación enzimática los glúcidos otorgan energía,
oxígeno, hidrógeno y carbono a los microorganismos. El más utilizado es la glucosa, pero también
se emplean otros.

Cloruro de sodio (Sal), no es imprescindible pero su adición regula las propiedades osmóticas del
medio.

Líquidos corporales, a menudo se añaden a los medios de cultivo sangre entera, plasma o suero
sanguíneo estériles, tanto de origen humano como animal; estos líquidos a portan factores de
crecimiento esenciales.

Sistemas amortiguadores, consisten en sales, como fosfatos bisódicos o bipotásicos, que son
incorporados a los medios de cultivo para mantener el pH dentro del espectro de crecimiento
microbiano y como fuente de fósforo.

Indicadores de pH, se incorporan a los medios de cultivo para dar prueba visual de las variaciones
de pH.

Agentes reductores, se agregan para crear atmósferas óptimas para el crecimiento de gérmenes
Microaerófilos, anaerobios facultativos y estrictos. Como ejemplo, podemos citar la cisteína y el
tioglicolato de sodio.

Agentes selectivos (inhibidores), el cristal violeta, las sales biliares, el telurito de potasio, los
antibióticos, etc., agregados al medio lo pueden convertir en selectivo para determinados
microorganismos.

Agar agar, agregado al 1 – 2% otorga solidez a los medios de cultivo; se obtiene de ciertas algas
rojas marinas como Gelidium sp., Euchema sp., y Gracilaria sp. y no es nutriente, es un polímero de
galactosas, que tiene la propiedad de que al calentarse y luego enfriarse se vuelve gelatinoso, y
resulta resistente a la hidrólisis microbiana. El agar es insoluble en agua fría, funde entre los 80 y
100° C, y se mantiene en este estado hasta los 45° C, temperatura por debajo de la cual comienza
a solidificar.

Clasificaciones de los medios de cultivo

➢ POR SU ESTADO:

Líquidos: denominados comúnmente “caldos”, están constituidos por nutrientes en solución

acuosa y son semejante a un caldo casero filtrado y esterilizado. No contienen agar agar. Por lo
general se utilizan para mantenimiento y reconstitución de microorganismos además de algunas
pruebas bioquímicas. Como ejemplo tenemos al Caldo nutritivo, infusión cerebro corazón (BHI),
caldo tripticasa soya (TSB) entre otros.

Sólidos: denominados comúnmente “agares”, se obtienen añadiendo a un medio líquido, el

gelificante agar agar entre 1.5 a 2.0 %. Para su manipulación en el laboratorio estos medios
deben colocarse en placas de Petri o tubos de ensayo. En estos últimos, el medio de cultivo
puede dejarse solidificar en forma inclinada para generar una mayor superficie de siembra (“agar
inclinado o pico de flauta o slant”) o dejarse enfriar con el tubo en posición vertical (“agar
columna”). Los medios sólidos (agar sangre, agar BHI, Agar tripticasa soya [TSA] entre otros) se
utilizan para aislar e individualizar los distintos tipos de microorganismos presentes en una
muestra.
Semisólidos: son medios de cultivos líquidos con el agregado de agar al 0.3 o 0.5% (por
ejemplo, agar blando, medio SIM). Pueden utilizarse para determinar la motilidad de los
gérmenes.

Figura 3.1. Medios de cultivo según su estado

➢ POR SU ORIGEN:

Medios naturales: se obtienen a partir de sustancias naturales animales o vegetales (por

ejemplo, suero, leche, papa, etc.); su composición no es rigurosamente constante.

Medios sintéticos o artificiales: aquello cuyos componentes están químicamente definidos y

contienen nutrientes que permiten el desarrollo de la mayoría de microorganismos no exigentes
sin ofrecerle ventajas especiales a ninguno, ejemplo, agar nutritivo.

Medios semisintéticos o complejos: se obtienen cuando a los medios sintéticos se les

agregan factores de crecimiento, tales como extracto de levadura, de carne o de vegetales, su
composición química no se conoce con exactitud, pues varía ligeramente de un lote a otro. Se
utilizan para la mayoría de microorganismos heterótrofos, por ejemplo, agar y caldo BHI.

➢ POR SU UTILIDAD:

Medios generales o comunes: contienen sustancias nutritivas mínimas para el crecimiento de

una gran variedad de microorganismos metabólicamente no exigentes.

Medios enriquecidos: para microorganismos exigentes a los cuales favorecen en su

crecimiento, puesto que poseen los requerimientos nutritivos que setos requieren e inhiben
parcialmente al resto de los gérmenes. Generalmente, llevan el agregado de suero, líquido
ascítico, sangre, glucosa o factores esenciales (por ejemplo, agar sangre para estreptococos y
agar chocolate para neiserias).
Medios selectivos: permiten el crecimiento de determinado tipo de microorganismos, mientras
que inhiben el desarrollo de la microbiota acompañante en la muestra a estudiar. La selectividad
se logra, a) por el agregado de compuestos químicos como inhibidores, colorantes, antibióticos,
etc., por ejemplo, al medio SS agar (verde brillante y sales biliares) para el desarrollo de
Salmonella – Shigella, el medio Sabouraud (con cloranfenicol) para el aislamiento de hongos; b)
por ajustes de pH, como por ejemplo el medio rogosa con un pH 5.4 para favorecer el crecimiento
de lactobacilos; y c) por ajuste osmótico empleando medios de cultivo con alto contenido de
cloruro de sodio, como por ejemplo en el agar manitol salado que se utiliza para el aislamiento y
la identificación de estafilococos.

