Medios de cultivo

González Naal Valeria de Jesús

Moo Poot Faustino Eliezer
Valencia Martín Mariana
Medio de cultivo
Es un conjunto de
componentes (sustrato o una
solución de nutrientes) que
crean las condiciones
necesarias y favorables de pH,
humedad y temperatura para
el desarrollo de los virus,
microorganismos, células,
tejidos vegetales o incluso
pequeñas plantas.
Son esenciales en el
laboratorio de
Microbiología por lo que un
control en su fabricación,
preparación, conservación
y uso, asegura la exactitud,
confiabilidad y
reproducibilidad de los
resultados obtenidos.
Condiciones generales
El desarrollo adecuado de microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por
una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio.

Disponibilidad de nutrientes adecuados

Consistencia adecuada al medio
Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases
Condiciones adecuadas de humedad
Luz ambiental y temperatura
pH
Esterilidad del medio
Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado contiene como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre,
fósforo y sales inorgánicas, vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento;
sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones químicas que tengan lugar.
La forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona
que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbono.
Consistencia adecuada al medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado
semisólido.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad,
su inconveniente es que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente
sino a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante.
Presencia o ausencia de oxígeno y otros
gases
▪ Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal.
▪ Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos.
▪ Los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en
una atmósfera sin oxígeno ambiental.
▪ Los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios
facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas
condiciones.
Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los
cultivos.
Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de
cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el
medio.
Luz ambiental y temperatura
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en
presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y
43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos
crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC.
pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar
que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento
bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos
normales.
Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios.
El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor
de agua a presión como agente esterilizante).
CONSTITUYENTES HABITUALES DE
LOS MEDIOS DE CULTIVO
 Fluidos
corporales Sistemas
Peptonas amortigua-d
ores

Indicadores
Extractos
de pH

Constituyentes Agentes
Agar habituales selectivos
Agar
Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
Se obtiene de ciertas algas marinas y presenta la ventaja de que, a excepción de
algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente.
Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los
40ºC, dependiendo de su grado de pureza.
Extractos
Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos
animales o vegetales (p.ej. carne, hígado, cerebro,
semillas, etc.) son extraídos con agua y calor y
posteriormente concentrados hasta la forma final de
pasta o polvo.
Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura
y el de malta.
Peptonas
Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y sales minerales, que
se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja
caseína carne, etc.).
Las peptonas son muy ricas en pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en
determinadas vitaminas y sales minerales.
Fluidos corporales
Sustancias como sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, se
añaden para conseguir el primer aislamiento a partir del hospedador.
Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que también
aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores
Mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano.
Debido a que la mayoría de las bacterias son neutrófilas, se suelen emplear sales del
tipo de los fosfatos bisódicos ó bipotásicos u otras sustancias como las peptonas para
prevenir la desviación del pH.
Indicadores pH
Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido a fermentaciones u otros
procesos, se hace necesario a veces añadir indicadores ácido-base que nos lo indiquen.
Agentes reductores
Se añaden con el objetivo de crear en los medios de cultivo condiciones que permitan
el
desarrollo de los gérmenes microaerófilos ó anaerobios.
Los más empleados: la cisteína y el tioglicolato.
TIPOS DE MEDIO DE
CULTIVO
Origen
Naturales o indefinidos Son los preparados a partir de sustancias naturales
de origen animal o vegetal, como extractos de
tejidos o infusiones y cuya composición química no
se conoce exactamente.
Sintéticos o definidos Contienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles. (ej. Medio de Koser).
Semisintéticos Son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico
complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
Consistencia
Líquidos Se denominan caldos y contienen los nutrientes en
solución acuosa. Ej. Agua de peptona.
Sólidos Se preparan añadiendo el agente solidificante
(generalmente agar al 1,5-2%). Ej. Agar de triptona y
soja.
Semisólidos Contienen 7,5 g de agar/litro de caldo. Se utilizan para
determinar la motilidad de las especies en estudio. Ej.
Agar de Hugh-Leiffson.
Medios semi sólidos

Medios sólidos
Utilidad
Comunes o universales Su finalidad es el crecimiento de gran número de
microorganismos, pero no de los que requieren nutrientes
particulares. Es el medio más frecuentemente utilizado para
mantener colonias microbianas. Ej. Agua de peptona.

Enriquecimiento Utiliza un medio selectivo líquido para permitir el desarrollo de un

microorganismo a partir de una muestra que contiene una gran
variedad de microorganismos. Así, aquellos microorganismos para los
que el ambiente sea más favorable crecerán más que los otros y
finalmente serán predominantes. Ej. medio de Muller – Kauffman.

