ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE LA ESPECIE CHLORELLA VULGARIS EN

RESIDUOS DE UNA FERMENTACIN ALCOHLICA A PARTIR DE CAA DE

AZUCAR
Juan David Garca Mahecha
Facultad de Ingeniera y Arquitectura, Universidad Nacional de Colombia

Resumen
En el presente trabajo se mostrara la metodologa experimental para la preparacin y adecuacin
de un inoculo de Chlorella vulgaris para el crecimiento en un medio formulado hecho de vinazas
provenientes de una fermentacin alcohlica. Tambin se realiza el estudio cintico y el ajuste a
alguno de los modelos usados en la literatura, validando cada modelo con los datos
experimentales obtenidos. Se plantean diferentes metodologas experimentales para la
preparacin del inoculo, seguimiento cintico, medicin de azucares reductores, cuantificacin de
lpidos y protenas. Por ltimo se realiza un anlisis de contenido celular de lpidos y protenas
seguido de la comparacin de los resultados obtenidos en funcin del porcentaje de vinaza en
cada medio.

1 Introduccin:
Las microalgas tienen una amplia diversidad y son usadas desde dcadas atrs ya que
proporcionan metabolitos especficos de gran importancia, pigmentos, antioxidantes y
polisacridos. Algunas de las aplicaciones actuales son la produccin de biomasa, suplementos
alimenticios, desarrollo en el tratamiento de aguas, fijacin del CO
2
producido a nivel industrial y
un alto potencial en el sector energtico. El cultivo de micro algas se ha llevado a cabo en diversas
formas dependiendo de su aplicacin industrial, algunas de ellas son el cultivo en
fotobioreactores cerrados, tanques abiertos y piscinas de algas [1].
El crecimiento heterotrfico y mixotrofico de la C. vulgaris viene siendo objeto de estudio para la
produccin industrial de las mismas, esto se debe al alto contenido de aceite en las clulas y el
rpido crecimiento al realizar el cultivo por estas dos vas. El mayor inconveniente que se presenta
en estos medios de cultivo es el costo que se genera al usar la glucosa o el acetato como fuentes
de carbono para las micro algas, adems de diversos nutrientes adicionales que corresponden en
total al 80% del costo total del cultivo [2]. Es por este motivo que se propone realizar el
crecimiento de la C. vulgaris en los residuos generados en una fermentacin alcohlica, en este
caso se propone el uso de residuos de la fermentacin de caa de azcar; en estos residuos es
posible encontrar una concentracin adecuada de glucosa, fosfatos y nitratos necesarios para
realizar el crecimiento de las micro algas.
1.2 Rutas metablicas
La C. vulgaris es una micro alga color verde y unicelular del filo Chlorophyta, tiene una forma
esfrica midiendo de 2 a 10 um de dimetro, dependiendo de la especie se pueden lograr
diferentes tolerancias a la temperatura y tasas de crecimiento.
En la C. vulgaris se presentan las siguientes rutas metablicas [2,3]:
Fotosntesis
Ciclo de Calvin-Benson
Glucolisis/glucognesis
Ciclo de Krebs
Fosforilacin oxidativa
Biosntesis de cidos grasos
Biosntesis de triglicridos
Ruta pentosa fosfato
Formacin de biomasa
La variacin de las rutas metablicas en el crecimiento de la C. vulgaris radica en las diferentes
formas de crecimiento, estas formas son las siguientes:
1.2.1 Auttrofa
La ruta metablica en el crecimiento auttrofo de la C. vulgaris tiene como caracterstica principal
la fotosntesis, donde gracias a la luz solar es posible llevar a cabo la reaccin de descomposicin
del agua

, y gracias a esto es posible iniciar el ciclo de Calvin y

producir glucosa a partir del dixido de carbono [2,4]
1.2.2 Hetertrofa
La ruta metablica en el crecimiento hetertrofo de la C. Vulgaris es caracterizada por la omisin
de la fotosntesis, por lo cual es necesario proporcionar una fuente de carbono en forma de
azcares para que se pueda llevar a cabo la gluclisis y todos los ciclos consecuentes [2,4].
1.2.3 Mixotrfica
Durante esta ruta metablica ocurren todos los ciclos metablicos nombrados pero adicional a
esto es necesario suministrar carbono en forma de azucares [4,5].
Durante los tres tipos de crecimiento se puede evidenciar una diferencia entre el color de las
micro algas, puesto que en un crecimiento heterotrfico es posible realizarlo en ausencia de luz
por lo cual no se genera una cantidad considerable de clorofila y las algas pierden la tonalidad
verde caracterstica [4,5].
En figura 1 se puede observar la ruta metablica de la C. vulgaris en un crecimiento hetertrofo y
en la figura 2 la diferencia de coloracin que se presentan con los diferentes crecimientos
(auttrofo, hetertrofo y mixotrofico).

