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Cinética de fermentación alcohólica utilizando como fuente de nitrógeno harina de semilla de guayaba Psidium guajava

Liliana Serna Cock 1*, Daniel Mera Ayala 1, Jorge Angulo López 1, Ana Lucia Gómez 2
1*
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de Ingeniería y Administración, Carrera 32 vía Candelaria, Palmira – Valle, Colombia.
2
SUCROMILES S.A., Km. 14 Recta Cali-Palmira – Valle, Colombia.

1. INTRODUCCIÓN permanecieron en un baño termostático (Julabo – 13A, Germany) a 34 ±


0.5 °C, con aireación 5 L/min y agitación a 270 rpm por 4 horas y durante
En la industria de las fermentaciones, el costo, la disponibilidad y la la etapa de fermentación, permanecieron en el mismo baño termostático a
estabilidad de los sustratos de fermentación, son motivo de investigación, 32 ± 0.5 °C, sin aireación y agitación a 270 rpm por 24 horas.
ya que pueden representar hasta el 68 % del costo de producción de los
productos obtenidos por fermentación [1, 2], siendo las materias primas 2.5 Cinética de producción de etanol, consumo de sustrato y
más importantes las fuentes de carbono y de nitrógeno. En referencia a la formación de biomasa en fermentación alcohólica
fuente de carbono, la melaza de caña de azúcar es uno de los principales Para realizar las cinéticas de producción de etanol y consumo de sustrato,
subproductos de la industria azucarera, es buena fuente de azúcares en cada uno de los tiempos y para cada uno de los sustratos, se tomaron
fermentables y no requiere pretratamiento complejo [3]. Tradicionalmente asépticamente 10 mL de sustrato a las 0, 3, 6, 12, 18 y 24 horas de
la urea es la principal fuente de nitrógeno, y el fósforo, es adicionado en la fermentación (El tiempo 0 correspondió a las condiciones finales de la
forma de fosfato diamónico por su demostrada facilidad de absorción por etapa de reproducción celular), los cuales se centrifugaron a 4000 rpm por
parte de las células microbianas, favoreciendo, al igual que la fuente de 10 minutos (Eppendorf Centrifuge – 5804R, Germany); posteriormente se
nitrógeno, el desarrollo celular [4]. La búsqueda de nuevas fuentes de filtraron en filtros de 0.45 µm (Titan, USA). La producción de etanol se
nitrógeno está dirigida a reemplazar suplementos costosos como son los midió en los sobrenadantes mediante cromatografía gaseosa
péptidos y algunos factores de crecimiento (Vitaminas del complejo B) los (Cromatógrafo de gases Agilent technologies – 7890A, USA) y el
cuales tienen gran importancia en la fermentación [5]. consumo de sustrato (Azúcares reductores) se determinó por
espectrofotometría (Thermo Scientific – Genesys 10 UV, USA) mediante
De otro lado, estudios realizados por Steinhaus et al. [6], afirman que una el método DNS (Ácido 3,5- dinitrosalicilico) [9]. La cinética de formación
parte importante de la cosecha de guayaba se procesa en mermeladas, de biomasa se determinó por conteo en Cámara de Neubauer; el
sorbetes, pastas y barras de dulce llamadas bocadillos. Durante la seguimiento de la formación de biomasa se llevó a cabo durante 4 horas
elaboración de dichos productos se utiliza la pulpa quedando como con el fin de garantizar que el número de células inoculadas fuera superior
residuo una gran cantidad de semilla, la cual representa el 4.0 % del peso a 3x108 CelmL-1 acorde a la metodología establecida por Calderón, [4]. Se
de la guayaba y posee un contenido importante de proteína [6,7]. Altaf et calculó la conversión de sustrato (CS), el rendimiento en producto (Yp/s) y
al. [5], establecen una necesidad en la investigación sobre materiales la productividad mediante las Ecuaciones 1, 2 y 3.
renovables nitrogenados como alternativa de fuentes de nitrógeno de
menor costo, en fermentaciones industriales. El residuo agroindustrial
generado en la agroindustrialización de la guayaba, pueden ser una fuente
alterna y potencial de alto interés en el estudio de posibles aplicaciones en
la industria de las fermentaciones.

Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue evaluar la cinética de


fermentación alcohólica utilizando como fuente de nitrógeno harina de
semilla de guayaba Psidium guajava. La cinética se midió en términos de
conversión de sustrato, rendimiento en producto y productividad. Donde, S0: Concentración inicial de azúcares reductores (gL-1), S:
Concentración final de azúcares reductores (gL-1), hasta el tiempo en que
2. METODOLOGÍA P es máximo; P: Concentración máxima de etanol (gL-1), mp: Masa de
etanol producida (g), VT: Volumen total de fermentación (L) y t: Tiempo
2.1 Material biológico de fermentación (h).
Se trabajó con semilla de guayaba Psidium guajava suministrada por la
empresa Dulces San Antonio la Tentación, del Municipio de Vélez – 2.6 Análisis estadístico
Santander, Colombia. La semilla se sometió a un proceso de secado Se usó un diseño factorial de 2*6 con dos factores y tres replicas así:
(Binder ED 115-UL, Germany) y molienda (FRITSCH Pulverisette 14, Factor sustrato de fermentación, con dos niveles: melaza más urea y
Germany) para la obtención de la harina. fosfato diamónico (MUFA) y melaza más harina de semilla de guayaba
(MHSG). Factor tiempo de fermentación, con 6 niveles: 0, 3, 6, 12, 18 y
2.2 Determinación del contenido de nitrógeno del material biológico 24 horas de fermentación, donde el tiempo 0 correspondió a las
Se determinó el contenido de nitrógeno mediante el método Kjeldahl [8]. condiciones finales de la etapa de reproducción celular. Las variables de
respuesta fueron: Conversión de sustrato, rendimiento en producto y
2.3 Microorganismo productividad. Los resultados se analizaron con el paquete estadístico
Se utilizó una cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red (Division of SAS 9.2 para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC., USA) [10]. La
S.I. Leaffre Group, France) comparación entre promedios se llevó a cabo a través de la prueba DMS
(Diferencia Mínima Significativa) con una probabilidad de P < 0,05.
2.4 Fermentación
Las cinéticas se llevaron a cabo en 6 fermentaciones en discontinuo, 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
usando como sustrato, melaza más urea y fosfato diamónico MUFA
(Azúcares reductores 23 gL-1, urea 1.1 gL-1 y fosfato diamónico 0.67 gL-1) La harina de semilla de guayaba presentó un contenido de nitrógeno del
y melaza más harina de semilla de guayaba MHSG (Azúcares reductores 1.23 % en base seca. El sustrato MHSG presentó el mayor rendimiento en
23 gL-1 y harina de semilla de guayaba 51.42 gL-1). Los sustratos se producto (Yp/s) y la mayor conversión de sustrato a las 18 y 24 horas de
ajustaron a pH 4.6 utilizando ácido sulfúrico al 98 % y se esterilizaron a fermentación respectivamente (6.11 gg-1 y 47.58 %). La productividad a
121 °C y 0.11 MPa por 15 min (Autoclave esterilizador Medical – Essen las 24 horas de fermentación en el sustrato MUFA fue mayor que la del
250 I, Colombia). Para la etapa de reproducción se utilizó el 30 % (v/v) de sustrato MHSG con valores de 2.59 y 2.50 gL-1h-1 respectivamente. Esto
inóculo con respecto al volumen del sustrato. Las fermentaciones se indica que el sustrato MHSG al finalizar el proceso presenta la mayor
realizaron en un bioreactor de 1500 mL, con un volumen de trabajo conversión de sustrato, pero el rendimiento en producto es mejor a las 18
efectivo de 1000 mL; en la etapa de reproducción de la levadura, horas de la fermentación.
sulfato de amonio, por lo cual, la harina de semilla de guayaba se puede
8,60 140,00 considerar una fuente de nitrógeno viable para la fermentación alcohólica.

Azuúcares reductores (gL-1)


8,50 120,00
100,00
4. CONCLUSIONES
Log (CelmL-1)

8,40
80,00
8,30
60,00
8,20 La harina de semilla de guayaba es una buena alternativa como fuente de
40,00
8,10 20,00
nitrógeno en fermentaciones alcohólicas, cuando se utiliza como sustrato
8,00 0,00
MHSG, se pueden obtener mayor conversiones de sustrato y mejores
0 1 2 3 4 5 rendimientos en producto durante la etapa de fermentación. El uso de esta
Tiempo (h) fuente de nitrógeno podría disminuir los costos operacionales alrededor
MUFA - Formación de biomasa MHSG - Formación de biomasa del 35 %, comparado con el uso de las fuentes habituales, generando
MUFA - Consumo de sustrato MHSG - Consumo de sustrato además un valor agregado interesante a este residuo agroindustrial que
Figura 1: Cinética de formación de biomasa y consumo de sustrato de puede perderse en la agroindustrialización de la fruta.
Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de
reproducción, utilizando sustratos: melaza más urea y fosfato diamónico Agradecimientos
(MUFA) y melaza más harina de semilla de guayaba (MHSG). Los autores expresamos los agradecimientos al Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT) y a las empresas SUCROMILES S.A. y
La figura 1 muestra que los azúcares reductores mostraron un incremento Dulces San Antonio la Tentación, por los aportes a ésta investigación.
en su concentración durante la primera hora de reproducción, lo anterior
se explica por la presencia de sacarosa en la melaza, la cual es catalizada 5. REFERENCIAS
por la enzima invertasa presente en la levadura [11]. La hidrólisis de la
sacarosa trae consigo un ligero aumento en las concentraciones de 1. Kwon, S., Lee, P.CH., Lee, E.G., Chang, Y.K., Chang, N. (2000).
fructosa y glucosa [12], y por ende un aumento en los azúcares reductores. Production of lactic acid by Lactobacillus rhamnosuswith vitamin-
supplemented soybean hydrolysate. Enzyme and Microbial
8,80 300,00 Technology, 26: 209–215.
Azúcares reductores (gL-1)