Selectivos Sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e

inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar
microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Ej: Agar
salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos
estafilococos).
Medio selectivo
Diferenciales Permiten distinguir entre varios géneros y especies de
microorganismos. La separación se basa en la diferencia de color
de las colonias aisladas. Ej. agar con azul de metileno - eosina
que permite diferenciar E. Coli de Enterobacter aerogenes.
Transporte Emplean para el transporte de muestras sin alterar la viabilidad y la
proporción de microorganismos. Tienen consistencia semisólida, con
amortiguador de pH y reducidos en nutrientes.
Caldo BHl (infusión cerebro-corazón)

Se ha utilizado como medio base para las

nuevas fórmulas de medios de cultivo cuando
se suplementa con sangre o agentes
selectivos.

Sin suplemento se recomienda como medio

universal para bacteriología aerobia y para la
recuperación primaria de hongos y
Actinomycetales a partir de muestras
Es un medio de cultivo nutritivo tamponado, que contiene infusiones de tejidos de
cerebro y corazón además de peptonas, que suministran proteínas y otros nutrientes
necesarios para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes y no
exigentes.

Incubar las placas:

● Candida y bacterias: 24-48hrs, 35-37°

● Trichophyton: máximo 5 días, 25-30°

● Medio de cultivo deshidratado: color beige, homogéneo, libre deslizamiento

● Medio de cultivo preparado: color ámbar claro
● Suplementado con sangre: color rojo
Agar Nutritivo
Es un medio de cultivo usado normalmente como rutina
para todo tipo de bacteria.

Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas

altas temperaturas. El crecimiento bacteriano en este
agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen
mejor las colonias pequeñas.

En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido,

y aparece como una sustancia espesa, con colonias
difícilmente observables.
● Extracto de carne bovina: contiene sustancias
solubles en agua (carbohidratos, vitaminas,
compuestos de nitrógeno orgánicos y sales) Pluripeptona 5g

● Peptonas: fuente principal de nitrógeno orgánico Extracto de

3g
carne
(aminoácidos y péptidos de cadena larga)
NaCl 8g
● Agar: agente solidificante.
Agar 15g

Proporciona los nutrientes necesarios para la pH casi neutro (6.8) a 25 °C.

multiplicación de un amplio número de microorganismos
que no son necesariamente exigentes.
Agar sangre
Usos:

● Investigación de tipos de hemólisis (α, ß ó gamma ).

● Crecimiento de estreptococos.

Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo

enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras
sustancias como Columbia o el tripticase de soja.

● Sangre de carnero diluida al 5%.

● Caballo, conejo, humana: Facilitan reacciones hemolíticas o contienen
factores de enriquecimiento o inhibidores del crecimiento de gérmenes.
Agar chocolate:

● Se obtiene calentando la sangre antes

de adicionarla al medio base.
● Contiene hemoglobina: aporta al medio
un importante elemento para el
crecimiento (el factor X o hemina
termoestable)
● Aislamiento de Neisserias (gonococos
y meningococos) y Haemophilus
Agar Mueller-Hinton
Medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana en microorganismos aeróbicos de rápido crecimiento o
anaerobias facultativas como:

Estafilococos, enterococos, miembros de la especie Enterobacteriaceae

y bacilos gram negativos aerobios (Pseudomonas spp)

● alta reproducibilidad
● bajo contenido de substancias inhibidoras
● crecimiento que presenta la mayoría de los patógenos no
fastidiosos
 Infusión de carne + Caseína: fuente de nitrógeno,
vitaminas, carbón y aminoácidos.

Almidón: absorbe cualquier metabolito tóxico

Agar: agente solidificante.

● Medio de cultivo deshidratado: color beige, homogéneo, libre deslizamiento

● Medio de cultivo preparado: color ámbar claro
● Suplementado con sangre: Color rojo cereza
Agar Tripticase de soja (soya tripticaseina)
Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes,
como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy
enriquecido, pero no es diferencial.

● Tripteína + peptona de soya: Nutrientes ricos en péptidos,

aminoácidos libres, bases púricas y pirmídicas, vitaminas y
minerales
● Peptona de soya: Fuente de hidratos de carbono
que estimulan el crecimiento de microorganismos
● NaCl: Balance osmótico
● Agar: Agente solidificante
Agar Levine o EMB (Eosina azul de metileno)
Es un medio utilizado para el aislamiento y
diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos.

El uso de la eosina y del azul de metileno permite la

diferenciación de las colonias fermentadoras de
lactosa de las no fermentadoras.

La sacarosa está incluida en el medio para detectar a

los miembros del grupo coliforme que fermentan más
rápidamente la sacarosa que la lactosa.
 Digerido pancreático
Peptonas: fuente de Nitrógeno de gelatina
10g

Lactosa 5g
Eosina + Azul de metileno: colorantes
Sacarosa 5g
(inhibidores e indicadores)
Fosfato dipotásico 2g

Carbohidratos: fuente de energía Eosina 0.4g

Azul de Metileno 0.065g

Fosfatos: buffer
Agar bacteriológico 15g

Agar: agente solidificante. pH 7.2 ± 0.2

Incubar las placas en condiciones aerobias

● Temperatura: 35 ± 2°C
● Tiempo: 18-24 horas.
Agar Manitol Salado (Mannitol salt agar)
Se trata de un medio altamente selectivo por la alta
concentración salina y diferencial debido a la capacidad de
fermentación del manitol por los microorganismos.