Figura 1. Metabolismo de C. vulgarisen crecimiento heterotrfico [2].
En este esquema metablico se evidencia la falta de la etapa de fotosntesis y se muestra a gran
rasgo todas las rutas metablicas nombradas anteriormente y las relaciones existentes entra cada
una de ellas.

Figura 2. Diferencias de tonalidad en un crecimiento auttrofo, hetertrofo y mixotrofico [5].

1.3 Medios de cultivo y condiciones de cultivo
A continuacin en la tabla 1 se muestran algunos medios de cultivo utilizados en experimentos
previos, los dos primeros corresponden a medios preparados en el laboratorio de Microbiologa
de la Universidad Nacional de Colombia para trabajos previos, el ultimo medio de cultivo
corresponde a un medio utilizado en el crecimiento de la C. vulgaris en un trabajo realizado para
la comparacin del crecimiento con bajos niveles de nitrgeno en el medio [6], adems en la tabla
2 se muestra una caracterizacin de una vinaza que aparece en la literatura, con esta
caracterizacin es posible hacer un panorama de los compuestos que puedan hacer falta en la
vinaza y que posibles inhibidores se tengan en la misma para la C. vulgaris.








Tabla 1. Comparacin de medios formulados [2,4,6]
Compuesto Medio formulado 1
(g/l)
Medio formulado 2 (g/l) Medio formulado 3 (g/l)
Macronutrientes
NaNO
2
2.5x10
-1
- 2.5x10
-1
CaCl
2
.2H
2
O 2.5x10
-2
2.5x10
-2
2.5x10
-2
MgSO
4
.7H
2
O 7.5x10
-3
7.5x10
-2
7.5x10
-2
K
2
HPO4 7.5x10
-3
- 2.25x10
-2

KH
2
PO
4
7.5x10
-3
1.75x10
-1
1.76x10
-1
NaCl 7.5x10
-3
2.5x10
-3
2.5x10
-2
Proteose peptone 1.00 2.17 -
(NH
4
)
2
SO
4
- 2.5x10
-1
-
Glucosa 15.0 15.0 -
Solucin EDTA
EDTA - - 5.0x10
-2
KOH - - 3.1x10
-2
Solucin cida de hierro
FeSO
4
.7H
2
O - - 4.97x10
-3
Solucin de Boro
H
2
BO
2
2.86 - 1.14x10
-2
Solucin de metales traza
MnCl
2
.4H
2
O 1.81 - 1.44x10
-3
ZnSO
4
.7H
2
O 2.22x10
-1
- 8.82x10
-3
NaMoO
4
.5H
2
O 3.9x10
-1
- -
CuSO
4
.5H
2
O 7.90x10
-2
- 1.57x10
-3
Ca(NO
3
)
2
.6H
2
O 4.94x10
-1
- 4.89x10
-4

Tabla 2. Caracterizacin de una vinaza y propiedades
qumicas [7]
Compuesto Concentracin (%p/p)
Solidos totales 60
Materia Orgnica 46
Carbono no oxidable 18
Nitrgeno 0.95
Fosforo (P2O5) 0.04
Potasio (K2O) 4.88
Calcio (CaO) 1.31
Magnesio (MgO) 0.67
Sulfatos (SO4) 2.59
Elementos menores mg/kg
Manganeso (Mn) 43
Cobre (Cu) 10
Zinc (Zn) 19
Boro (B) 6
Caractersticas adicionales
Densidad (kg/m3) 1300
pH 4.5 a 5
Conductividad Elctrica (dS/m) 17
Viscosidad (cPs) 450

La diferencia ms notoria entre los tres medios de cultivo es el uso de la glucosa, esto se debe a
que en el tercer medio de cultivo la C. vulgaris crece de forma auttrofa.
1.3.1 Condiciones de cultivo auttrofas
Las condiciones de cultivo de manera auttrofa que se han reportado en la literatura son una
intensidad lumnica de 60 umol de fotones m
-2
s
-1
a una temperatura de 27C, una agitacin de 140
rpm y un tiempo de crecimiento de 144 horas, el pH recomendado es de 7 [4]. La cantidad de
dixido de carbono recomendado es el 2% v/v y con un flujo de aire de 0.400 vvm [6], la cintica
de crecimiento de la C. vulgaris que se muestra en la figura 3 se realiz con las condiciones
anteriormente nombradas.
El intervalo de tiempo en que se realiza el conteo de clulas es cada 24 horas.