8,70
8,60
250,00 2. Serna, L. and Rodríguez., A. (2007). Producción económica de ácido
láctico utilizando residuos de cosecha y jugos de caña de azúcar
Log (CelmL-1)

8,50 200,00
8,40 150,00 (Saccharum officinarum L.). Agricultura Técnica, 67: 29–38.
8,30 100,00 3. Calderón A., Evaluación del uso de antibióticos como mecanismo
8,20
50,00 para el control de contaminantes bacterianos en la fermentación para
8,10
8,00 0,00 la producción de alcohol etílico. Bogotá, 2007. Trabajo de grado
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 (Microbióloga Industrial). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad
Tiempo (h)
de Ciencias.
MUFA - Formación de biomasa MHSG - Formación de biomasa 4. Acevedo A., Godoy R, and Bolaños G., (2003). Incremento de la
MUFA - Consumo de sustrato MHSG - Consumo de sustrato producción de alcohol en fermentación de melazas mediante la
Figura 2: Cinética de formación de biomasa y consumo de sustrato de utilización del complejo enzimático Rhyzozyme. XXII Congreso
Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de Colombiano de Ingeniería química. Bucaramanga. Agosto 13–15.
fermentación, utilizando sustratos: melaza más urea y fosfato diamónico 5. Altaf, Md., Naveena, B.J., Reddy, G. (2005). Screening of
(MUFA) y melaza más harina de semilla de guayaba (MHSG). Inexpensive Nitrogen Sources for Production of L (+) Lactic Acid
from Starch by Amylolytic Lactobacillus amylophilus GV6 in Single
En la figura 2 el incremento de los azúcares reductores durante las 6 Step Fermentation. Food Technol. Biotechnol, 43 (3): 235–239.
primeras horas, fue debido, al suministro de sustrato que se realizó cada 6. Steinhaus, M., Sinuco, D., Polster, J., Osorio, C., Schieberle, Peter.
hora durante este periodo. La formación de biomasa disminuyó por (2008). Characterization of the Aroma-Active Compounds in Pink
efectos de dilución, ocasionada a su vez por el suministro de sustrato. Al Guava (Psidiumguajava, L.) by Application of the Aroma Extract
finalizar la etapa de fermentación se presentaron diferencias Dilution Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56
estadísticamente significativas P < 0.05 entre los dos sustratos, tanto para (11): 4120–4127.
el consumo de sustrato, como para la formación de biomasa. 7. Elizalde, M.P., Hernández, V. (2009). Guava seed as an adsorbent and
as a precursor of carbon for the adsorption of acid dyes. Bioresource
9,00
Technology, 100: 2111–2117.
8,00
7,00 8. Kjeldah, J. (1883). Neue Methode zur Bestimmung der Stickstoffs in
Etanol (% v/v)

6,00 organischen Korpern. Z Anal Chem, 22: 366–382.


5,00 9. Millar, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for
4,00
3,00
determination of reducing sugar. Analyt. Chem, 31: 426–429.
2,00 10. SAS INSTITUTE INC. (1993). SAS user’s guide. Statistics, version
1,00 6.03 Edition. SAS Institute Inc., Cary, NC.
0,00 11. Echegaray, O.F., Carvalho, J.C.M., Fernandes, A.N.R., Sato, S.,
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Aquarone, E., Vitolo, M. (2000). Fed-batch culture of Sacchoromyces
Tiempo (h) cerevisiae in sugar-cane blackstrap molasses: invertase activity of
MUFA MHSG intact cells in ethanol fermentation. Biomass and Bioenergy, 19: 39–
Figura 3: Cinética de producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae 50.
(Ethanol Red), durante la etapa de fermentación, utilizando sustratos: 12. Kazuhiko, T. and Kozo, O. (1995). Factors Affecting the Ethanol
melaza más urea y fosfato diamónico (MUFA) y melaza más harina de Productivity of Yeast in Molasse. Journal of fermentation and
semilla de guayaba (MHSG). bioengineering, 9 (5): 449–452.
13. Turhan, I., Bialka, K.L., Demirci, A., Karhan, M. (2010). Ethanol
La producción de etanol (figura 3) mostró un comportamiento similar para production from carob extract by using Saccharomyces cerevisiae.
los dos sustratos, estos no presentaron diferencias estadísticamente Bioresource Technology, 101: 5290–5296.
significativas P > 0.05 a las 24 horas de fermentación, igual 14. Tang, Y., An M., Zhong, Y.L., Shigeru, M., Wu, X., Kida, K. (2010).
comportamiento se presentó en estudios realizados por Turhan et al. [13], Continuous ethanol fermentation from non-sulfuric acid-washed
quienes utilizaron extracto de levadura y extracto de algarroba con fuente molasses using traditional stirred tank reactors and the flocculating
de nitrógeno. Mientras que Tang et al. [14], reportan una concentración de yeast strain KF-7. Journal of Bioscience and Bioengineering, 109 (1):
etanol del 8.50 % a las 48 horas de fermentación utilizando melaza más 41–46.