Uso: para la diferenciación de estafilococos positivos a la

coagulasa (Staphylococcus aureus) de los estafilococos
negativos a la coagulasa a partir de:

● Muestras clínicas
● Cosméticos
● Pruebas de límite microbiano
Extracto de carne + Peptona de carne + Tripteína:
fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales
que promueven el desarrollo microbiano.

Manitol: hidrato de carbono fermentable.

NaCl: en alta concentración, es el agente selectivo que

inhibe el desarrollo de la flora acompañante

Rojo fenol: indicador de pH

Agar: agente solidificante

Caldo tioglicolato

Permite el desarrollo de una amplia variedad de

microorganismos, incluidos los nutricionalmente
exigentes.

● Bacterias estrictamente aerobias: crecen en la

parte superior
● Anaerobias facultativas o estrictas: crecen en
las profundidades del medio.
● Caseína + Peptonas de soja + L-cistina: proporciona aminoácidos y sustancias
nitrogenadas (crecimiento bacteriano)
● Extracto de levadura: aporta vitaminas del complejo B
● NaCL: aporta iones esenciales
● Dextrosa: fuente de energía.
● Tioglicolato sódico + Sulfito sódico: acción reductora, mantiene un Eh bajo6.
● Agar: retarda la absorción del oxígeno
● Resazurina: indicador utilizado para detectar los cambios en Eh.
- Eh elevado: color rosa
- Eh bajo: incoloro
Caldo Todd-Hewitt

Uso: crecimiento de estreptococos

beta-hemolíticos para su uso en
pruebas serológicas

● Dextrosa: estimula la producción

de hemolisina
● Fosfato disódico + Carbonato
sódico: acción de tampón para
contrarrestar la acidez de la
fermentación de la dextrosa
Agar MacConkey.
Utilidad:
Este medio esta indicado en el trabajo con
muestras clínicas con flora mixta, a partir de
muestras de origen clínico, aguas residuales y
alimentos.
Composición:
Llevan en su composición sales biliares y cristal
violeta que inhiben el crecimiento de
grampositivos y hongos. Contienen también
Lactosa y rojo neutro como indicador de pH.
Tipo de microorganismos:
Es un medio diferencial y selectivo muy utilizado
para el aislamiento e identificación de
enterobacterias (bacilos gramnegativos).

Características del medio y cultivo:

Su formulación permite la diferenciación de
enterobacterias fermentadoras y no
fermentadoras de lactosa. Las bacterias
fermentadoras de lactosa (lactosa+) acidifican el
medio y adquieren un color rosado (por ejemplo,
E. coli), mientras que las no fermentadoras de
lactosa (lactosa–) aparecen incoloras (por
ejemplo, Salmonella).
 Agar schaedler
Utilidad: Composición: Digerido pancreático de caseína 8,2 g

El Agar Schaedler Sangre de carnero con Vitamina K1, es L-cistina 0,4

un medio altamente nutritivo, no selectivo, para el Digerido péptico de tejido animal 2,5
aislamiento y cultivo de bacterias exigentes estrictamente
anaeróbicas de muestras clínicas. Hemina 0,01
Digerido papaico de harina de soja 1,0
Vitamina K1 0,01
Glucosa 5,8
Tri-hidroximetil-aminometano 3,0
Extracto de levadura 5,0
Agar 13,5
Cloruro sódico 1,7 Sangre de carnero, desfibrinada 5%
Fosfato dipotásico 0,8
Tipo de microorganismos:
se utiliza para el aislamiento no selectivo de
anaerobios y para el aislamiento selectivo de
bacilos anaerobios gram negativos,en especial
las especies Bacteroides y Prevotella y otros
anaerobios gram negativos diversos.
specialmente desarrollado para el crecimiento
de anaerobios estrictos como
Lactobacilus,Streptococcus, Clostridium y
Bacteroides.
Características del cultivo y medio: Después de la
incubación, la mayoría de las placas mostrarán un área
de crecimiento confluente. Dado que el procedimiento
de extensión de la muestra es, de hecho, una técnica
de “dilución”, se depositan cada vez menos
microorganismos en las áreas en que se realiza. Por
consiguiente, una o más de estas áreas presentarán
colonias aisladas de los organismos que contenga la
muestra.
 Agar glucosa de Sabouraud
Utilidad: Composición:
Bacto Neopeptone 5,0 g
Este medio fue desarrollado para el
cultivo de hongos patógenos, Glucosa (dextrosa) 40,0
especialmente de los productores de Agar 19,0
micosis superficiales. En la actualidad se
recomienda sólo para el aislamiento Algunos contienen antibióticos que inhiben a la
mayoría de las bacterias como, por ejemplo,
primario de dermatófitos, con el SGC (Sabouraud gentamicina y cloranfenicol).
agregado de cicloheximida y
cloranfenicol.
Tipo de microorganismos: Es un medio
utilizado para el aislamiento e identificación de
hongos
Características del cultivo y medio: La alta
concentración de glucosa y el pH relativamente
bajo favorecen el crecimiento de hongos,
mientras que numerosas bacterias no toleran la
alta concentración de azúcar y son inhibidas
parcialmente por el bajo pH. Sin embargo, si no
recibe suplemento de antimicrobianos
antibacterianos, el medio presenta una
selectividad solamente débil.
 Agar mitis salivarius
Composición:
Fórmula Litro
Utilidad: se utiliza para diferenciar entre Digerido enzimático de 15 g
caseína
especies de Streptococcus y al género muy
cerca Enterococcus (anteriormente en el Digerido enzimático de tejido 5g
género Streptococcus) que son flora de la animal
boca. Estos organismos son muy comunes
en la boca, y se han asociado con la caries Sacarosa 50 g
dental, así como agentes de endocarditis. Dextrosa 1g
Fosfato dipotásico 4g