Figura 3. Crecimiento de C. vulgarisde forma auttrofa [6].
1.3.2 Condiciones de cultivo hetertrofas
El crecimiento heterotrfico se realiza en ausencia de luz, pero es necesario suministrar oxigeno
ya que este es un factor primordial en el crecimiento hetertrofo. Esto se debe a la respiracin
celular y si se suministra poco oxigeno la tasa de crecimiento disminuye. Se debe considerar que
en la especie C. vulgaris el crecimiento auttrofo es 5.5 veces menos rpido que el crecimiento
hetertrofo ya que se produce 16 veces ms ATP [3].
Algunas condiciones reportadas para el crecimiento heterotrfico son una temperatura de 28C,
una velocidad de agitacin de 150 a 180 rpm y ausencia de luz, se realiza un crecimiento de 4 a 6
das, el inocuo inicial debe ser del 10% v/v [8,9,10].
Tambin se tienen unas caractersticas fsicas del residuo donde se realiz un cultivo de la C.
vulgaris en la tabla 3, esto es importante tenerlo en cuenta puesto que gracias a esto existe una
variacin en la concentracin de azucares y sales en el medio.
Tabla 3. Composicin y propiedades de una vinaza caracterizada para un
crecimiento heterotrofico [8]
Parametro Sin centrifugar Centrifugada
pH 4.2 4.1
Total solidos suspendidos (g/L) 19 0.1
Total solidos disueltos (g/L) 41 40
Total COD (g/L) 80 45
Total COD disueltos (g/L) 48 45
Total azucar (g/L) 27 12
Total Nitrogeno (g/L) 5.5 1.5

La siguiente cintica de crecimiento presentada en la figura 4 corresponde a una cintica de
crecimiento de la C. vulgaris en un medio heterotrfico a base de agua de lavado proveniente del
lavado de la soya:

Figura 4. Cintica de crecimiento de la C. vulgaris en un medio heterotrfico a base de agua de lavado [9].
1.3.3 Condiciones de cultivo mixotrofica
Se ha realizado el crecimiento de la C. vulgaris de manera mixotrofica [10], donde las condiciones
de cultivo fueron las siguientes: se realiz en cultivo en un medio Bristol, con nitrato como fuente
de nitrgeno a un pH de 7.0, con luz continua a 110.35 uE m
-2
s
-1
, sin un suministro directo de
dixido de carbono, el cultivo se mantuvo en aireacin constante a un flujo de 0.45 Lmin
-1
, el aire
fue filtrado. El cultivo tambin se realiza en el residual de ablandamiento de soya a una
concentracin inicial de 20x10
6
celmL
-1
. El tiempo de cultivo es de 72 horas, algunas condiciones
lumnicas recomendadas se encuentran entre 300 y 880 lx [8,10].
A continuacin en la figura 5 se presenta la cintica de crecimiento de la C. vulgaris en diferentes
medios de cultivo a base de manera mixotrofica:

Figura 5. Crecimiento de C.vulgaris en diferentes medios de soya [11].
Dependiendo del tipo de cultivo que se aplique, se tendrn diferentes concentraciones de
carbohidratos, lpidos y protenas en la C. vulgaris, en la tabla 4 se muestra la concentracin de
estos componentes en un medio heterotrfico y en la figura 6 se muestra la concentracin de los
componentes celulares en un cultivo mixotrofico:
Tabla 4. Composicin celular de C. Vulgaris cultivada
heterotroficamente [12]
Compuesto Composicin de la biomasa (%)
Clorofila 10.01
Lpidos 8.62
Protenas 40.04
Azucares 28.96
Cenizas 9.89


Figura 6. Concentracin de lpidos, carbohidratos y protenas en la C. Vulgaris creciendo mixotroficamente[11].

Por ltimo se presenta un anlisis del contenido celular comparativo entre un crecimiento
heterotrfico y mixotrofico en la figura 7, y los tres crecimientos auttrofo, hetertrofo y
mixotrofico en la tabla 5:

Figura 7. Composicin qumica de la C. vulgarisen un medio heterotrfico y mixotrofico [10] donde los medios de
cultivo son uno preparado, .
Tabla 5. Comparacin del contenido de lpidos de C. Vulgaris por medio
de las tres diferentes formas de cultivo [3].
Tipo de
crecimiento
Lipid/Pho Lipid/O
2
Lipid/CO
2
Lipido/GLC
Auttrofo 0.0050 0.0501 0.0578 -
Auttrofo 0.0047 0.0501 0.0578 -
Auttrofo 0.0041 0.0378 0.0598 -
Auttrofo 0.0010 0.0211 0.0598 -
Hetertrofo 0.0093 0.0870 2.4359 0.3552
Mixotrofico 0.0082 0.0764 0.2797 0.4371
Mixotrofico 0.0050 0.0503 0.0581 10.513
Mixotrofico 0.0010 0.0091 0.0598 63.828

Donde los rendimientos estn presentados en mg de lpidos/ mmol de sustrato, el crecimiento
hetertrofo y mixotrofico se realiza con glucosa, el auttrofo con dixido de carbono al igual que
el mixotrofico.