Medios diferenciales: son aquellos que permiten la diferenciación de colonias de

microrganismos semejantes, sobre todo en base a una propiedad bioquímica del germen
desarrollado. Por ejemplo, los medios que contienen un azúcar y un colorante (como indicador
de pH), si el microorganismo es capaz de fermentar el azúcar, produce ácidos, con el
consiguiente viraje de color del indicador. Un ejemplo es el medio base rojo de fenol para
identificar distintas especies de estreptococos.

Los medios selectivos y diferenciales son precisos para aislar un microorganismo a partir de una
muestra clínica, generalmente son mixtos, selectivo-diferenciales, como por ejemplo el agar Mac
Conkey para gramnegativos ya que no solo posee inhibidores como el cristal violeta y sales
biliares para inhibir la microbiota grampositiva acompañante (selectivo), sino que la lactosa
(azúcar) lo transforma en diferencial.

Medios de transporte: son medios que aseguran la viabilidad de los microorganismos desde el
momento de la toma de la muestra hasta su procesamiento en el laboratorio. Son poco nutritivos
líquidos o semisólidos que no potencian el crecimiento microbiano. Como ejemplo tenemos al
medio tioglicolato, Cary Blair, Stuart, entre otros.

CULTIVOS ANAERÓBICOS

Para el cultivo de las bacterias anaerobias deben utilizarse técnicas de siembra que no son muy
diferentes de las convencionales, pero existe una diferencia básica: todo el proceso debe
efectuarse en ausencia de oxígeno, desde la selección, recolección y transporte adecuado de
las muestras clínicas hasta los cultivos, ya que estos microorganismos pueden morir si son
expuestos al oxígeno.

Figura 3.2. Cultivo en medio tioglicolato (cultivos anaeróbicos)

Las siembras deben realizarse de inmediato, en medios frescos o prerreducidos. Otros métodos
de cultivo en anaerobiosis consisten en la siembra en profundidad en placa y la siembra en tubo
con medio sólido o con medio líquido cubierto con una capa de vaselina para evitar el acceso de
oxígeno o la siembra en medios esterilizados en forma aerobia prerreducidos.

Figura 3.3. Esquema de Jarra Gaspak

Si se desea condiciones de anaerobiosis más estrictas que las anteriores, para la incubación de
bacterias anaerobias asociadas con enfermedades humanas existen diferentes sistemas, como,
por ejemplo: jarra de evacuación-reemplazo, jarras anaerobias con generador de gas
desechable, cámaras anaerobias.

En las jarras de evacuación reemplazo el aire es eliminado y reemplazado con una mezcla de
85% de nitrógeno, 10% de hidrógeno y 5% de CO 2. Son más económicas que las generadoras
de gas y permiten que la anaerobiosis se establezca rápidamente, por ejemplo, se utilizan para
cultivar Helicobacter pylori.

Las bacterias que requieren concentraciones de CO 2 distintas a la atmosférica, llamadas

capnófilas, pueden incubarse con un simple frasco con vela. Las placas y los tubos sembrados
se colocan en el frasco, se enciende la vela y se cierra. La vela reduce la concentración de
oxígeno hasta un punto en que la llama se apaga. Esto proporciona una atmósfera con una
concentración cercana al 3% de CO2.
 Figura 3.4. Alternativa para generar anaerobiosis

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Materiales:
o Frasco de medio BHI
o Frasco de Agar nutritivo
o Frasco de Agar Mac Conkey
o Frasco de medio TSI (alternativo)
o Placas de Petri
o Tubos de ensayo 13 x 100
o Matraces Erlenmeyer de 500 mL y 1000 mL
o Balanza de triple brazo o de precisión
o Agitador magnético
o Autoclave
o Papel metálico
o Probeta de 200 mL
o Probeta de 500 mL
o Beaker de 500 mL
o Horno microondas
o Espátulas
o Agua destilada o deionizada

Procedimientos:
Preparación de medios de cultivo (preparación de 200 mL de medio por mesa)
✓ Pesar el polvo del medio de cultivo deshidratado según indica la etiqueta del medio
respectivo.
✓ Medir en la probeta 200 mL de agua destilada.
✓ Verter ambos en un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
✓ Calentar hasta disolución completa en agitador magnético si lo hubiese.
✓ Esterilizar en autoclave a 121° C 15 lb de presión por 15 minutos.
 ✓ Enfriar los medios preparados
✓ Servir los medios de cultivo en placas de Petri o en tubos de ensayo 13 x 100 según
corresponda.

Figura 3.5. Esquemas de preparación de medios de cultivo

Referencias bibliográficas:
Madigan MT, Martinko JM, Bender KS, Buckley DH, Stahl DA. Brock, Biología de los
microorganismos. 14va. ed. Madrid: Pearson; 2015.

Negroni M. Microbiología estomatológica, fundamentos y guía práctica. 2 a ed. Edit. Médica

Panamericana: Buenos Aires; 2009.