Azul de tripán 0.075 g

Cristal violeta 0.0008 g

Agar 15 g
Tipo de microorganismos:
aislamiento de Streptococcus
mitis, Streptococcus salivarius y
enterococos en un entorno de
laboratorio.
Características del cultivo y medio:Los Streptococcus
mutans aparecen en el agar azul como pequeñas colonias
azules de diámetro < 1 mm, mientras que los Lactobacilos
crecen en el agar transparente como colonias blancas. La
comparación con las imágenes correspondientes permite
evaluar el riesgo de caries, siendo de relevancia clínica la
diferenciación de “riesgo de caries alto o bajo”.
Preparación de
medios de cultivo.
Indicaciones generales de su uso
debe realizarse en las condiciones apropiadas indicadas en los botes para conservar
sus propiedades iniciales.
una vez abierto el bote, es necesario mantenerlo cerrado para mantenerlo protegido de
la hidratación.
Si hay algún cambio de la apariencia física, descartar el medio.
se deben revisar las indicaciones de su etiqueta.
 Preparación
❑se debe comprobar que el material que se va a
utilizar está en perfectas condiciones de
limpieza.
❑añadir la cantidad exacta indicada para cada
medio
❑La buena disolución del medio determina la
claridad y efectividad del producto final.
❑Dejar reposar la mezcla durante 5 minutos
ayuda a obtener una suspensión uniforme.
 Ajustes del PH
Para la verificación del pH, se debe medir una muestra extraída del volumen
total del medio preparado a 25ºC

ácido
clorhídric hidróxido
o sódico
 Esterilización
❑Eliminación de microorganismos antes de la inoculación para evitar
falsos resultados.
❑el más utilizado es la esterilización por calor.
❑ seguir las instrucciones de la preparación, Para volúmenes más
grandes, es necesario incrementar el tiempo de esterilización
❑En algunos medios líquidos, el calentamiento puede dar lugar a
perdida de actividad de algunos componentes. En estos casos se
debe esterilizar por filtración.
 Incorporación de los Suplementos
el medio tiene que haberse enfriado a una temperatura de entre
45-50ºC.
Solidos: que no se enfríe en exceso ya que si empieza a solidificar, el
suplemento no podrá homogeneizarse bien en el medio
En el caso de que el suplemento deba ser
reconstituido con agua, se debe usar agua destilada estéril.
 Verter en placas
se debe esperar a que el medio tenga una
temperatura de 45-50ºC.
Antes de verter el medio en placas, se
debe mezclar para la correcta
homogenización.
Las placas se deben dejar enfriar a
temperatura ambiente, en una superficie
horizontal con la tapa de la placa puesta.
Se debe tener la precaución de evitar la
formación de burbujas en la superficie del
agar.
Una vez que las placas estén solidificadas.
Mantener en posición invertida.
 Conservación de los medios
preparados
❑ preparar el medio cuando se va a
emplear.
❑que el medio preparado se mantenga en
refrigeración a 2-8ºC, apartado de la luz.
La refrigeración favorece la
deshidratación del medio.
 Controles de calidad del cliente
Esterilidad: Se debe verificar que el medio
este estéril, incubando una muestra
significativa de las placas preparadas y
dejando incubar a la temperatura indicada
PH Esterilidad para cada medio.

Crecimiento/
Característica
inhibición de
s
microorganis
fisicoquímicas
mos