2 Metodologa experimental

2.1 Seguimiento cintico
El seguimiento de la cintica de crecimiento se puede realizar por tres formas, la primera es
conteo en cmara de Neubauer [11], la segunda es peso seco y relacionarla con la medida de la
absorbancia [8] o simplemente usar la medida del peso seco [10]. La metodologa experimental
utilizada es la presentada en la figura 8, en la figura 9 se muestra la medicin de peso seco y en la
figura 10 la medicin de absorbancia:

Figura 8. Procedimiento experimental para conteo en cmara de Neubauer.
*Las diluciones requeridas varan dependiendo del tiempo que tenga el cultivo, 1 en 3 para un
rango de 1 a 2 das, 1 en 10 para un rango de 3 a 5 das y 1 en 15 para un rango de 5 das en
adelante.
1
Tomar 100 L de muestra.
2
Realizar una dilucin*.
3
Agregar azul de metileno.
4
Aplicar sobre la camara de conteo de Neubauer.
5
Realizar el conteo en el microscopio a 10x.
6
Calcular el nmero de ceular por unidad de volumen.

Figura 9. Procedimiento experimental para medir peso seco.

Figura 10. Procedimiento experimental para medir absorbancia.
Para las pruebas de absorbancia y peso seco es necesario realizar un lavado de la biomasa, las
clulas que se encuentran especialmente cultivadas en las vinazas contienen un alto grado de
1
Secar tubos eppendorf por 3 horas a 70
o
C
Pesar los tubos eppendorf
2
Tomar 500L de muestra, colocarlos en los tubos y centrifugar a 13000 rpm a 4
o
C por 10 minutos.
3
Tomar el sobre nadante para realizar una prueba de DNS.
4
agregar 1mL de agua destilada y resuspender con ayuda del vortex.
5
Centrifugar a 13000 rpm a 4
o
C por 10 minutos, retirar el sobre nadante y desechar.
6
Repetir el paso 3 y 4 tres veces.
7
Retirar el sobre nadante
Colocar las muestras a secar de 3 a 4 horas a 70
o
C hasta obtener un peso constante.
8
Por gravimetra obtener la masa de la biomasa.
1
Se realizan los pasos 2, 3, 4, 5, 6 y 7 del procedimiento medicin de peso
seco.
2
Se agrega 1mL de agua destilada y se resuspende la biomasa con ayuda del
vortex.
3
Se agrega 1mL a un tubo de ensayo, posteriormente se agrega la mezcla y
se agita en el vortex por 30 segundos, para tener un volumen total de 2mL.
4
Se mide la absorbancia de esta mezcla a 540nm.
sales e impurezas que generan un error experimental si no son retiradas, por esto es necesario
lavarlas con agua y centrifugarlas 4 veces como se indica en los pasos 2 a 7 de la Figura 8.
La curva de calibracin entre absorbancia y peso seco se construye realizando los procedimientos
de medicin de peso seco y medicin de absorbancia en paralelo para cada muestra, utilizando
como blanco agua y midiendo la absorbancia a 540nm.
2.2 Medicin de lpidos
La medicin de la cantidad de lpidos presentes en la biomasa se realiza mediante el siguiente
procedimiento citado en [13] y presentado en la figura 11.

Figura 11. Procedimiento experimental para determinar la cantidad de lpidos.

2.3 Medicin de azucares
La medicin de azucares reductores se realiza con el mtodo del DNS (cido dinitrosaliclico), el
DNS es preparado para reaccionar con una concentracin mxima de 4 g/l de azcar; el
procedimiento es el siguiente presentado en la figura 12:
1
Tomar 50mg de microalga seca y colocar en un tubo de 15mL.
2
Agregar 1.6mL de agua, 4.0mL de metanol y 2.0mL de cloroformo.
3
Mezclar en el vortex por 30 segundos.
4
Agregar 2.0mL mas de agua y 2.0mL mas de cloroformo y repetir el paso 3.
5
Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.
6
Separar la fase superior decantando en un tubo de ensayo debidamente pesado y filtrar la fase organica.
7
Evaporar el cloroformo.
8
Pesar y determinar por gravimetra la cantidad de lpidos.

Figura 12. Metodologa para la medicin de azucares reductores.
Para este DNS se realiz un posterior curva de calibracin que relaciona la absorbancia con la
concentracin de azucares reductores.
2.4 Medicin de protenas
Para la cuantificacin de protenas se utiliz el mtodo del Bradford, pero para poder aplicar este
mtodo es necesario desdoblar y desnaturalizar las protenas con beta-mercaptoetanol y SDS. El
reactivo de Bradford solo es capaz de medir una concentracin mxima de 20g/mL de protena,
por lo cual es necesario realizar diluciones para poder cuantificar la cantidad; el procedimiento es
el siguiente [14] presentado en la figura 13:
1
Tomar 200L de sustancia problema y diluir 1 en 3.
2
Agregar 0.5mL de sustancia problema diluida y 0.5mL de DNS, tomar
como blanco agua y realizar el mismo procedimiento anterior.
3
Calentar en bao de maria a una temperatura de 90C por 5 minutos.
4
Enfriar en agua por 10 minutos y agregar 5mL de agua a cada muestra.
5
Dejar reposar 15 minutos y medir absorbancia a 540nm.

Figura 13. Cuantificacin de protenas por el mtodo de reactivo de Bradford.

3 Resultados y anlisis

3.1 Preparacin del inoculo y adaptacin de la C. vulgaris a las vinazas
Como se nombr anteriormente en las condiciones necesarias para el cultivo de algas de forma
heterotrfica es necesario realizar un inoculo del 10% en volumen. El medio formulado que se
utiliz fue el nmero uno de la tabla 1. En la experimentacin se prepararon 3 muestras de vinaza
cada una con porcentajes diferentes, las proporciones fueron 50% 80% y 95% de vinaza y se
prepar un blanco de crecimiento positivo que contena el medio formulado. En un principio el
disolvente en las vinazas era agua pero transcurridas dos corridas del experimento las microalgas
no presentaron un crecimiento considerable en los medios, en cambio en el medio formulado que
siempre fue usado como un blanco de crecimiento positivo si se present crecimiento en las dos
corridas. Al observar este patrn de no crecimiento se pudo concluir que las vinazas no contenan
algn componente necesario para el crecimiento de la C. vulgaris, por lo cual fue necesario
cambiar el disolvente de las vinazas y usar medio formulado sin glucosa en lugar de agua. A pesar
de aumentar la concentracin de algunos compuestos como los fosfatos y los nitratos que ya se
encuentran presentes en las vinazas las microalgas son capaces de soportar los excesos de estos
compuestos ms que las deficiencias de algunos otros. No fue posible determinar
experimentalmente los compuestos ausentes en la vinaza por lo cual se recomienda usar en todos
los casos un porcentaje de medio formulado sin glucosa.
1
Tomar 2 mL de muestra, preferiblemente que no se encuentre seca y agregar SDS hasta una
concentracin de 0.025% y agregar 1% de beta-mercaptoetanol para realizar la digestion de
la proteina.
2
La digestin se raliza por 5 minutosen bao de maria a 90C.
3
Se toma una alicuota y se diluye 1 en 10.
4
De la mezcla diluida se toma 1mL y se le agrega a esta alicuota 1mL del reactivo de Bradford.
5
Se deja reaccionar y se mide la absorbancia a 580nm.
La adaptacin de la microalga se realiz de la siguiente manera: en la primera semana se realiz
una siembra desde una colonia en agar a un medio formulado lquido para preparar un pre-
inoculo, este se dej en crecimiento por 2 das, luego se realiz el inoculo 10% volumen a
volumen directamente en los medios formulados de vinaza. Al realizar esto el experimento
fracas puesto que los medios formulados son muy hostiles y adems se encontraba diluido en
agua, la ausencia de compuestos necesarios para el crecimiento provoco la inhibicin de la
mayora de las clulas.
Para el inoculo de la segunda corrida se centrifugaron todas las muestras, se concentr la biomasa
y se combinaron todas las muestras creando as un inoculo con clulas viables que se encontraban
en el blanco de crecimiento positivo, las pocas clulas viables presentes en las vinazas y una gran
cantidad de microorganismo muerto. En la segunda corrida el resultado no fue el esperado en las
vinazas, la concentracin de la biomasa fue muy baja pero se logr observar un cambio de
tonalidad en el blanco de crecimiento positivo, este cambio de tonalidad se debe a la prdida
parcial de cloroplastos en la clula a causa de la ausencia de luz, el cambio de tonalidad se puede
observar en la Figura 14.
En la tercera corrida se realizaron los mismos pasos de la segunda corrida, la nica diferencia fue
la preparacin de los medios con vinaza ya que se us medio formulado sin glucosa como
disolvente en lugar de agua, esto produjo un resultado positivo y esperado en todas las muestras.
La metodologa a seguir para la adaptacin de la C. Vulgaris a un medio tan hostil como lo es la
vinaza es preparar un blanco crecimiento positivo con medio formulado, a los dos das centrifugar
y realizar una siembra en un medio formulado con el 5% de vinaza, cada dos das repetir el
procedimiento aumentando la concentracin de vinaza a 20% posteriormente a 50%, luego a 80%
y por ultimo a 95%, recordando que como diluyente se debe usar el medio formulado. A medida
que la microalga se va adaptando a las vinazas y debido a la turbidez del medio de cultivo se van a
ir perdiendo los cloroplastos por lo cual la C. Vulgaris va a crecer color blanco, sin embargo al
observarla al microscopio se puede observar una tonalidad verde claro, en la Figura 15 se muestra
la C. Vulgaris vista al microscopio.

A B

C
FIgura14. Diferencias de tonalidad en las dos primeras corridas realizadas. A) Primera corrida, B) Segunda corrida, C)
Diferencia de tonalidad en la biomasa concentrada y lavada, de izquierda a derecha los medio son: Blanco de
crecimiento positivo, 5% de vinazas, 20% de vinazas, 50% de vinazas, 80% de vinazas y 100% de vinazas.

Figura 15. C. vulgaris vista a travs del microscopio a 10X, adaptada al medio con vinaza.
Los volmenes experimentales usados son 120mL y el inoculo se prepar con el procedimiento
anteriormente explicado, para la siembra se us el 10% volumen a volumen.
3.2 Seguimiento y ajuste de la cintica de crecimiento
A la cintica de crecimiento se le realizo un seguimiento por los tres mtodos nombrados en el
numeral 4.1; el mtodo ms confiable es la medicin de peso seco, esto se debe a que no es
necesario realizar diluciones.
Al realizar el conteo con cmara de Neubauer el error experimental poda tomar valores de hasta
un 30%, esto se debe al factor de dilucin que se maneja, en primera instancia tenemos el factor
de dilucin que utiliza la cmara que corresponde a 1x10
-4
el cual se ve multiplicado por el factor
de dilucin que como mnimo es 3, al ver estas relaciones solo es necesario contar una clula de
ms o una clula menos y nuestro resultado se ve afectado con +3x10
4
clulas cada litro, lo cual es
un error bastante considerable. Solo se realiz una prueba con la cmara de Neubauer y fue para
la primera corrida, los resultados se pueden observar en la Figura 16.

Figura 16. Medicin de la cintica de crecimiento para la primera corrida por el mtodo de conteo en cmara de
Neubauer, las lneas negras nos indica la diferencia medida con la desviacin estndar entre la cantidad de clulas del
medio ms concentrado en vinazas con respecto al menos concentrado; la lnea azul corresponde al blanco de
crecimiento positivo.
En esta grafica se puede observar que no existe una diferencia considerable en el nmero de
clulas de los medios formulados que contienen vinaza y agua como disolvente; adicional a esto
es posible evidenciar el error experimental que ocurre en este mtodo de seguimiento cintico,
los datos se encuentran en un rango muy bajo de desviacin estndar lo cual considera estas
tendencias prcticamente iguales, dando como resultado una inhibicin del microorganismo en el
medio con vinaza. Por ltimo se puede observar otro inconveniente con este mtodo, si la mezcla
se deja en reposo las clulas tienden a precipitarse y si se realiza el muestreo sin re-suspender se
obtiene un error como el que se observa en el tiempo 240 horas, en todas las muestras se
encontr un decrecimiento que en un principio estaba asociado a la muerte celular, pero al
observar los datos del siguiente tiempo es posible descartar esta posibilidad ya que se conserva
una tendencia. Con base a este experimento es posible descartar el mtodo de conteo con
cmara de Neubauer debido al error que fluctuar entre el 30% y 40% dependiendo de las
diluciones que sea necesario realizar.
El segundo mtodo de seguimiento que se le realizo a la cintica fue medir absorbancia y
relacionarla por medio de una curva de calibracin con el peso seco, este mtodo tampoco fue
adecuado para el seguimiento cintico, esto se debe a que la C. Vulgaris pasado el tiempo y
debido al estrs que le causa el medio con vinaza comenz a aglomerarse y a sedimentarse,
formando as una solucin con partculas suspendidas de manera no uniforme lo cual imposibilita
obtener un dato correcto de la absorbancia, el mtodo es confiable para bajas concentraciones
del microorganismo caso en el cual no forma aglomeraciones. A causa de esto es necesario
descartar este mtodo de seguimiento puesto que arroja datos poco confiables.
Por ltimo se utiliz el mtodo de medicin del peso seco, es de esperar que debido a la
temperatura se puedan evaporar compuestos voltiles presentes en la clula, pero como se
mostr en la tabla 4 ms del 60% del contenido celular son lpidos, protenas y azucares los cuales
a 70
o
C no se evaporan. Los resultados obtenidos con esta metodologa son los mostrados en la
figura 17 y en la tabla 6 se muestra la diferencia de peso seco entre la biomasa sin lavar y lavada.
Tabla 6. Diferencia en el peso seco de la biomasa lavada y sin lavar siguiente
el procedimiento de la figura 9.
Muestra Peso Biomasa
lavada (g)
Peso Biomasa
sin lavar (g)
Porcentaje de
diferencia (%)
0% vinaza 0.5150 0.5151 2%
50% vinaza 0.5504 0.5580 7%
80% vinaza 0.5697 0.5703 11%
95% vinaza 0.5375 0.5388 24%


Figura 17. Seguimiento cintico de la C. Vulgaris con la metodologa de medicin de peso seco para la tercera corrida
experimental, con el microorganismo adaptado a la vinaza y usando como disolvente de la vinaza medio formulado sin
glucosa.
En esta corrida se muestra claramente el crecimiento de la C. Vulgaris en el medio preparado con
vinaza y usando como diluyente medio formulado, se puede descartar el error producido por las
sales presentes en las vinazas ya que se realiz un lavado de la biomasa antes de secarla, esto con
el fin de retirar cualquier impureza y sal que se encontrar adherida a la pared celular del
microorganismo. Teniendo estos datos experimentales y la medicin de consumo de sustrato la
cual se realiz con medicin por DNS cuyos resultados se muestran en la Figura 18 fue posible
realizar el ajuste a un modelo cintico de Monod, el modelo consta de los siguientes parmetros
[15]:

(1)

(2)

(3)

(4)
Donde el parmetro corresponde a la tasa de crecimiento y sus unidades son tiempo
-1
, este a su
vez es funcin de la concentracin de sustrato S y de dos parmetros cinticos que son la tasa
mxima de crecimiento

y la afinidad del microorganismo al sustrato

, la velocidad de
produccin de biomasa es la tasa de crecimiento por la concentracin de biomasa X y la velocidad
de consumo de sustrato es la velocidad de produccin de biomasa dividida entre el rendimiento
global de la produccin de biomasa con respecto al consumo de sustrato

, los
resultados obtenidos para estos parmetros se muestran en la tabla 7.


Figura 18. Consumo de sustrato contra el tiempo en la tercera corrida experimental para la C. Vulgaris en diferentes
concentraciones de vinaza usando como disolvente medio formulado sin glucosa.

Tabla 7. Parmetros cinticos obtenidos para la C.vulgaris en diferentes
concentraciones de vinaza usando como disolvente medio formulado sin glucosa.
Concentracin de vinaza
max
(1/h) k
s
(g/L) Y
xs
(adimensional)
Blanco de crecimiento positivo 0.045 5.5 0.090
50% vinaza 0.045 2.0 0.280
80% vinaza 0.045 3.5 0.220
95% vinaza 0.045 4 0.170

En la figura 19 se muestra la validacin del modelo cintico, esto se realiza mostrando los
resultados experimentales obtenidos para la tasa de crecimiento calculada con los tiempos de
generacin usando la ecuacin 4 contra la velocidad de consumo de sustrato r
s
y en la misma
grafica los mismos parmetros calculados con los parmetros cinticos de la tabla 7.


A B

C D
Figura 19. Validacin de los parmetros cinticos

de la tabla 6 con los datos experimentales para el ajuste al

modelo tipo Monod, A) blanco de crecimiento positivo, B) 50% medio formulado sin glucosa-50% vinazas, C) 20% medio
formulado sin glucosa-80% vinazas, D) 5% medio formulado sin glucosa-95% vinazas.
Como se puede apreciar en la figura 18 el ajuste no parece ser muy adecuado, esto se debe a que
el modelo cintico tipo Monod no es el ms adecuado, aun as los parmetros obtenidos
funcionan como comparativo de cada medio formulado, en la figura 20 se muestran las cinticas
tanto experimentales como ajustadas al modelo de Monod.


A B

C D
Figura 20. Seguimiento cintico de la C. vulgaris para los diferentes medios formulados, se muestran los datos
experimentales de concentracin de biomasa (g/L) y tiempo (h) y el modelo cintico tipo Monod al cual fue ajustada
cada cintica con los parmetros de la tabla 6. A) Blanco de crecimiento positivo, B) 50% medio formulado sin glucosa-
50% vinazas, C) 20% medio formulado sin glucosa-80% vinazas, D) 5% medio formulado sin glucosa-95% vinazas.
El rendimiento ms alto de biomasa consumo de sustrato observado es en los medio preparados
con 50% vinazas y 50% medio formulado sin glucosa como disolvente y el 80% vinazas y 20%
medio formulado sin glucosa como disolvente, esto quiere decir que hubo un alto crecimiento de
la C. Vulgaris con una cantidad reducida de sustrato si se compara la cantidad presente en los
dems medios. Los dos valores son muy cercanos y la diferencia que se evidencia entre ellos se
puede deber a error experimental. Sin embargo se puede ver que este rendimiento se ve reducido
en el medio 95% vinaza 5% medio formulado sin glucosa como disolvente, esto se puede deber a
una inhibicin ocasionada por algn compuesto en exceso presente en la vinaza. Es posible
establecer experimentalmente un punto ptimo de rendimiento construyendo una curva que
relacione el rendimiento biomasa-consumo de sustrato con el porcentaje de vinazas en el medio.
Con respecto al parmetro de crecimiento, al ser calculado con la ecuacin 4, en todos los medios
se evidencian de cuatro a cinco tiempos de generacin, agregando a esto que la cintica de los 4
medios fue seguida al mismo tiempo y al tratarse de la misma cepa de C. vulgaris era de esperar
que las tasas de crecimiento especificas fueran similares, en este caso son iguales, puesto que
cercanas las 200 horas en todos los medios la micro alga entra a fase estacionaria. La tasa de
crecimiento especifica mxima es de 0.045 h
-1
.
Analizando los valores obtenidos para la constante de afinidad del sustrato se puede observar que
la C. vulgaris presenta mayor afinidad en el medio preparado al 50% vinazas, seguido del medio
preparado al 80% de vinazas, este efecto se evidencia en la figura 18 que nos muestra el consumo
de sustrato con respecto al tiempo, el sustrato es consumido rpidamente en el medio al 50% de
vinazas y se consume de forma muy lenta en el medio formulado sin vinaza. Esto se debe a la
adaptacin de la C. vulgaris al medio hostil que contiene vinaza. Sin embargo se observa que a
mayor concentracin de vinaza la afinidad por el sustrato se reduce, esto se debe a un clara
inhibicin de la microalga a causa de una alta concentracin de algn componente presente en la
vinaza, es posible mediante experimentos ms rigurosos encontrar el componente inhibidor y
realizar un ajuste cintico donde se tenga en cuenta la misma constante de afinidad del sustrato y
se considere un trmino adicional de inhibicin a altas o bajas concentraciones de uno de los
compuestos en el medio de crecimiento.
3.3 Contenido celular
Al realizar las pruebas de extraccin de lpidos y medicin de protenas se obtuvieron los
resultados reportados en la figura 21.

Figura 21. Porcentaje de protenas y lpidos presentes en la C. Vulgaris para los diferentes medios formulados con
vinaza.

Como se observa que en casi todos los casos la cantidad de protenas es ms alta que la cantidad
de lpidos, la cuantificacin de lpidos tiene un cierto parecido a los presentados en la figura 6,
pero los datos correspondientes a la cantidad de protenas se encuentran desfasados ya que es de
esperar que este porcentaje ocupe cerca del 50% del contenido celular. Los datos obtenidos
posiblemente no tienen mucha validez y es necesario aplicar un mtodo ms certero de
cuantificacin de protenas, el problema principal en la medicin de protenas es ocasionado por
la complejidad de la extraccin de las mismas y la desnaturalizacin, es posible que durante el
experimento no se hayan extrado totalmente las protenas y peor an las protenas extradas no
fueron totalmente desnaturalizadas. La extraccin de las protenas se realiz con la biomasa seca,
pero la recomendacin es realizarla con la biomasa concentrada y hmeda, puesto que as la lisis
y la extraccin es mucho ms fcil de realizar, al igual que la desnaturalizacin de las protenas.
Con los lpidos ocurre algo muy similar, la diferencia es que durante el experimento hubo una
cantidad de biomasa a la cual es recomendable realizarle una extraccin adicional con cloroformo.
Al tener estas consideraciones presentes se puede ver que los resultados no presentan mucha
confiabilidad por lo cual es necesario buscar otra metodologa o complementar esta metodologa
con tcnicas ms certeras de lisis celular y extraccin de protenas y lpidos.
La cantidad de lpidos tiene un aumento a medida que la concentracin de vinaza es mayor, esto
se puede deber a la hostilidad del medio y que posiblemente la presin osmtica es mayor que en
agua con sales, posiblemente la respuesta a este estrs sea generar una pared celular ms gruesa
por lo cual la cantidad de lpidos aumenta.

4 Conclusiones
Las vinazas son un medio de cultivo hostil pero la C. vulgaris es capaz de crecer en ellas.
Las vinazas deben ser reforzadas con el medio formulado para completar los nutrientes
que hacen falta y son requeridos en el crecimiento de la C. vulgaris.
La adaptacin de la C. vulgaris a las vinazas puede tomar cerca de 2 semanas con la
metodologa propuesta para la preparacin del inoculo.
El mtodo ms adecuado para el seguimiento cintico es la medicin de peso seco ya que
no genera un error muy grande gracias a que no se necesita realizar diluciones.
La medicin de los azucares reductores se puede realizar con la prueba de DNS
presentando resultados bastante confiables.
Se puede obtener un rendimiento mximo de concentracin de biomasa con respecto a la
cantidad de sustrato consumido, este rendimiento se reduce a medida que aumenta la
concentracin de vinaza, pero en el caso del medio formulado el rendimiento es bajo, lo
cual indica que existe un mximo rendimiento en una concentracin de vinaza especifica.
La concentracin de biomasa al igual que el rendimiento de consumo de sustrato tambin
presenta un mximo, a medida que aumenta la concentracin de vinaza aumenta la
concentracin de biomasa, pero llega hasta un punto mximo donde a altas
concentraciones de vinaza se inhibe el crecimiento, la velocidad mxima de crecimiento
se reduce y la concentracin de biomasa tambin se reduce.
A medida que aumenta la concentracin de vinaza la concentracin de lpidos tambin
aumenta.
La metodologa usada para extraer y cuantificar las protenas y los lpidos no parece ser la
ms adecuada ya que al parecer no se puede cuantificar la cantidad total de estos
compuestos presentes en la C. vulgaris.

5 Bibliografa
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[15] Bioprocess Engineering Principles. Pauline M. Doran. Elsevier Science & Technology Books,
Tercera edicin.


Anexo A
Curva de calibracin correspondiente a la prueba de peso seco relacionada con la absorbancia
mostrada en la figura 22.

Figura 22. Curva de calibracin absorbancia contra peso seco.

Anexo B
Curva de calibracin correspondiente a la medin de azucares reductores con DNS mostrada en la
figura 23.

Figura 23. Curva de calibracin absorbancia contra concentracin de azucares reductores.


Anexo C
Curva de calibracin correspondiente a la medin de protenas con el reactive de Bradford
mostrada en la figura 24.

Figura 24. Curva de calibracin absorbancia contra concentracin protenas.